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使用 ImageJ 对免疫组织化学处理组织的显微照片进行小胶质细胞形态定量分析

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DOI：

10.3791/57648

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2018年6月5日

 , 
1College of Nursing, University of Arizona

本文内容

摘要

小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，可通过形态学变化来监测并响应大脑生理状态的改变，这些形态变化可进行定量评估。本方案概述了一种基于 ImageJ 的分析方法，通过细胞分支化程度、复杂性和形态等指标，将小胶质细胞形态表征为连续性数据。

摘要

小胶质细胞是大脑中的吞噬细胞，参与维持大脑稳态，并持续监测其周围环境是否存在功能障碍、损伤或疾病。作为第一响应者，小胶质细胞在缓解神经元和胶质细胞功能障碍方面具有重要作用；在此过程中，它们会经历广泛的形态学变化。小胶质细胞的形态既可通过描述性方式进行分类，也可被量化为诸如细胞分支化程度、复杂性和形状等参数的连续变量。尽管现有的小胶质细胞量化方法多应用于单个细胞，但适用于整张显微照片中多个小胶质细胞分析的技术仍较少。本方法旨在利用广泛可得的ImageJ协议，实现对单个及多个细胞的量化分析。该方案总结了推荐使用的步骤及ImageJ插件，用于将荧光和明场显微图像转换为代表性的二值化图像和骨架化图像，并通过AnalyzeSkeleton（2D/3D）和FracLac等软件插件进行形态学数据采集分析。这些插件的输出结果可从突起末端、分支节点和长度，以及复杂性、细胞形状和尺寸参数等方面对细胞形态进行综合描述。本文所述的骨架分析方案特别适用于对整张显微图像或感兴趣区域（ROI）内多个小胶质细胞进行区域性分析，而FracLac则提供互补的单细胞分析。结合使用，该方案提供了一种客观、敏感且全面的评估工具，可用于区分健康与受损大脑中存在的不同类型小胶质细胞形态。

引言

小胶质细胞对脑生理状态的变化具有迅速且多样的形态学反应1，其反应谱系涵盖从高度分枝化和高度复杂的形态到去分枝化及阿米巴样形态的连续变化过程2。小胶质细胞还可能呈现极化状态或杆状形态3。小胶质细胞的分枝化通常定义为具有多个突起的复杂形态，常以每细胞的末端数量和细胞突起的长度来报告。由于小胶质细胞通过持续的细胞间串扰和体内运动性（in vivo motility）与神经元和胶质细胞功能紧密协调4,5，其形态特征可作为脑内多种细胞功能与功能障碍的指示标志。为了充分描述这些形态变化的多样性，并区分在细微生理扰动（如癫痫5,6和脑震荡7）以及显著损伤（如中风8）条件下分枝化细胞之间的差异，必须采用定量分析方法。越来越多地使用形态学定量分析7,8,9,10,11,12,13,14将揭示健康与疾病状态下小胶质细胞形态的全部多样性。本研究详细阐述了利用ImageJ插件逐步分析小胶质细胞形态的步骤，适用于免疫组织化学（IHC）后获取的固定啮齿类动物脑组织中小胶质细胞的荧光或非荧光显微图像。

本文所述分析技术的核心是 ImageJ 插件 AnalyzeSkeleton（2D/3D）15（2010 年开发，用于量化大型乳腺结构）和 FracLac16（2014 年开发，用于整合 ImageJ 与分形分析，以量化单个小胶质细胞的形态）。这些插件可对整张显微照片或显微照片中特定 ROI 内的多个小胶质细胞进行快速的小胶质细胞分支化分析。该分析可单独使用，也可与分形分析结合使用。单细胞分形分析（FracLac）需要投入一定时间，但可提供关于小胶质细胞复杂性、形态和大小的多种形态学输出结果。这两种工具的使用并不重复，因为细胞分支化与细胞复杂性互为补充，结合多个参数可用于区分数据集内不同小胶质细胞的形态12,17。

方案

所有实验均经亚利桑那大学机构动物照护与使用委员会批准，并遵循该委员会及美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物照护与使用的指南进行。实验过程中注意尽量减少动物的疼痛与不适。安乐死方法依据已批准的方案，即在异氟烷麻醉下进行颈椎脱位。

1. 组织制备

注意：对固定且经冷冻保护的组织样本进行小胶质细胞形态学分析，以保持细胞形态。以下为用于制备固定组织并直接切片以进行荧光免疫组化（IHC）的标准操作流程。

  1. 在完成所需实验后，按照标准实验室操作规程，从安乐死的动物体内取出小鼠或大鼠脑组织。将脑组织放入含有5 mL 4%多聚甲醛溶液的10 mL样品瓶中，于4 °C固定24小时。随后用缓冲液冲洗，并转移至5–10 mL含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M）中，于4 °C孵育72小时。在使用冷冻切片机进行切片前，将完整脑组织保存于-80 °C；若使用石蜡切片机切片，则可保存于4 °C。
    注意：本方案尚未在石蜡包埋组织切片上进行测试。
  2. 使用冷冻切片机或石蜡切片机将脑组织切成所需厚度和方向的切片，并将游离切片储存于冷冻保护液（50 mM PBS、乙二醇、甘油）中，置于-20 °C保存。
    注意：本方案已在厚度为50 µm至200 µm的冠状面组织切片上成功实施。厚度小于50 µm的切片可能无法完整显示小胶质细胞的突起结构，而过厚的切片则可能因抗体渗透不足导致免疫组化染色不完全。组织切片可采用冠状面或矢状面方向，具体选择应根据实验目的及目标脑区而定。

2. 免疫组织化学

注意：骨架分析和分形分析方法均可用于荧光免疫组化或3,3′-二氨基联苯胺（DAB）免疫组化。以下为标准的荧光免疫组化实验流程，可根据需要进行替换。与DAB免疫组化相比，荧光免疫组化可更优地显示细胞突起结构。

  1. 将组织切片放入4 mL玻璃小瓶中（每瓶最多可放15个鼠脑切片），加入1 mL含最多10%马血清、PBS（0.01 M）、0.5% Triton、0.04% NaN3 的溶液，在室温（23 °C）下孵育1 小时。
  2. 用PBS（0.01 M）在室温下洗涤5分钟，重复三次。
  3. 加入一抗（Iba1，1:1,000）溶液1 mL，在含PBS（0.01 M）、0.5% Triton、0.04% NaN3的溶液中于室温孵育72小时，并加盖（以维持NaN3 的有效性）。
  4. 用PBS（0.01 M）在室温下洗涤5分钟，重复三次。
  5. 加入二抗（抗兔488，1:250）溶液1 mL，在含PBS（0.01 M）、0.5% Triton、0.04% NaN3 的溶液中避光于室温孵育4小时。
  6. 用PBS（0.01 M）在室温下洗涤5分钟，重复三次。
  7. 将脑组织切片（数量和方向根据需要确定）贴附于载玻片上，滴加软封固介质至载玻片，然后将盖玻片覆盖在组织上。将载玻片置于4 °C保存。
    注：共聚焦成像需使用厚度为1.5的玻璃盖玻片。推荐使用软封固介质，因其高黏度不会压缩组织，与硬封固介质相比更能良好保持组织形态。

3. 成像

  1. 使用具有 z 轴层扫采集功能的明场或共聚焦显微镜，结合 20 倍或更高倍数的物镜，对脑组织切片中的 Iba1 阳性细胞进行成像。
    注意：实验中所有显微照片的采集应保持成像参数和软件设置一致。使用 40 倍或 63 倍物镜可获得极佳的突起细节。本文所述的骨架化分析方案可应用于整张显微图像，或大图像中的多细胞感兴趣区域（ROI）。
    1. 使用与显微镜软件相匹配的适当软件设置，采集 8 位图像。
      注意：采集后将文件转换为 8 位可能会扭曲数据采集结果。
    2. 使用与显微镜软件相匹配的适当软件设置，采集至少 30 µm 厚的 z 轴层扫图像，图像间间隔不超过 2 µm。
      注意：显微镜及软件应支持在 X、Y 和 Z 轴方向上进行图像采集。可增加 z 轴层扫厚度并减小层间间隔，以获得更详细的微胶质细胞结构信息，但会相应延长成像时间。在荧光显微镜成像中应尽可能采用奈奎斯特采样定理进行采样。
  2. 将所有文件保存为 Tif 格式，或根据显微镜软件要求的格式保存。
  3. 在 ImageJ 中打开 Tif 文件，使用工具栏通过点击 图像 | 颜色 | 拆分通道 分离通道，并在适当时通过点击 图像 | 图像堆栈 | X 投影 | 最大强度投影 进行图像堆栈合并。保存为 .tif 文件。

4. 骨架分析

  1. 从 <https://imagej.net/Fiji/Downloads> 下载 FIJI 或 ImageJ。对于各个插件，请从 <http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 下载 AnalyzeSkeleton(2D/3D)，并从 <https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16 下载 FracLac。
    注意：将显微照片转换为二值化骨架图像的整个过程耗时少于 1 分钟。
  2. 若使用荧光显微照片，请确保图像为 8 位，并将其转换为灰度图像以最佳显示所有阳性染色。使用工具栏并点击 图像 | 查找表 | 灰度。若使用 DAB 明场照片，首先使用 FFT 带通滤波插件（通过工具栏点击 处理 | FFT | 带通滤波），然后转换为灰度图像。
    注意：对于本实验方案，ImageJ 中 FFT 带通滤波器的默认设置已足够（滤波上限为 3 像素，下限为 40，无条纹抑制）。应用 FFT 带通滤波可去除噪声（小特征），同时保留图像的整体大尺度结构。这在明场图像中尤其有用，因为组织中的裂隙和裂缝可能表现为背景，从而干扰骨架分析18。
  3. 如果图像过暗导致小胶质细胞突起无法清晰观察，需调整亮度和对比度。使用工具栏并点击 图像 | 调整 | 亮度/对比度。根据需要调整最小值或最大值滑块，但不得超过直方图边缘。
    注意：在 ImageJ 中，亮度和对比度通过更新图像的查找表（LUT）来改变，因此像素值保持不变。最小值和最大值滑块控制显示范围的上下限，像素值高于 255 的显示为白色，低于 0 的显示为黑色18。对于荧光显微照片，应使用最大值滑块；而对于 DAB 染色小胶质细胞的显微照片，则应使用最小值滑块。
  4. 使用工具栏点击 处理 | 滤波 | 非锐化掩模，运行非锐化掩模滤波器以进一步增强对比度。对于本实验方案，采用 ImageJ 的默认设置（像素半径为 3，掩模权重为 0.6）。
    注意：非锐化掩模通过从原始图像中减去一个模糊版本（即非锐化掩模），再将结果与原始图像的高对比度版本合并，从而锐化并增强图像的边缘特征。因此，非锐化掩模滤波器不会生成新的细节，而是使图像中已有的细节更加清晰。半径设置决定了非锐化掩模的模糊程度（即去除多少模糊），掩模权重设置则决定非锐化掩模与图像合并时的对比度程度（从而调节最终图像的对比度）。
  5. 执行去斑点步骤以去除非锐化掩模产生的椒盐噪声。使用工具栏并点击 处理 | 噪声 | 去斑点。
    注意：去斑点通过将每个像素替换为其 3 × 3 邻域内的中值来去除椒盐噪声。其效果是将强度异常值替换为中值像素，同时不影响边缘的锐利度18。
  6. 使用工具栏点击 图像 | 调整 | 阈值，将图像转换为二值图像。
    注意：阈值化将灰度图像分为目标特征与背景两部分，并将图像转换为二值图像18。
  7. 应用去斑点、闭合和去除异常值功能：在生成的二值图像中，可能存在单像素背景噪声以及突起之间的间隙。
    1. 使用工具栏点击 处理 | 噪声 | 去斑点，应用去斑点功能。
      注意：对二值图像应用去斑点可去除任何残留的单像素噪声。
    2. 使用工具栏点击 处理 | 二值 | 关闭，应用闭合功能。
      注意：该插件会在两个暗像素相距不超过 2 像素时将其连接。
    3. 使用工具栏点击 处理 | 噪声 | 去除异常值，应用去除异常值功能。
      注意：对于本实验方案，针对亮异常值设置像素半径为 2，阈值为 50。该插件会将偏离周围区域中值超过特定值（即阈值）的亮或暗异常像素替换为周围区域的中值像素18。
  8. 将图像另存为独立文件以供将来使用和/或分形分析，并使用工具栏点击 处理 | 二值 | 骨架化 对图像进行骨架化。
  9. 选择骨架化图像，使用工具栏点击 插件 | 骨架 | 分析骨架，运行 AnalyzeSkeleton(2D/3D) 插件，并勾选“分支信息”框。
    注意：图像处理过程可能需要根据实际情况增加或删除上述建议步骤以优化结果。在此过程中，可通过创建骨架与原始图像的叠加图来评估骨架化图像的准确性。细胞体应为单一的起始点，突起从中心发出；圆形的细胞体会干扰数据分析，应通过调整实验方案予以避免。单一起源点与圆形细胞体的示例如 图 1 所示。

导致骨骼样本不具代表性的常见问题及建议解决方案：

  • 图像过暗：转换为灰度图，调整亮度/对比度滑块，和/或应用反锐化掩模
  • 背景过强：调整亮度/对比度滑块，应用去斑点滤波，和/或去除异常值
  • 骨架化图像中胞体呈圆形（特别是荧光图像）：应用FFT带通滤波器，和/或反锐化掩模
  • 组织出现裂纹（特别是明场图像）：应用FFT带通滤波器，和/或去斑点滤波
  1. 将“结果”和“分支信息”输出中的所有数据复制，并粘贴到 Excel 电子表格中。
  2. 在 Excel 中裁剪数据，以去除由免疫组化和图像采集产生的骨架碎片。
    1. 复制包含骨骼分析原始数据输出的实验工作簿，并在文件名中添加 TRIM。所有后续的数据修剪操作均应在复制的工作簿中进行，以保留原始数据，便于日后使用和参考。
    2. 打开 ImageJ 中的骨架化图像，选择直线工具，测量多个片段并记录其平均长度，以确定需从数据集中修剪的片段长度的截断值。
      注意：本文所呈现数据的分析中，非目标片段的截断长度设定为0.5。该值应在整个数据集中保持一致。
    3. 在 Excel 电子表格中通过点击自定义排序 排序 & 滤镜 | 自定义排序. 按……排序 "终点体素" 从大到小，并在新的层级上按 "Mx 分支点" 从大到小。
    4. 移除所有包含两个端点且最大分支长度小于截断值的行 即将终点列中的数据相加，以计算从图像中收集的终点总数。
    5. 重复分支信息数据的操作：按“branch length”从大到小排序。滚动查看数据，删除所有分支长度小于截断值的行。即将分支长度列中的数值相加，计算从图像中获取的所有分支的总长度。
    6. 对每张图像/表格重复步骤 4.11.3–4.11.5，直至所有数据均被裁剪并求和。
    7. 将每张图像的数据（末端总数和分支总长度）除以相应图像中 microglia 细胞体的数量。输入最终数据（末端数/细胞） & 分支长度/细胞）输入统计软件。
      注意：分支总长度/细胞数据可能需要将像素长度转换为微米。

5. 分形分析

注意：FracLac 能够执行多种不同的形态学分析，本实验方案未涵盖这些分析。有关 FracLac 各项功能的更详细说明，请参见其使用手册：<https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> 及相关参考文献2,16,19。分形分析采用上述步骤 4.1–4.7 所述的实验流程。

  1. 确定将用于所有分形分析的感兴趣区域（ROI）的大小。使用矩形工具绘制 ROI。确保该区域足够大，能够完整捕获整个细胞，并在整个数据集中保持一致。
    注意：应使用矩形选区而非手绘选区，以确保所有 ROI 均为相同尺寸的矩形，从而使细胞具有相同的尺度。若使用手绘选区则无法保证一致性，因为 ImageJ 会自动调整方形 ROI 以适应不同大小的矩形窗口，导致细胞尺度不一。尽管分形形状本身具有尺度无关性，但使用 ImageJ 的 FracLac 插件进行分形分析的过程依赖于尺度16。因此，在数据采集过程中必须保持 ROI 尺寸的一致性。
  2. 在每张显微照片及其对应的二值图像中随机选择小胶质细胞进行分形分析。在 ROI 管理器窗口中，点击 Update 以将 ROI 锁定在细胞位置上。使用 Ctrl + Shift + D 快捷键将 ROI 内的区域复制为新窗口，然后保存裁剪后的细胞图像。在对应的二值图像（来自骨架分析）中，利用 ROI 管理器复制包含相同细胞的区域。重复此过程，直至随机选取足够数量的细胞用于分形分析，并保存所有文件。
    注意：可使用随机数生成器和编号网格来实现细胞的随机选取。
  3. 打开包含单个细胞的二值图像。双击画笔工具，将颜色设置为黑色，并根据需要调整画笔宽度。以对应的显微照片为参考，使用画笔工具去除邻近细胞的突起、连接断裂的突起，并分离出目标细胞。完成二值化细胞的隔离后，保存该二值文件。
    注意：按住 'alt' 键可将画笔颜色从前景色（黑色）切换为背景色（白色）。
  4. 通过工具栏中的 Process | Binary | Outline 菜单命令，将二值化细胞转换为轮廓图像。
    注意：ImageJ 的 FracLac 插件可用于实心形状或形状轮廓，但当前惯例推荐使用形状轮廓16。
  5. 在工具栏中，点击 Plugins | Fractal Analysis | FracLac 打开 FracLac 插件，选择 BC (box counting) 模式。在 Grid Design 设置中，将 Num G 设为 4。在 Graphics 选项下，勾选 Metrics 框，以分析细胞的凸包（convex hull）和边界圆（bounding circle）。设置完成后，点击 OK。
    注意：Num G 表示扫描过程中使用的盒计数网格方向数量，推荐范围为 4–12。Num G 的设置及其推荐范围在 FracLac 使用手册中有详细说明16。增加 Num G 会显著延长计算时间。FracLac 的参数设置在每次会话中仅需配置一次。参数输入完成后，“Scan”按钮将变为可用状态。
  6. 点击 Scan 按钮，对选定图像执行盒计数扫描。
    注意：扫描将生成三个数据输出窗口：Hull and Circle Results（凸包与圆结果）、Box Count Summary File（盒计数汇总文件）和 Scan Types（扫描类型）。Scan Types 窗口包含所用参数设置的日志以及某些测量值的标准差。本实验方案中不使用 Scan Types 窗口，可关闭或保存以供后续参考。
  7. 在 Hull 和 Circle Results 窗口中，复制所有所需数据结果（例如，密度、跨度比和圆形度）。在 Box Count Summary 窗口中，复制所需数据结果（例如，分形维度和空隙度）。将复制的数据转移至 Excel 文件或统计软件中进行后续分析。
    注意：FracLac 输出数据的完整列表及其详细解释见 ImageJ 的 FracLac 使用手册16。

结果

本文所述的小胶质细胞形态学分析方案总结了处理荧光和DAB显微照片以进行形态测量分析的有用步骤。这些步骤在图2和 图3中以图示方式进行了总结。这些步骤的目标是生成一幅能够恰当反映原始显微照片特征的代表性二值化和骨架化图像，以确保所积累的数据具有有效性。在应用该方案后，AnalyzeSkeleton插件将生成一幅带有标签的骨架图像，从中可从输出结果文件中汇总端点数量和分支（即，突起）长度。端点和突起长度数据随后用于估算显微照片或感兴趣区域（ROI）中小胶质细胞分支化的程度。图4总结了应用与未应用该方案所获得的结果数据（每个细胞的端点数和每个细胞的突起长度）。尽管趋势相似，图4F中汇总的数据比图4E中的数据变异性更小。 此外，这些数据表明，在应用该方案后，检测组间差异的敏感性有所提高。最后，必须注意该方案在不同使用者之间应用时可能存在的操作差异。这种差异由图5加以说明，其中同一数据集由两位独立的操作者按照上述相同的方案进行分析。

在实验流程应用过程中，从生成的二值图像中分离出单个细胞，并收集额外的形态学数据。分析小胶质细胞形态的实验步骤，包括使用 FracLac 插件前的准备流程，总结如下 图6. 我们在未损伤的（图6A）和损伤的（图6B）组织。展示了应用与未应用该方案时，每种细胞的二值化、轮廓、凸包/包络圆及盒计数分析的代表性图像。 图6C-F. 这些图像有助于说明形态学数据差异的来源，这些差异总结于 图 6G.

小胶质细胞形态示意图及重叠图，显示圆形胞体与单一起源胞体结构的对比。
图 1. 骨架化小胶质细胞的示意图，展示具有圆形胞体（次优）与单一起源胞体（最优）的结构，以及骨架化细胞与原始显微照片的对应重叠图。 比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图像处理工作流程：神经元分析；步骤包括灰度化、二值化、去斑点。
图 2. 荧光显微照片的应用流程。 骨架分析流程应用于单细胞荧光显微照片的示意图，裁剪以显示细节。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示FFT滤波、灰度转换、二值化等步骤的图像处理流程图
图3. 明场DAB显微照片的实验方案应用。 将骨架分析方案应用于一张明场DAB显微照片的示意图，图中单个细胞被裁剪以显示细节。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

神经突起分析：显微镜图像、示意图和柱状图比较不同方案的效果。
图4. 应用与未应用该方案时的数据分析。 （A）荧光免疫组化染色的显微照片示例及对应于（B）中黄色框区域的细胞裁剪图。应用（C）与未应用（D）所述方案处理后的二值化图像与骨架化图像示例。在未损伤（白色）和损伤（灰色）皮质组织中，每个细胞的小胶质细胞终点数和每个细胞的突起长度的汇总数据，分别对应应用（E）与未应用（F）该方案的情况。统计分析采用学生t检验，n = 3，**表示 p < 0.01。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

神经元图像处理；二值化与骨架分析；显微成像与统计数据分析。
图5. 不同用户在应用本方案时的结果差异。 显示原始图像经用户1和用户2分别处理后转化为二值图像和骨架图像的示例。两图像之间的差异以相同颜色的圆圈标出。用户1和用户2对未损伤与损伤脑区的小胶质细胞终点数/细胞及突起长度/细胞数据的汇总图。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），样本量 n = 3；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看本图的放大版本。

显微图像；损伤与未损伤神经细胞；密度与圆形度分析；示意图。
图6. 应用与未应用本方案的分形分析。 显示未损伤（A）和损伤（B）皮层中小胶质细胞裁剪后的显微照片示例，以及应用或未应用本方案后得到的相应二值图像（C）和轮廓图像（D）。对应的轮廓形状（E）所对应的凸包（蓝色）和包围圆（粉色）用于计算形状密度、跨度比和圆形度（G）。盒计数法在（F）中进行了图示，并用于分形维数（DB）和空隙度（λ）的计算（G）。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

小胶质细胞对其微环境中的生理和病理状态具有高度敏感性，并在轻微7，14和显著损伤8条件下均表现出多样化的形态特征2。ImageJ 操作流程的使用使所有实验室均可实现小胶质细胞形态的定量分析，因为该平台及其插件为开源图像处理软件。尽管本方案主要聚焦于利用该软件进行图像处理与分析，但数据采集的一致性、有效性与可靠性仍首先依赖于高质量的免疫组织化学（IHC）染色和显微成像。本方案可用于优化整张显微照片及单个细胞的二值化、骨架化和轮廓化表征，但无法弥补因IHC染色或显微成像质量差而导致的低对比度、模糊或失真图像。此外还需注意，在切片前的储存过程中应避免压平脑组织，否则将不可逆地改变小胶质细胞的形态。最后，在同一项实验中，必须使用相同的放大倍数和同一台显微镜对小胶质细胞进行成像。不同显微镜在仪器、物镜和软件方面存在差异，即使使用相似的物镜，也可能导致显微图像尺寸不同，从而影响图像细节以及每帧视野中的细胞数量。例如，使用Leica SPII显微镜配备40X物镜采集图像时，所获得的细胞数量是使用Zeiss 880显微镜采集时的两倍，但细节更少。这一点对于从整帧图像而非单个细胞获取的细胞分支化数据尤为重要，因为它直接关系到数据采样的代表性问题。

通常，骨架分析会先于单细胞分形分析进行，原因有两点。与单细胞分形分析相比，对整张显微照片中所有细胞的分支情况进行分析速度较快，若时间有限，可将其视为一种筛选工具。此外，骨架分析过程中生成的二值图像将用于后续的分形分析。成像完成后，存在多个关键步骤可能影响骨架分析结果并引入操作者主观因素。其中，不同操作者之间差异最大的步骤是步骤4.2（增加图像亮度）和步骤4.5（确定阈值）。在条件允许的情况下，应确定一个最佳的亮度增加值（亮度滑块在0-255范围内的最大值或最小值），并在所有图像和所有操作者中保持一致。当图像间差异较大时，操作者也可根据具体情况选择在不同图像间调整亮度值。或者，若图像本身较亮且对比度较高，则可省略增加亮度的步骤，并通过使用特定的阈值滤波器（例如，Huang法）而非可变性较大的默认方法来实现阈值的标准化。一旦参数优化完成，应严格遵循所确定的参数，以尽量减少额外的操作者主观影响。

用户间差异的一个示例见图5。用户1的数据值高于用户2，因此若用户1和用户2共同参与数据采集，则变异性会增加。用户1与用户2在二值化图像和骨架化图像上的差异以彩色圆圈标出（图5）。在此情况下，两名用户均为接受过短暂培训的本科生，对小胶质细胞的专业知识有限。由小胶质细胞领域专家进行定期监督和指导，并加强实验方案培训2，可降低用户间变异性。尽管本研究未对此进行评估，但分形分析受用户间变异性影响较小，因为该方法通过手动逐个从显微照片中分离二值化细胞，而非完全依赖阈值设定来确定小胶质细胞形态。然而，所有方法在不同用户之间均存在一定变异性。因此，建议由单一用户（理想情况下应接受过小胶质细胞相关专业培训）完成整套数据集的数据采集工作。

可根据图像质量以及降低噪声和确保过程连通性所采取的措施，对此方案进行其他简便的修改。例如，若对比度已足够，则无需使用反卷积锐化（unsharp mask），可将其省略。在采集整套数据之前，建议先针对特定的一组图像（包括实验组和对照组）优化并确定最终的方案。最后，可使用其他插件替代本方案中未提及的插件，以增强图像清晰度或锐化效果，例如“膨胀”（dilate）或“锐化”（sharpen）插件。

该方案的优点在于其普遍适用性和可适应性。此外，使用 AnalyzeSkeleton 评估细胞分支情况具有快速、可应用于整张显微照片的特点。多细胞分析方法的优势在于关注的是整个区域而非单个细胞，因此可以快速评估图像中所有小胶质细胞的平均分支程度（以末端数量和突起长度为指标）。骨架分析能够对多个细胞进行分析，在细胞数量的数据采样方面，这是分形分析难以企及的，因为分形分析需要耗费大量时间从显微照片中分离单个细胞。该方法最适用的场景之一是筛查局灶性损伤附近的小胶质细胞形态。一个局限性在于，与耗时更长的单细胞方法相比，对整幅视野图像进行渲染以生成免疫组化显微照片的骨架模型效果尚不完善。此外，当同一视野内小胶质细胞形态存在显著差异时，区域分析方法并不适用。最后，该分析方法依赖于细胞计数，而这一参数可能在不同实验条件下存在差异。

分形分析针对单个细胞进行，因此可补充由骨架分析所得的平均细胞分支化数据。尽管该分析更为耗时，但这一投入能够获得广泛的形态计量学数据。例如，细胞密度、跨度比和圆形度数据分别描述细胞轮廓的大小、伸长程度和形状。分形维度和孔隙度分别概括了细胞的复杂性和形状异质性。每个参数的计算方法以及数据解读方式的更深入说明详见交互式手册16，相关细节应结合具体的研究问题加以考虑。本方案所提供的工具可灵敏地量化生理和病理条件下小胶质细胞二维形态可能发生的细微变化。若构建三维结构，还可进行其他形态计量分析，如实心度、凸度和形态因子16,20。

方案的开发与优化是一个持续且以用户需求为导向的过程。该方法已从荧光8扩展至DAB/明场图像7，但尚未应用于石蜡包埋组织。此外，该方案可与Imaris等专有软件结合使用，以进行进一步分析。本方案适用于多种生理研究，不仅限于小胶质细胞，也可应用于任何可通过免疫组织化学方法识别出特定形态或结构特征的细胞或组织。最后，当样本量足够时，可采用多变量分析或聚类分析，根据形态学特征对小胶质细胞进行分层12,21；这一信息具有重要意义，因为小胶质细胞的形态是其功能及其对周围环境反应的关键指标。目前，人们对小胶质细胞形态多样性的认识正在不断深入，全面理解健康与疾病状态下神经元-胶质细胞-血管之间的相互作用至关重要。该领域的进展得益于设计完善、操作简便且可重复的定量分析方案，这些方案能够利用多个连续变量对小胶质细胞形态进行量化与总结。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了美国国家护理研究所（NINR，项目编号：F32NR013611）的资金支持。我们谨进一步致谢并感谢 AnalyzeSkeleton(2D/3D) 和 FracLac（Arganda-Carreras 等 和 Karperien 等，否则本文所述的分析将无法实现。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一抗 anti-IBA1Wako 019-19741兔源
Vectashield 软封片剂Vector LabsH-1000
二抗Jackson Immunoresearch711-545-152驴源
4 mL 玻璃小瓶WheatonUX-08923-11
Triton X-100Fisher Scientific BP151
叠氮化钠 (NaN3)SigmaS-8032
玻璃盖玻片Fisher Scientific 12-544-G

参考文献

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