三维人体免疫细胞可视化的光片显微术

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以可视化的免疫细胞嵌入在三维 (3D) 胶原基质中使用光片显微镜。该协议还阐述了如何在3D 中跟踪单元迁移。该协议可用于3D 矩阵中其他类型的悬浮单元。

Abstract

在体内, 免疫细胞的活化、增殖和功能都发生在三维 (3D) 环境中, 例如在淋巴结或组织中。迄今为止, 大多数体外系统依赖于二维 (2D) 表面, 如细胞培养板或盖玻片。为了最佳地模拟体外生理条件, 我们利用一个简单的3D 胶原基质。胶原蛋白是细胞外基质 (ECM) 的主要成分之一, 被广泛用于构成3D 矩阵。对于3D 成像, 最近开发的光片显微技术 (也称为单平面光照显微镜) 具有采集速度快、穿透深度大、漂白低、photocytotoxicity 等特点。此外, 光片显微镜对长期测量特别有利。在这里, 我们描述了一个优化的协议如何建立和处理人类免疫细胞,例如, 在3D 胶原基质中的主要人细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和自然杀伤细胞 (NK), 用于活细胞成像的光片显微镜和固定样本。给出了图像采集和细胞迁移分析的步骤。特别着重强调了取样准备和数据分析的关键步骤和因素。该协议可用于其他类型的悬浮细胞在3D 胶原基质和不限于免疫细胞。

Introduction

大多数关于迁移细胞的知识来自2D 实验^1,2,3, 通常是在玻璃或塑料表面进行的一种文化/成像皿。然而, 在大多数情况下, 生理场景需要3D 微环境, 其中胞外基质 (ECM) 起决定性作用。ECM 不仅提供了维持适当细胞形态所必需的3D 结构, 而且还为许多细胞^4、5的最佳功能提供了生存信号或方向性提示。因此, 需要一个3D 的环境来更好地识别细胞的功能和行为在一个更好地反映生理环境的环境中。

在人体内, 大多数细胞特别是免疫细胞, 在3D 的情况下发挥作用。例如, 活化 t 细胞巡视组织寻找靶细胞, 天真的 t 细胞通过淋巴结迁移, 寻找其同源抗原呈现细胞, 在此期间, 迁移模式和机械适应相应的胞外环境^3,6,7。3D 胶原凝胶已被广泛应用为一种成熟、特征良好的3D 细胞培养系统,^8、

Protocol

为这项研究进行的研究与人的材料 (白细胞减少系统房间从人血液捐赠者) 由地方道德委员会授权 (声明从 16.4. 2015 (84/15;Rettig 博士教授)), 并遵循相应的指导方针。

1. 中性胶原蛋白溶液的制备 (500 µL)

1. 将400µL 冷冻胶原蛋白溶液 (10.4 毫克/毫升) 转移到细胞培养罩下的无菌1.5 毫升管。慢慢加入50µL 冷冻 10x PBS (pH 7.0-7.3) 到400µL 的冷冻胶原蛋白溶液。通过轻轻地平铺管子来混合溶液。
   注意: 1 部分的所有步骤都应该在细胞培养罩下完成。
2. 添加8µL 0.1 米氢氧化钠成500µL 胶原溶液从1.1。将 pH 值调整为 7.2-7.6。使用 ph 值测试条 (ph 范围: 6-10) 来确定混合物的酸碱度。
   注: 不同批次胶原蛋白的体积可能有所不同。氢氧化钠溶液必须缓慢混合以避免气泡。该混合物应保持在冰上, 以避免胶原凝胶。
3. 添加2µL 的无菌 ddH₂O 使最终体积为500µL. 拌匀, 并将此胶原蛋白溶液 (8.32 毫克/毫升) 储存在冰上或在4°c, 直到进一步使用。
   注: 在这种情况下, 中性胶原蛋白可用于24小时整除数不建议避免气泡。

2. 用毛细血管制备光片荧光显微镜样品

1. 荧光用所需的主要荧光染料<....

Results

T 细胞移出过程中的突起形成是一个高度动态的过程, 是肌动蛋白依赖。为了可视化第一人 ctl 的突起形成, 我们瞬时转染了 mEGFP 融合蛋白, 以标记在 CTL 的肌动蛋白细胞骨架, 如前所述¹¹。在转染后的某一天, 细胞被嵌入胶原基质中。图像栈是每四十年代获得的步骤大小1µm 在37°c 使用光片显微镜。如图 2A和辅助电影 1, 在迁移过程中, 人类 CTL 形成柠檬形的主要突起, 流苏状的细纺锤状结构。在这里所示的实验中, 不仅有一个单一的细胞被成像, 而且是一个大的体积 (450 x 450 x 538 µm³) (图 2B)。因此, 在这里显示的光学质量和分辨率是以低放大目标 (20X/1.0 DIC 为 IR) 获得的。因此, 通过更高的 NA 目标, 可以进一步改善该决议。

Discussion

大多数的体外检测是在2D 表面进行的, 例如细胞培养板、培养皿或盖玻片, 而在体内细胞, 特别是免疫细胞中, 大多经历了3D 微环境。新出现的证据显示, 免疫细胞的迁移模式在2D 和3D 方案¹⁷之间有所不同。此外, 肿瘤细胞的表达谱也不同于2D 和 3 d 培养组织^18,19,20。因此, 为了更好地模拟体外生理条件, 在3D 环境下进行实验, 例如3D 胶原基质, 具有很大的优越性。新开发的方法, 特别是光片荧光显微镜, 在受控环境条件下, 能够在3D 矩阵系统中进行可靠和可重复的实验。

与传统的激光扫描共焦显微术, 照亮整个探头, 与光片显微镜, 只有一薄的激光光被产生照亮样品。检测摄像头与照明平面垂直。由于这种技术, 只有在焦平面上的部分暴露在激光。因此, 可以将光漂白和毒性最小化。此外,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol，牛胶原蛋白溶液	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	胶原蛋白基质
0.5 M NaOH 溶液	Merck	1091381000	用于中和 Fibricol 溶液
超低熔点琼脂糖	Affymetrix	32821-10GM	低 c[Col]
Dynabeads 未接触的人 CD8 T 细胞试剂盒中的	Thermo Fisher	11348D	从 PBMC Dynabeads 人 T 活化剂 CD3/CD28 中分离原代人 CD8+ T 细胞
用于 T 细胞扩增和活化	Thermo Fisher	11132D	激活 CTL 群体
重组白细胞介素-2	Thermo Fisher	PHC0023	培养的 CTL
P3 初级溶液试剂盒	Lonza	V4XP-30XX	转染
α-PFN1 抗体，兔，IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 鬼笔环肽	Thermo Fisher	A22284
IF CellMask Orange 质膜染色	Thermo Fisher	C10045	荧光细胞标记
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水	Thermo Fisher	14190250	IF
血清白蛋白	Sigma	A9418-100G	IF
山羊和阿尔法;兔 568，IgG，兔	默飞世尔	A-11011	IF
光片 Z.1（光片显微镜）	蔡司	N.A.
细胞培养罩	Thermo Fisher	HeraSafe KS
细胞培养箱 HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
离心机 5418 和 5452	Eppendorf	N.A.
	Eppendorf	3123000039、 3123000020 3123000063
移液器吸头	VWR	89079-444、89079-436、89079-452
15 mL 管	Sarstedt	62.554.002
毛细管 50 &微量;L	VWR（品牌）	613-3373	蔡司 LSFM 样品制备
细管柱塞	VWR（品牌）	BRND701934	"带特氟龙尖端的邮票" LSFM 样品制备
MColorPhast pH stips	默克	1095430001	测试中和 Fibricol
BD Plastipak 1mL 注射器	BD	Z230723 ALDRICH	替代样品制备
造型粘土 （Hasbro Play-Doh A5417EU7）	Play-Doh	N.A.
Imaris 文件转换器	Bitplane	可在 http：//www.bitplane.com	将成像文件转换为 Imaris 文件格式
Imaris 8.1.2 （MeasurementPro， Track， Vantage）	位平面	可在 http：//www.bitplane.com	3D 和 4D 成像数据分析