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方法文章

光片显微镜用于人免疫细胞的三维可视化

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DOI：

10.3791/57651

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2018年6月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用光片显微镜对嵌入三维（3D）胶原基质中的免疫细胞进行可视化观察的实验方案。该方案还详细阐述了如何在三维环境中追踪细胞迁移过程。此方法同样适用于其他类型的悬浮细胞在三维基质中的研究。

摘要

体内，免疫细胞的活化、增殖和功能发挥均发生在三维（3D）环境中，例如淋巴结或组织中。迄今为止，大多数 体外 系统依赖于二维（2D）表面，例如细胞培养板或盖玻片。为更充分地模拟生理条件 体外我们采用一种简单的三维胶原基质。胶原是细胞外基质（ECM）的主要成分之一，已被广泛用于构建三维基质。对于三维成像，近年来发展的光片显微技术（也称为单平面照明显微技术）具有高采集速度、大穿透深度、低光漂白和低光细胞毒性等优点。此外，光片显微技术特别适用于长期观测。本文描述了一种优化的实验方案，用于建立和处理人免疫细胞， 例如 在3D胶原蛋白基质中培养原代人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞，用于光片显微镜对活细胞成像及固定样本的观察。本文介绍了细胞迁移的图像采集与分析流程，重点强调了样本制备和数据分析中的关键步骤与影响因素。该方案也可适用于其他类型的悬浮细胞在3D胶原蛋白基质中的研究，不仅限于免疫细胞。

引言

目前关于迁移细胞的大多数知识均来自二维实验1,2,3，这些实验通常在培养皿或成像皿的玻璃或塑料表面进行。然而，在大多数生理情况下，细胞需要三维微环境，其中细胞外基质（ECM）起着决定性作用。ECM不仅提供了维持细胞正常形态所必需的三维结构，还为多种细胞的正常功能提供生存信号或方向性引导4,5。因此，需要在更接近生理条件的三维环境中研究细胞，以更准确地识别其功能和行为。

在人体内，大多数细胞尤其是免疫细胞，其功能发挥通常处于三维环境之中。例如，活化的T细胞在组织中巡逻以寻找靶细胞，而初始T细胞则迁移穿过淋巴结以寻找相应的抗原呈递细胞，在此过程中，其迁移模式和迁移机制会适应相应的细胞外环境3,6,7。三维胶原凝胶已被广泛用作一种成熟且特征明确的三维细胞培养系统8,9,10。我们先前的研究表明，原代人淋巴细胞具有高度移动性，在0.25%的胶原基质中平均迁移速度约为4.8 µm/min11。细胞骨架的重排在细胞迁移过程中起着关键作用12。越来越多的证据表明，淋巴细胞并非仅采用单一的迁移模式，而是能够根据位置、微环境、细胞因子、趋化梯度以及细胞外信号的不同，以多种方式调节其迁移行为，从而在不同条件下切换迁移模式3。

为了可靠地分析免疫细胞的功能和行为（例如迁移、突起形成或囊泡运输），能够以快速且可靠的方式获取相对大体积的三维图像具有显著优势。对于三维成像，近年来发展的光片显微技术（也称为单平面照明显微技术）提供了一个令人满意的解决方案13,14。在图像采集过程中，通过生成一束薄而稳定的光片来照射样品。这种方式可在焦平面上同时照亮较大区域，而不会影响焦平面外的细胞。该特性使得成像速度显著提高，同时极大减少了光漂白和光细胞毒性。本文中，我们描述了如何利用光片显微技术对原代人免疫细胞进行可视化，以及如何在三维环境中分析其迁移行为。

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方案

本研究中使用的人体材料（来自献血者的白细胞去除系统腔室）已获得当地伦理委员会批准（2015年4月16日声明（84/15；Prof. Dr. Rettig-Stürmer）），并遵循相应的指导原则。

1. 中和胶原蛋白溶液的制备（500 µL）

  1. 在细胞培养操作台内，将400 µL预冷的胶原蛋白储备液（10.4 mg/mL）转移至无菌的1.5 mL离心管中。缓慢加入50 µL预冷的10倍浓度PBS缓冲液（pH 7.0 - 7.3）至400 µL预冷的胶原蛋白储备液中。通过轻轻倾斜离心管的方式混匀溶液。
    注意：第1部分的所有操作均应在细胞培养操作台内进行。
  2. 向步骤1.1中得到的500 µL胶原蛋白溶液中加入8 µL的0.1 M NaOH，以调节pH至7.2–7.6。使用pH试纸（pH范围：6–10）测定混合液的pH值。
    注意：不同批次的胶原蛋白所需体积可能有所不同。NaOH溶液必须缓慢混合，以避免产生气泡。混合过程中应将溶液置于冰上，防止胶原蛋白发生凝胶化。
  3. 加入2 µL无菌ddH2O，使终体积达到500 µL。充分混匀后，将此胶原蛋白溶液（8.32 mg/mL）置于冰上或4 °C保存，待后续使用。
    注意：在此条件下，中和后的胶原蛋白可在24小时内使用。不建议分装，以避免引入气泡。

2. 使用毛细管进行光片荧光显微镜成像的样品制备

  1. 按照先前所述方法，使用所需的初级荧光染料15或荧光蛋白11对目标活细胞进行荧光标记。
  2. 在细胞培养罩内，将1 × 106个细胞转移至无菌的1.5 mL离心管中。以200 × g离心8分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL培养基中。
    注意：建议细胞密度为5 × 106个细胞/mL，以便观察人免疫细胞迁移，尤其是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞。
  3. 将步骤1.3中制备的中和胶原溶液85.9 µL加入步骤2.2的细胞悬液中，充分混匀，使胶原终浓度达到2.5 mg/mL。将细胞/胶原混合物置于冰上，放置在罩内。
    注意：若所需胶原浓度为N mg/mL，则中和胶原溶液的体积（用于200 µL细胞悬液）= 200 × N/(8.32 - N)
  4. 随后，将匹配的推杆插入毛细管（内径约1 mm），直至推杆从毛细管末端伸出1 mm。将推杆浸入培养基中润湿 （图1A）。
    注意：此步骤有助于防止毛细管插入细胞/胶原混合物时产生气泡。毛细管和推杆无需无菌。
  5. 将毛细管插入步骤2.3制备的细胞/胶原混合物中，缓慢向后拉动推杆10– 20 mm（图1B）。用70%乙醇喷雾润湿的纸巾擦拭毛细管外壁，以去除残留的胶原溶液。
  6. 用建模黏土将毛细管 固定在5 mL离心管内壁上，并将细胞/胶原混合物推至毛细管末端 （图1C）。
  7. 将毛细管置于37 °C、5% CO2环境中孵育1小时，以完成胶原聚合。
  8. 向5 mL离心管中加入培养基（约1–2 mL）。小心地将聚合后的胶原柱压出，使其约3/4部分悬于培养基中（图1D）。
  9. 将毛细管保持在此状态下，在37 °C、5% CO2环境中继续孵育30分钟，使胶原柱与培养基达到平衡。
    注意：此后，可将胶原柱重新拉回毛细管中继续培养，待后续使用。

3. 使用光片显微镜进行图像采集

  1. 根据制造商的说明组装样品室。
  2. 打开培养箱和显微镜，将样品室加热至 37 °C（仅适用于活细胞成像）。
  3. 将毛细管放入样品室中，并定位样品以 找到用于图像采集的兴趣区域。
  4. 激活相应的激光器。设置以下参数：激光功率、曝光时间、z 轴步进间距、z 轴扫描的起始和终止位置，以及活细胞成像的时间间隔。
    注意：例如，图2中的样品在 37 °C 下每隔 40 秒成像一次，持续 6 小时，z 轴步进间距为 1 µm（总厚度：538 µm）。激光功率为 1%，曝光时间为 30 ms。x-y 方向的像素大小为 0.23 µm。
  5. 开始图像采集。

4. 自动化追踪分析

  1. 打开文件转换器，点击 添加文件 以选择要转换为软件文件格式（*.ims）的成像文件。点击 浏览 并选择一个文件夹以保存转换后的文件。点击 全部开始。
  2. 打开分析软件。点击 Surpass。进入 文件 菜单并点击 打开，然后选择要分析的成像文件。
    注意：如果文件较大，此步骤可能需要较长时间。不建议单个实验使用大于1太字节（TB）的文件，因为处理如此大的文件对计算能力要求极高。
  3. 点击 添加新斑点。勾选 最后处理整幅图像 选项框。点击 下一步。
  4. 输入 x 和 y 的坐标（以像素为单位）以定义感兴趣区域。输入要分析的帧数（时间和 z 位置）。点击 下一步。
  5. 在 源通道 下拉列表中选择目标通道，该通道包含待追踪的对象。输入 估计的 xy 直径（单位为 µm）。点击 下一步。
    注意：估计的 xy 直径 是指待追踪对象在 x-y 维度上的平均直径。
  6. 点击 质量。设置一个阈值，使大多数细胞（对象）都能被包含在内。点击 下一步。 
  7. 选择所需的算法（推荐使用 自回归运动 算法）。输入最大距离（推荐值为 20 µm）和最大间隙大小（推荐值为 3 或 2）。点击 最后处理整幅图像。
    注意：最大距离 和 最大间隙大小 是用于中断轨迹的两个阈值。具体而言，在两个连续帧中，若同一对象之间的距离超过最大距离，则后续帧中的该对象将被视为新对象。有时在采集过程中，同一对象可能在若干帧中消失后再次出现。在此情况下，只有当该对象在最大间隙大小范围内重新出现时，才会被视为同一对象。
  8. 点击 过滤类型 并选择排除不需要的轨迹的选项。
    注意：此步骤为可选步骤。
  9. 点击 下一步，然后点击 完成。
    注意：此步骤可能需要数小时至数天，具体取决于计算性能。
  10. 点击 编辑轨迹 并选择 校正漂移。选择合适的算法（推荐使用 平移漂移 算法）。选择所需的结果数据集大小（推荐选择 新大小等于当前大小）。点击 确定。
    注意：仅当图像采集过程中胶原发生漂移时才需要执行此步骤。
  11. 点击 统计 并选择 配置可见统计值列表。勾选需要导出的选项（例如坐标、速度等）。点击 确定。
  12. 点击 将所有统计数据导出到文件 并输入文件名。

5. 胶原基质中细胞的固定与免疫荧光染色

  1. 在通风橱内，将 1,000 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA，溶于 PBS）转移至 5 mL 离心管中。
    注意：PFA 应平衡至室温。
  2. 将来自步骤 2.9 的含有聚合胶原的毛细管浸入 PFA 溶液中（约 5 mm），并使用橡皮泥将毛细管固定在 5 mL 管的内壁上（如 图 1C 所示）。
  3. 轻轻推动推杆，使一半的胶原柱悬于 PFA 溶液中（图 1D）。将离心管置于室温下静置 20 min。
  4. 回拉推杆，使胶原柱重新进入毛细管内。取出毛细管并弃去 PFA。
  5. 将毛细管放入新的离心管中，并加入 1 mL PBS。确保毛细管完全浸没在 PBS 中。
  6. 轻轻推动推杆，使一半的胶原柱悬于溶液中。用橡皮泥将毛细管固定在管内壁上。
  7. 将离心管置于室温下静置 5 min。
  8. 重复步骤 5.4–5.7 共 2 次。
  9. 回拉推杆，使胶原柱进入毛细管内。弃去 PBS。向管中加入 1– 2 mL 封闭/通透缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.1% 非离子型表面活性剂），并重复步骤 5.6。
    注意：BSA（1%）可用 5% 的用于制备二抗的动物血清替代。
  10. 将离心管置于室温下静置 30–60 min。
  11. 回拉推杆，使胶原柱进入毛细管内。弃去通透缓冲液。加入 200–500 µL 用封闭/通透缓冲液稀释的一抗，并将胶原柱推出至溶液中。
  12. 将离心管置于室温下孵育 1 h。
  13. 按照步骤 5.4– 5.8 所述方法，用 PBST（PBS + 0.1% 非离子型表面活性剂）洗涤胶原柱 3 次。
  14. 在避光条件下，用含有二抗的封闭/通透缓冲液室温孵育胶原柱 1 h。 
  15. 按照步骤 5.4– 5.8 所述方法，用 PBS 洗涤胶原柱 3 次。
  16. 回拉推杆，使胶原柱进入毛细管内。将样品保存在 PBS 中，直至成像。
  17. 按照步骤 3 所述方法对样品进行扫描。

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结果

T细胞迁移过程中的突起形成是一个高度动态且依赖肌动蛋白的过程。为了可视化原代人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的突起形成，我们如前所述11，瞬时转染了与mEGFP融合的蛋白以标记CTL中的肌动蛋白细胞骨架。转染后一天，将细胞包埋于胶原基质中。使用光片显微镜在37 °C条件下，以每40秒一次的频率、1 µm的步长采集图像序列。如图2A和补充视频1所示，在迁移过程中，人CTL形成呈柠檬状的主要突起，其边缘带有细小的纺锤样结构。本实验中成像的不仅是一个单细胞，而是一个大体积区域（450 × 450 × 538 µm3）（图2B）。因此，此处展示的光学质量和分辨率是使用低倍物镜（20X / 1.0 DIC VIS IR）获得的。因此，使用更高数值孔径（NA）的物镜可进一步提高分辨率。

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讨论

大多数 体外 实验在二维表面进行，例如在细胞培养板、培养皿或盖玻片上，而 体内 细胞，尤其是免疫细胞，所处的微环境大多为三维（3D）环境。越来越多的证据表明，免疫细胞的迁移模式在二维（2D）与三维（3D）条件下存在差异。17此外，肿瘤细胞在二维和三维培养组织中的表达谱也存在差异。18,19,20因此，为了最好地模拟生理条件 体外在三维环境中进行实验具有显著优势，例如在三维胶原基质中开展研究。近年来发展的新技术，尤其是光片荧光显微镜技术，能够在受控的环境条件下，对三维基质系统实现可靠且可重复的实验观察。

与传统的激光扫描共聚焦显微镜对整个样品进行照明不同，光片显微镜仅生成一薄层激光光片来照射样品。检测相机的成像平面与照明平面垂直。由于该技术的特点，只有处于焦平面的样品区域受到激光照射，因此可最大限度...

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披露

作者声明不存在任何财务或商业利益冲突。

致谢

感谢临床止血学与输血医学研究所提供供体血液；感谢Carmen Hässig和Cora Hoxha提供的出色技术帮助。感谢Jens Rettig（萨尔兰大学）提供改良的pMAX载体，Roland Wedlich-Söldner（明斯特大学）提供原始的LifeAct-Ruby质粒，以及Christian Junker（萨尔兰大学）构建LifeAct-mEGFP质粒。本项目由特别研究领域基金Sonderforschungsbereich 1027（项目A2，负责人B.Q.）和894（项目A1，负责人M.H.）资助。光片显微镜由德国研究基金会（DFG，项目编号：INST 256/4 19-1 FUGG）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛胶原蛋白溶液 FibricolAdvanced Biomatrix #5133-20ML胶原蛋白基质
0.5 M NaOH 溶液Merck1091381000用于中和 Fibricol 溶液
超低熔点琼脂糖Affymetrix32821-10GM低 c[Col] 条件下的样品制备
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells KitThermo Fisher11348D从外周血单个核细胞（PBMC）中分离原代人 CD8+ T 细胞
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher11132D细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）群体的激活
人重组白细胞介素-2Thermo FisherPHC0023培养的 CTL 刺激
P3 原代细胞转染试剂盒（P3 Primary solution kit）LonzaV4XP-30XX转染
α-PFN1 抗体，兔源 IgGAbcamab124904免疫荧光（IF）
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284免疫荧光（IF）
CellMask Orange 细胞膜染料Thermo FisherC10045荧光细胞标记
Tween 20SigmaP1379-250mL免疫荧光（IF）
Triton X-100Eurobio018774免疫荧光（IF）
DPBS 杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate buffered saline）Thermo Fisher14190250免疫荧光（IF）
牛血清白蛋白SigmaA9418-100G免疫荧光（IF）
山羊抗兔 568 抗体（Goat α Rabbit 568），IgG，兔源Thermo FisherA-11011免疫荧光（IF）
Lightsheet Z.1（光片显微镜）ZeissN.A.
细胞培养超净台Thermo FisherHeraSafe KS
细胞培养孵箱 HERACell 150i Thermo FisherN.A.
离心机 5418 和 5452EppendorfN.A.
移液器Eppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
移液器吸头VWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL 离心管Sarstedt 62.554.002
50 µL 毛细管VWR (Brand)613-3373Zeiss LSFM 样品制备
毛细管推杆VWR (Brand)BRND701934"带聚四氟乙烯（Teflon）头的冲压工具"，用于 LSFM 样品制备
MColorPhast pH 试纸Merck1095430001检测中和后 Fibricol 的 pH 值
BD Plastipak 1 mL 注射器BDZ230723 ALDRICH替代样品制备方法
模型黏土（Hasbro Play-Doh A5417EU7）Play-DohN.A.
Imaris 文件转换器Bitplane可从 http://www.bitplane.com  获取将成像文件转换为 Imaris 文件格式
Imaris 8.1.2（MeasurementPro, Track, Vantage）Bitplane可从 http://www.bitplane.com  获取三维和四维成像数据的分析

参考文献

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