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方法文章

利用流式细胞术表征水生生物膜

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DOI：

10.3791/57655

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2018年6月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Toxicology, Eawag - Swiss Federal Institute for Aquatic Science and Technology

本文内容

摘要

流式细胞术结合可视化聚类分析为研究水生生物膜提供了一种简便快速的方法。该方法可用于生物膜的表征、生物膜群落结构变化的检测，以及嵌入生物膜中非生物颗粒的检测。

摘要

生物膜是由微生物组成的动态群落，在淡水生态系统中发挥着关键作用。通过改变其群落结构，生物膜能够快速响应环境变化，因此可作为水质的指示指标。目前，生物膜的评估主要依赖于整合性和功能性终点指标，例如光合作用或呼吸活性，但这些方法无法提供有关生物膜群落结构的信息。流式细胞术结合计算可视化技术为评估群落组成（特别是淡水生物膜中的光能自养部分）提供了一种替代性的、灵敏且易于使用的方法。该方法仅需基本的样品制备步骤，随后即可将整个样品直接上机进行流式细胞分析。通过获取单细胞的光学和荧光信号，用于后续的计算可视化与生物学解读。相较于其他方法，其主要优势在于分析速度快且信息含量高。流式细胞术可在一次测量中同时提供多种细胞和生物膜特征信息：颗粒大小、密度、色素含量、生物膜中非生物成分含量以及粗略的分类学信息。然而，该方法无法提供物种水平的生物膜组成信息。我们认为，该方法在水生生态系统环境监测中具有广阔应用前景，也可作为初步评估生物膜的手段，为后续采用互补性且更精细的方法开展深入研究提供指导。

引言

生物膜是由微生物组成的动态群落，在淡水生态系统中发挥着关键作用，包括初级生产、养分循环、水体净化，以及影响微生物在生态系统中的分布和生物多样性1。当生物膜暴露于变化的环境条件或化学等胁迫因子时，其群落结构会迅速向更具耐受性的物种转变2,3。由于其高度敏感性，生物膜成为环境监测中理想的模型系统4，然而目前尚无一种方法能够快速、简便地有效追踪生物膜群落的动态变化。

用于表征生物膜的常用方法集包括对功能性和结构性终点的测量。在群落整体水平上，光合作用和呼吸作用活性以及胞外酶活性可提供有关生物膜功能状态的信息5,6,7,8,9。生物量的积累被用作衡量生物膜总体生长的指标。目前，结构变化的测量主要通过传统光学显微镜下的物种鉴定或基于核苷酸的技术（例如，变性梯度凝胶电泳（DGGE）、自动核糖体间隔区分析（ARISA）、宏基因组学）来实现10,11,12。这些方法虽能提供信息，但操作耗时，或需要特定专业知识，或仍处于发展阶段。最后，尽管近年来出现了评估胞外聚合物（EPS）13,14和生物膜结构1的新方法，且灵敏度较高，但通量较低，尚未发展成为适用于监测目的的技术。

显然，要对淡水生物膜进行完整表征，必须结合多种不同方法，以深入了解生物膜的功能、组成和结构。而对环境监测而言，则需要一种快速且灵敏的方法，能够检测生物膜的变化，并对功能和结构水平上的变化进行基本的生物学解读。

我们开发了一种用于表征溪流生物膜（附生藻类）中光合微生物群落的新方法，该方法速度快，可用于监测目的，同时又能提供足够的生物膜群落结构信息，以实现生物学解释15。该方法基于生物膜样品的单细胞流式细胞术（FC），结合计算可视化技术，可在单细胞水平上提供生物膜的光学和荧光特性信息。

生物膜取样后的实验流程包括样品制备，具体步骤为超声处理、固定以及基于尺寸的过滤，随后通过流式细胞术对样品进行分析。所获得的数据可在单次测量中提供多种细胞特征信息：颗粒大小、密度、色素含量以及生物膜中的非生物成分（例如 微塑料）。该数据集随后通过计算可视化方法——可视化随机邻域嵌入（viSNE）16进行分析，从而实现对数据的快速且直观的解读。尽管建立并优化该方法需要数周时间，但一旦建立完成，从采集生物膜样品到结果解读仅需数小时。

该方法相较于其他方法的主要优势在于分析速度快且信息含量高。此外，样品在采集后可保存数周，而不会丧失其光学和荧光特性。当需要对大量样品进行表征时（例如大规模采样研究或生物监测项目），这一特性尤为有用；同时，在较小规模的探索性研究中，也能提供大量信息。

本方案基于对从溪流不同位置采集的光合生物膜（周丛生物）进行流式细胞术分析。方案中的许多步骤，例如为监测目的选择合适的采样点，取决于研究目标，因此无法做出统一规定。而其他步骤则灵活性较小，要求严格遵循本方案，下文将对此进行详细说明。

该方案首先选择用于基于生物膜的环境监测的采样点。下一步是设置流式细胞仪（FC），使其测量能够区分监测环境中生物膜内不同光合生物。这一步骤通过采集各采样点的生物膜样品，鉴定生物膜中不同物种的荧光特性，并配置流式细胞仪的激光器和滤光片，使其可在适当的光学波长下进行测量来完成。流式细胞仪设置完成后，可定期从采样点采集生物膜样品，利用流式细胞术测量生物膜中单个颗粒的光学和荧光特性，并通过可视化聚类分析数据。为了更准确地解读结果，可建立本地生物膜生境物种及其表型的流式细胞术参考数据库，并利用该数据库识别流式细胞术数据中的不同分类群。可通过基于荧光的FACS分选所识别的单细胞聚类群，并结合显微镜下的分类学鉴定对结果进行验证。本方案的示意图见图1。

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方案

1. 生态系统选择与生物膜取样

  1. 选择一个感兴趣的水生生态系统，并寻找生物膜生长的采样点。溪流中水流缓慢至中等、具有石质河床可供生物膜附着的浅水区域是合适的采样地点17,18。
  2. 可选步骤：如果采样点缺乏足够的生物膜附着表面，或为了降低同一地点内生物膜的变异性，可在该地点放置人工基质（例如 玻璃片、陶瓷砖）供生物膜附着，同时确保其朝向与水流方向一致，并处于相似的水深和光照强度条件下19。
  3. 为确定采样点的环境条件，使用便携式仪器测量待采样生物膜表面之上的光照强度、水温、电导率、溶解氧和pH值。在整个采样过程中，应进行多次测量（3–5次），以计算平均值。
  4. 可选步骤：采集水样，用于测定相关水质化学参数（溶解性有机碳（DOC）、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-、F-、SO42-、PO42-、NO32-、SiO44-）。
  5. 佩戴防护手套，从每个采样点（或人工基质）收集大小、形状和类型相似的石块。这些石块应暴露于相似的水流和光照条件下18。
  6. 使用0.22 μm滤膜过滤足量的现场溪水，确保能满足所有样品的需要（例如 每个样品15 mL）。
  7. 使用软毛牙刷将生物膜从基质上刷入含有15 mL过滤溪水的烧瓶中（持续刷洗直至所有生物膜被完全去除）20。
  8. 用0.01%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定样品21。

2. 确定最佳流式细胞术（FC）参数

  1. 将样品转移至光学显微镜下观察（使用40×/0.75物镜；必要时使用100×/1.3油镜），鉴定样品中存在的物种22,23.
  2. 从适当的文化保藏中心订购已鉴定的单一物种例如 哥廷根大学实验藻类学与藻类培养库 [EPSAG] 或科隆大学藻类培养库 [CCAC]（若在中欧生态系统中进行监测）
  3. 在相似的环境条件下连续培养单一物种例如， 光照、温度、pH）与生物膜样品的原始环境保持一致。建议温度差异控制在1 °C以内，pH差异控制在0.5单位以内。
  4. 为分离/分散细胞，将15 mL单物种样品加入离心管中，将离心管置于水浴中心并浸入水中，使样品液面与水浴液面齐平。在45 kHz条件下对样品超声处理1分钟。24,25.
  5. 使用酶标仪记录单个物种的吸光度和荧光光谱。具体操作请参考所选酶标仪的使用说明。本示例中，将200 µL样品加入96孔平底透明聚苯乙烯板中，测定吸光度。（仪器设置如下：（a）荧光扫描模式：发射波长步长10 nm，扫描点数30，带宽20 nm，增益100，闪光次数25次，积分时间20 µs；或（b）吸光度扫描模式：闪光次数25次，带宽9 nm。）
  6. 使用激光器、二向色分光镜和滤光片设置流式细胞仪，使其组合能够覆盖不同物种具有特异性荧光特性的所有波长范围。对于中欧地区的溪流，采用405 nm、488 nm和638 nm激光器可获得理想结果。
  7. 调节光电倍增管的电压设置（并非适用于所有流式细胞仪）以及荧光检测范围，以确保包含样本中至少99%的全部事件。
  8. 或者，如果已知生物膜中存在的物种信息，可从步骤 2.2 开始；如果已知荧光特性，可从步骤 2.6 开始。

3. 可选：流式细胞术参考数据库的制备

注意：流式细胞术（FC）无法对生物膜中存在的细胞进行分类学鉴定。建立参考数据库，收录在与生物膜相似条件下培养的、已知存在于生物膜中的单一种属的流式细胞术测量数据，将有助于数据解读。

  1. 参考：单一物种
    1. 使用在2.5–7中优化的流式细胞术（FC）参数，测量单一物种的光学和荧光特性（用多聚甲醛和戊二醛固定，并通过适合流式细胞仪的适当孔径滤膜过滤）。
    2. 以与生物膜数据相同的方式对单一物种的数据进行归一化处理（见步骤6.1.2）。
  2. 参考：受损与衰亡细胞
    生物膜健康状况最重要的指标之一是其中受损/濒死细胞所占的比例。为定量这些细胞，可制备衰亡细胞的参考样本。
    1. 取1 mL稀释后的生物膜子样品，在台式离心机中室温下以8,000 × g 离心10分钟。将所得沉淀重悬于1 mL 90%乙醇中，4 °C下保存过夜。次日重复此步骤。
    2. 使用优化后的流式细胞术（FC）设置，测量受损与衰亡细胞的光学和荧光特性（已固定并过滤）。  
  3. 参考：微塑料
    注意：若关注生物膜中微塑料颗粒的监测，请检查其光学和荧光特性是否与生物颗粒有足够差异以便识别。
    1. 根据微塑料生产商的说明悬浮微塑料颗粒，并使用2.7中的FC参数测量其光学和荧光特性。  
    2. 将微塑料颗粒加入生物膜样品中，在4 °C下静置过夜。
    3. 过滤该悬浮液，并使用与上述相同的FC参数进行测量。

4. 样品制备与保存

  1. 在完成流式细胞仪（FC）的设置并准备好FC参考数据库后，即可开始评估按照步骤1.1–7采集的新鲜生物膜样品。为脱离或分散生物膜，将15 mL样品从烧瓶（见步骤1.1）转移至离心管中。
  2. 将每根离心管置于水浴中心，浸入水中，使样品液面与水浴液面齐平。在45 kHz条件下超声处理样品1分钟。
  3. 使用0.01%多聚甲醛和0.1%戊二醛（溶于纳米纯水中）对样品进行固定。4 °C保存，直至准备进行分析。
  4. 重要提示：将一半样品用于流式细胞术分析，另一半保留储存，以确保安全，并可用于荧光激活细胞分选和/或光学显微镜的可选验证（见第6节）。
    注意：固定后的生物膜样品在冰箱中储存可保持其光学和荧光特性长达三周。

5. 通过流式细胞仪运行样本

  1. 如果样品储存在冰箱中，需快速超声处理或反复吹打以分散颗粒。在测量前，使用50 μm滤膜（滤膜孔径取决于流式细胞仪毛细管的宽度）过滤样品的子样本。
  2. 将各个样品（1–2 mL，具体体积取决于所使用的流式细胞仪）加载到流式细胞仪中，测量每个颗粒的光学和荧光特性。每个生物学重复样品进行三次测量（即三个技术重复）。
  3. 以 .csv 格式从流式细胞仪导出数据。 

6. 数据准备与相关性分析

流式细胞术可针对每种测定的光学特性和荧光范围分析多个参数（例如，信号面积、高度、宽度）。对测定的变量进行相关性分析，仅保留那些相关性不高的测量值。这通常会剔除除一个FC参数（例如，信号面积）之外的所有其他参数，同时也可剔除高度相关的荧光测量值（通常来源于同一激光器和相邻滤光片）。

  1. 在 Matlab 中将 CYT 作为工具箱运行：
    1. 将所有待分析样本的降维后流式细胞术（FC）数据（以 .csv 格式）导入 CYT 软件16，包括所有技术重复和生物学重复。（点击 +，文件筛选器 *.csv，选择要导入的文件）。
    2. 使用双曲反正弦变换对所有样本的荧光通道进行转换。需要选择共因子的数值；对于大多数光合生物膜和流式细胞仪，150 是适用值，但特定实验设置或异养生物膜可能需要优化。（右键/转换/输入共因子 150）
    3. 为进行质量控制，在 CYT 中目视比较各个样本以及各个光学和荧光通道的直方图，确保在技术重复和生物学重复层面均无异常值。异常值会表现为重复样本之间荧光/光学分布显著偏移。（选择数据，选择通道，绘图）
      1. 替代方法：对荧光分布的中位数值进行主成分分析（PCA），并确保技术重复和生物学重复在聚类上彼此靠近。
    4. 合并每个生物学重复内的技术重复，并对生物学重复进行子抽样，使每个重复由相同数量的颗粒（细胞、细胞碎片和非生物颗粒）表示，并使 Barnes-Hut 随机近邻嵌入（bh-SNE）分析的总颗粒数约为 150,000（以获得最佳可视化效果26）。（选择数据，右键，合并/子抽样）
    5. 为比较样本间差异，重要的是仅选择需要比较的样本。选定样本后运行 bh-SNE27。算法完成后，将出现名为 bh-SNE1 和 bh-SNE2 的新通道。这些是所有分析颗粒的 SNE 坐标，可用于在散点图中可视化数据（viSNE 图谱）。（选择数据，选择通道，右键，bh-SNE，选择标准化数据）
    6. 在 viSNE 图谱中，颗粒根据相似性定位并被分组为视觉上可区分的簇。检查这些簇的光学/荧光特性，并使用 CYT 中提供的绘图工具标记和命名那些分离良好且具有不同光学/荧光特性的簇。（选择通道 bh-SNE1、bh-SNE2）
    7. 可选：如果存在单微生物物种的参考数据库（需使用相同的流式细胞术设置并在相似条件下培养！），可将 viSNE 图谱导出至 Matlab，并将参考数据库投影到图谱上。通过此方法，可将特定簇与特定物种/分类群关联（相关脚本可在 https://github.com/anzezupanic/FC_analysis 下载）。（会话/保存）
    8. 故障排除：如果 bh-SNE 分析未产生视觉上可区分的簇，而仅形成一个大的簇，则表明在 bh-SNE 中使用的颗粒过多。请尝试减少每样本使用的颗粒数。如果未形成簇，而是出现稀疏的孤立点，则应增加所用颗粒的数量。
  2. 可选：除了依赖 bh-SNE 进行聚类外，也可在标准化数据上使用其他聚类方法（例如，层次聚类、基于质心或基于密度的聚类），然后将其叠加到 viSNE 图谱上（https://github.com/anzezupanic/FC_analysis）。
  3. 一旦确定了簇，统计每个样本中各生物学重复所属每个簇的颗粒数量。使用 ANOVA 和 Tukey 检验评估样本间的差异，并采用适当的多重比较校正方法（例如，Holmes 校正）。

7. 可选：使用荧光激活细胞分选验证聚类解释

  1. 在鉴定出各群集后，若条件允许且流式细胞分选仪（FACS）的激光器和荧光滤光片配置与鉴定系统相似（或相同），可使用荧光激活细胞分选（FACS）从样品中将这些群集分选出来。
  2. 对于每个已鉴定的群集，CYT 提供定义该群集的光学和荧光门控参数。利用这些门控参数通过 FACS 分选出各群集中的颗粒，随后使用光学显微镜鉴定分选出的细胞。

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结果

使用本文所述方法（图1），对采自瑞士某条本地溪流多个地点的样本进行了分析。在每个采样点，采集三块大小相似的石头（10–12 cm），并用刷子将石头表面的生物膜刷下。随后对样本进行超声处理、固定、过滤，最后通过流式细胞术进行分析。流式细胞仪的设置及所用参考数据库与之前发表的一篇论文中所述相同15：使用了三种激光（405、488 和 638 nm），七种二向色分光镜和十种滤光片，覆盖了从 425 到 695 nm 的荧光发射范围。 >755 nm，以及包含参考数据库的 >在瑞士溪流生物膜中发现的30个物种，涵盖蓝藻、绿藻、硅藻和红藻。用于生成viSNE图谱的粒子总数约为150,000个。图 2A）。利用所述方法，可区分不同位点（图2B），在具有粗分类信息的细胞亚群中对viSNE图的不同区域进行分类图...

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讨论

上述方案的实施相对简单。然而，尽管目前所展示的默认设置已证明适用于迄今为止测试的所有光合生物膜，但仍需根据方案中所述进行优化，以最大限度地获取该方法所能提供的信息。事实上，生物膜的光学和荧光特性可能因环境条件（季节、温度、水体化学组成）的不同而有所变化1。因此，在设置流式细胞分析（FC）时，必须充分考虑这种变异性。一种可行的方法是从采样点采集具有代表性的生物膜样本，和/或选取单一物种并在不同条件下培养，然后使用不同设置对其进行测量。培养单一物种还有助于构建荧光特性数据库，用于解释流式细胞分析结果。但需要注意的是，为确保数据库的有效性，单一物种的测量条件应尽可能与实际生物膜采样时的环境条件相似。例如，在25 °C下培养的单一物种所建立的流式细胞分析数据库，对于分析在15 °C下生长的生物膜组成将提供极为有限的信息。然而，要有效使用该方法，并非必须建立参考数据库。仅使用基础的流式细胞分析方案，即可获得生物膜中细胞的大小、颗粒度以及不同色素存在的信息。通过可视化聚类，可将细胞划分为在测量特性上相似的类群，并确定不同样本间变化最显著的特性。当需要为不同类群分配分类学身份时，参考数据库的作用则变得尤...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了瑞士国家科学基金会（SNF）Ambizione奖学金（PZ00P2_142533）和Velux研究基金（Amplebig）的支持。我们感谢Bettina Wagner在实验工作中的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
万用表WTWMultiLine 3620 IDS用于测量温度、pH值和溶解氧
超声波清洗器VWR International97043-986槽体尺寸：15×14×10 cm
流式细胞仪Beckman CoulterGallios激光波长：405、488 和 638 nm。滤光片波段见补充表11。Sgier et, Nat Comm, 2016。 
酶标仪TecanInfinite M200用于选择流式细胞仪的合适设置
细胞分选仪Beckman CoulterMoFlo Astrios设置见补充表12。Sgier et, Nat Comm, 2016。 
荧光显微镜ZeissAxiovert 135Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 物镜
软件
MatlabMathWorksR2013a用于数值计算的软件
CYTDana Pe'er Lab版本 1.1免费的交互式可视化工具，用于流式细胞数据的分析

参考文献

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