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一种高效的样品制备方法以增强基质辅助激光解吸/电离质谱中的碳水化合物离子信号

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DOI：

10.3791/57660

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2018年7月29日

 ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

本文内容

摘要

本文演示了一种通过在样品制备过程中重构晶体结构来增强MALDI质谱中碳水化合物离子信号的实验方案。

摘要

样品制备是碳水化合物质谱（MS）分析中的关键步骤。尽管基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱是碳水化合物分析的首选方法，但碳水化合物样品的离子信号弱和数据重复性差的问题仍然十分严重。为了实现碳水化合物的定量分析，必须建立一种能够提供高质量数据的有效分析方案。本视频展示了可提高MALDI-MS中碳水化合物信号强度并减少数据变异的样品制备方法。在样品液滴干燥和结晶后，于质谱分析前使用甲醇对晶体形态进行重构。通过MALDI成像质谱（IMS）检测碳水化合物信号的增强效果。实验结果表明，晶体重构可调整晶体结构并重新分布碳水化合物分析物。与传统MALDI-MS中的干燥液滴制备法相比，使用甲醇重构碳水化合物晶体形态可显著改善信号强度、离子图像分布及数据稳定性。由于本视频所展示的方法不涉及样品组成的改变，因此可广泛适用于多种碳水化合物和基质。

引言

碳水化合物分析是一个重要且具有挑战性的课题。碳水化合物及其衍生物在生物体中发挥着重要作用1,2,3。这些分子结构复杂，且容易分解。由于分离和检测困难，许多碳水化合物难以被明确表征。尽管基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）因其高灵敏度和结果易于解读，已被广泛应用于多种生物分子的分析4，但由于碳水化合物分子的电离效率较低，利用MALDI-MS对其进行分析仍面临重大挑战5。化学衍生化是提高碳水化合物电离效率的常用方法6,7，但此类操作耗时且消耗样品量大。此外，衍生化后碳水化合物的电离效率仍低于蛋白质。因此，开发无需复杂操作即可增强MALDI-MS中碳水化合物信号的方法十分必要。

将MALDI-MS应用于定量分析是另一个具有挑战性的课题。MALDI-MS的一个主要问题是，其灵敏度和数据重现性在很大程度上依赖于样品制备方案和实验参数。在许多情况下，由于样品形貌和分析物分布的不均匀性，MALDI-MS的定量分析不可靠。一个众所周知的例子是使用2,5-二羟基苯甲酸（DHB）MALDI基质制备的样品。当DHB在常温环境下缓慢结晶时，分析物掺入基质晶体的程度难以预测，因为所得样品呈现出不规则的形貌。此类样品通常由大针状晶体和细小晶体组成。当使用挥发性溶剂和/或加热样品板制备DHB时，快速干燥过程可形成更均匀的细小晶体，从而获得更可靠的定量结果8,9,10。该技术被称为MALDI样品的"重结晶"。这种改进归因于在快速结晶过程中分析物更好地掺入细小基质晶体中。我们还证明，调节样品制备环境可降低碳水化合物信号的不均一性，从而改善定量结果11,12。这些研究结果表明，样品形貌是决定碳水化合物信号质量的关键因素。为了建立适用于日常分析的通用策略，亟需一种能够提高碳水化合物检测灵敏度的高效样品重构方法。

我们在最近的一篇报告中系统地研究了样品形貌与MALDI-MS中碳水化合物检测灵敏度之间的相关性13。使用多种重要碳水化合物和基质获得的结果表明，通过对干燥后的MALDI样品进行重结晶，可实现最佳的信号增强效果。采用常规干燥液滴法（DD）制备的样品，可通过甲醇（MeOH）快速重结晶来改变其形貌。本文展示了详细的样品制备方案。该方案包括三个主要步骤：样品靶板预处理、样品点样与重结晶，以及质谱分析。所用碳水化合物包括唾液酸化路易斯A抗原（SLeA）和麦芽七糖（MH），DHB作为模型基质。结果表明，重结晶后碳水化合物的信号强度和空间分布显著改善。该方法可适用于其他常用基质的样品，包括2,4,6-三羟基苯乙酮（THAP）和α-氰基-4-羟基肉桂酸。该方法是一种通用性策略，可轻松整合到实验室常规碳水化合物分析流程中。

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方案

1. 样品板预处理

  1. 样品板的清洗
    1. 佩戴腈手套，以避免在清洗过程中污染样品板。
    2. 用100.0 mL洗涤剂溶液（1.0 mg/mL）手工清洗样品板。
    3. 用去离子蒸馏水（DDW）手工清洗样品板。
    4. 用30.0 mL甲醇（MeOH）冲洗样品板表面。
    5. 将样品板放入600 mL烧杯中，并加入DDW直至样品板完全浸没于水中。
    6. 将烧杯置于超声波清洗仪（见材料表）中，对样品板进行超声处理15分钟（200 W，40 kHz）。
    7. 取出样品板，用加压氮气吹去水滴。
    8. 在样品板上沉积0.2 µL甲醇（MeOH），检查甲醇是否扩散至其他点位。
      注意：若甲醇与其他点位融合，则重复步骤1.1.3–1.1.5；若未融合，则进入下一步。
  2. 干燥室温度的调节
    1. 使用处于稳定条件下的干燥室对液滴进行干燥，具体方法如前所述11,12,13。特别是采用Ou, Y.-M. et al. 201612中步骤2.1–2.5所述的详细流程。简要如下：
      1. 以室温氮气在恒定流速下吹扫干燥室，以维持低相对湿度环境。
      2. 通过干燥室内温控铜块调节，使样品板温度在常规干燥条件（25 °C）或快速干燥条件（50 °C）下保持恒定。
  3. 基质与分析物溶液的制备
    1. 基质溶液的制备
      1. 将DHB溶于50%乙腈（ACN）:50%去离子蒸馏水（DDW）中，配制成0.1 M的溶液。
    2. 糖类分析物的制备
      1. 将SLeA溶于去离子蒸馏水（DDW）中，配制成10-4 M的溶液。
      2. 将MH溶于去离子蒸馏水（DDW）中，配制成10-4 M的溶液。

2. 样品沉积与再结晶

注意：此处描述的是分析少量且常规样品量的优化步骤。在滴加溶液前，确保样品板温度已稳定在目标温度。如果样品在重结晶过程中扩散至较大区域并覆盖其他样品点，请制备新的样品或重复步骤 1.1。

  1. 用于微量样品（0.1 µL）的分析
    注意：    以下步骤旨在最大限度减少样品和时间消耗，适用于样品量有限的实际样品定量分析，或用于快速离子迁移谱（IMS）的定量分析。
    1. 在微量离心管中预先混合 0.25 µL DHB 溶液和 0.25 µL SLeA 或 MH 溶液。
    2. 使用涡旋振荡器对混合溶液涡旋振荡 3 秒。
    3. 在微型离心机中离心 2 秒（2000 × g），使混合溶液沉降至管底。
    4. 使用移液器吸取 0.1 µL 预混溶液，并立即点样至样品靶板上。
      注意：点样微量样品时，切勿使预混溶液在移液器吸头中停留超过 10 秒。
    5. 等待样品完全干燥。典型的干燥时间见 表 1。
    6. 使用移液器将 0.2 µL 甲醇（MeOH）直接点加至已干燥的样品斑点上，样品将迅速润湿并立即再次干燥。
      注意：确保点加操作在 3 秒内完成，以避免甲醇发生显著蒸发损失。
    7. 使用显微镜检查样品。若晶体形貌未达到预期效果（参见 图 1 中理想结果示例），请重复步骤 2.1.1–2.1.6，重新制备样品。
    8. 佩戴腈手套，小心地将样品靶板从干燥室中取出。
  2. 用于常规量样品（1 µL）的分析
    注意：以下步骤旨在最大化碳水化合物样品的均匀性，适用于通常 MALDI 所用样品量的常规及定量分析。重结晶过程可使样品与基质均匀分布于更大区域。
    1. 在微量离心管中预先混合 2.5 µL DHB 溶液和 2.5 µL SLeA 或 MH 溶液。
    2. 使用涡旋振荡器对预混溶液涡旋振荡 5 秒。
    3. 在微型离心机中离心 2 秒（2000 × g），使混合溶液沉降至管底。
    4. 使用移液器吸取 1.0 µL 预混溶液，并立即点样至样品靶板上。
      注意：DO NOT 在点样完成后再次使用剩余的预混溶液。
    5. 等待样品完全干燥。典型的干燥时间见 Table 1。
    6. 使用移液器将 1.5 µL 甲醇（MeOH）直接点加至已干燥的样品斑点上，样品将迅速润湿并立即再次干燥。
      注意：当样品靶板温度较高（50 °C）时，重结晶步骤应在 5 秒内完成，以尽量减少移液器吸头中甲醇的蒸发。
    7. 使用显微镜检查样品。若晶体形貌未达到预期效果（参见 图 1 中理想结果示例），请重复步骤 2.2.1–2.2.6，重新制备样品。
    8. 佩戴腈手套，小心地将样品靶板从干燥室中取出。

3. 质谱数据采集与分析

注意： 分析使用配备 MALDI 离子源的商用飞行时间质谱仪（材料表）进行。该仪器由特定控制软件（材料表）操作，并预优化了提取延迟时间和激光能量。谱图以线性模式采集，质量范围为 m/z = 0 – 1500。样品靶板电压为 ±25 keV，每张谱图平均采集 10 次激光脉冲。用户应使用兼容软件进行仪器优化和样品分析，并遵循仪器制造商的操作说明。

  1. 打开仪器控制软件（参见材料表）。
  2. 将样品板插入质谱仪中。
  3. 在软件中选择预优化的数据采集方法。
  4. 使用成像软件注册整个样品区域以进行成像质谱（IMS）（参见材料表）。
    注意：若不进行IMS，请跳过此步骤。
  5. 在控制软件的批处理模式下启动数据采集。
  6. 数据采集完成后，使用成像软件绘制离子图像。
  7. 如果数据未伴随离子图像记录，则使用分析软件分析质谱数据（参见材料表）。

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结果

采用干燥液滴法（DD）和重结晶法制备的SLeA与DHB混合物的典型扫描电镜（SEM）图像如图1所示。通过DD方法制备的DHB典型形貌表现为样品斑点边缘处存在大尺寸针状晶体，中心区域则为细小的晶态结构，此类针状晶体的典型长度约为100 µm。经甲醇（MeOH）重结晶后，样品表面被更广泛分布且均匀的细小片状晶体覆盖，这些“片状”晶体的长度约为20–50 µm。与传统的DD样品相比，重结晶样品可提供更大的有效表面积。

成像质谱（IMS）结果表明，片状晶体通常会导致更高的碳水化合物信号强度以及更均匀的空间分布。在传统的干滴法（DD）样品中，碳水化合物离子信号主要分布在样品斑点的边缘区域。图2展示了SLeA和MH在有无甲醇重结晶处理下的IMS结果。经过重结晶处理后，SLeA和MH...

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讨论

样品不均一性是基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）中的一个关键问题。干燥液滴法（DD）是最常用的样品制备方法，但所形成的晶体高度不均一。此类样品在质谱信号上表现出较差的点间重复性和样品间重复性。因此，在数据采集过程中，在样品区域中寻找"信号热点"是MALDI实验中的常规操作。这类不均一样品不适用于常规分析中的定量检测。

在本研究中，通过重结晶优化了MALDI样品的形貌。重结晶提高了碳水化合物与基质之间的结合，从而增强了碳水化合物的信号强度和数据稳定性。由于大多数碳水化合物和基质具有亲水性，甲醇（MeOH）能够有效破坏MALDI晶体及其中的碳水化合物。观察发现，甲醇的沉积与快速蒸发可将大的针状DHB晶体重新形成小的片状晶体结构。该过程还减少了样品的分离现象，并增大了表面积。根据IMS数据，重构后的晶体为碳水化合物电离提供了更佳的微环境。值得注意的是，使用干燥室旨在提供一个具有精确控制实验参数的参考条件。对于常规分析，普通质谱用户可在常温环境下遵循相应操作步骤，即可获得类似的效果提升。

通过再结晶实现信号增...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
洗涤剂粉末Alconox242985
甲醇默克106009
乙腈默克100003
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）Alfa AesarA11459
唾液酸化路易斯A（SLeA)Sigma-AldrichS1782
麦芽七糖Sigma-AldrichM7753
移液器吸头Mettler Toledo17005091
微量离心管AxygenMCT-150-C
<强>仪器设备
Milli-Q 水纯化系统MilliporeZMQS6VFT1
无粉丁腈手套MicroflexSU-690
600 mL 烧杯杜兰2110648
超声波清洗机DeltaDC300H
湿度计Wisewind5330
氮气流量计DwyerRMA-6-SSV
K型热电偶Digitron311-1670
涡旋混合器科学工业公司 SI-0236
小型离心机选择生物产品Force Mini 
移液器Raininpipet-lite XLS
体视显微镜OlympusSZX16
温度可控干燥室本实验
Ultraflex II TOF/TOF 质谱仪布鲁克道尔顿公司
MTP 384 目标板 抛光钢 BC布鲁克道尔顿公司8280781
Flexcontrol 版本 3.4布鲁克道尔顿公司控制软件
Fleximaging 版本 2.1布鲁克道尔顿公司成像软件
Flexanalysis 版本 3.4布鲁克道尔顿公司分析软件

参考文献

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