细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外 使用Cdk1进行激酶活性检测，可鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，从而确定该重要激酶的细胞内作用靶点。
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方法文章
通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）是所有真核生物细胞周期的主要调控因子，可磷酸化约8%至13%的蛋白质组；然而，目前鉴定出的Cdk1靶点数量仍然较少，尤其是在人类细胞中。鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点具有重要意义，因为这些位点能够提供关于Cdk1如何调控细胞周期的机制性见解。细胞周期的调控对于染色体的准确分离至关重要，这一复杂过程中的缺陷会导致染色体异常和癌症。
此处，我们描述一种 体外 用于鉴定Cdk1特异性磷酸化位点的激酶实验。在该实验中，纯化的蛋白质被磷酸化 体外 通过市售的人源Cdk1/细胞周期蛋白B进行磷酸化。磷酸化成功与否通过SDS-PAGE确认，随后通过质谱鉴定磷酸化位点。我们还描述了可获得高纯度且均一的蛋白样品的纯化方案，适用于激酶活性检测；并介绍了用于功能验证所鉴定磷酸化位点的结合实验，该实验检测经典核定位信号（cNLS）与其核转运受体karyopherin α之间的相互作用。为辅助实验设计，我们综述了从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点的方法。这些方案共同构成了一种强有力的方法，可鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，并推动对Cdk1如何调控细胞周期的机制研究。由于该方法依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，尤其与细胞功能研究相结合时，能够获得可靠的结果。
引言
激酶是一类将磷酸基团从ATP转移至底物上的酶，可调控多种细胞过程。这种磷酸化修饰具有可逆性，反应迅速，可引入两个负电荷，并储存自由能，是细胞中最常见的翻译后修饰之一。Cdk1（也称为细胞分裂周期蛋白2同源物（cdc2））是所有真核生物细胞周期的主控调节因子1,2,3,4,5，据估计可磷酸化蛋白质组中8-13%的蛋白6,7。
尽管近期的蛋白质组学研究已鉴定出蛋白质中的许多磷酸化位点，但在大多数情况下，负责这些修饰的激酶仍未知。目前已知的Cdk1底物数量较少，尤其是在人类细胞中7。鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点具有重要意义，因为它能够推动机制性研究，阐明Cdk1如何调控细胞周期。细胞周期的调控对于精确的染色体分离和细胞分裂至关重要，多种细胞过程需协同进行以支持这一重要的生理功能。这些过程包括在有丝分裂开始前停止转录和翻译，以及细胞结构和组织发生显著的重组，例如核膜解体、染色体凝缩和有丝分裂纺锤体....
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方案
1. 从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点
- 开始激酶实验前，分析目标蛋白序列中预测的Cdk1特异性磷酸化位点，并查阅文献以寻找已通过实验验证但激酶特异性未知的磷酸化位点。使用以下总结的工具、数据库和参考文献。
- 使用iGPS 3.0软件36,37（http://gps.biocuckoo.org/online_full.php）预测目标蛋白序列中的Cdk1特异性磷酸化位点。点击此处链接可进行综合预测，包括二级结构和表面可及性的注释。
- 在软件中以FASTA格式输入蛋白序列。针对激酶特异性，勾选Serine/Threonine kinase、CMGC、CDK、CDC2、CDK1，取消勾选所有其他特异性。选择“medium”作为阈值，然后点击Submit按钮。
- 将预测得到的位点与Cdk1共识磷酸化位点（Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg）进行比对。
- 重要的是，检查磷酸化残基旁边是否存在脯氨酸（某些Cdk1底物可在最小位点（Ser/Thr-Pro）上被磷酸化）6
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结果
我们最近使用了一种 体外 激酶活性检测图1) 以鉴定含有经典核定位信号（cNLS）的 CENP-F 片段中 Cdk1 特异性的磷酸化位点10该信号在大部分间期过程中介导CENP-F的核内定位。在G2期，CENP-F以Cdk1依赖的方式从细胞核转运至细胞质。为了深入理解Cdk1调控CENP-F细胞定位的分子机制，我们利用iGPS服务器分析了CENP-F的序列，以预测Cdk1特异性的磷酸化位点36,37在CENP-F的cNLS区域内，预测存在三个Cdk1特异性的磷酸化位点，分别位于第3,042、3,045和3,048位氨基酸残基表1）。还预测到另一个Cdk1特异性磷酸化位点位于第3,007位残基（表1)10因此，我们推测C.......
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讨论
我们的 体外 激酶活性检测是一种非常强大的方法，可用于鉴定作为细胞周期主控因子的激酶Cdk1的分子靶标，该激酶调控多种重要的细胞过程。该方法可确定纯化的蛋白质是否为Cdk1的底物，并能够鉴定特异性的磷酸化位点。这有助于深入研究Cdk1通过磷酸化作用调控细胞过程的分子机制。
成功通过质谱鉴定磷酸化位点最关键的因 素是激酶反应中磷酸化的效率。各个磷酸化位点的磷酸化效率应尽可能高，最好达到100%。可通过增加Cdk1/cyclin B的用量并将孵育时间延长至16小时来实现。在计算所需Cdk1/cyclin B的量时，应考虑底物蛋白的摩尔浓度以及磷酸化位点的数量，当目标蛋白中含有多个磷酸化位点时，这一点尤为重要。还需注意， commercially available Cdk1/cyclin B的活性可能因批次不同而存在差异，且该激酶的活性可能迅速丧失。如果 体外 若磷酸化不成功，建议检测激酶的活性。作为故障排除的阳性对照， 体外 可以使用CENP-F（残基2,987-3,065）的磷酸化。作为阴性对照，应进行不添加Cdk1/细胞周期蛋.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢加州大学伯克利分校霍华德·休斯医学研究所的大卫·金（David King）博士提供质谱分析和有益的建议。感谢中国科学院上海生命科学研究院朱雪莲（Xuelian Zhu）博士提供全长CENP-F质粒。最后，感谢宾汉顿大学的苏珊·贝恩（Susan Bane）博士、布莱恩·卡拉汉（Brian Callahan）博士和克里斯托夫·格鲁维尔（Christof Grewer）博士提供仪器设备的使用权限。本研究由纽约州立大学研究基金会和纽约州立大学宾汉顿分校化学系资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2800 mL 带挡板的 Fernbach 培养瓶 | Corning | 44232XL | |
| 氨苄青霉素 | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
| 盐酸苄脒 | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| 瓶顶过滤器 | Corning | 431161 | |
| Cdk1/细胞周期蛋白 B 重组蛋白，人源，20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/细胞周期蛋白 B（替代来源） | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/细胞周期蛋白 B（替代来源） | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/细胞周期蛋白 B + 10× PK 缓冲液 | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F（残基 2987 – 3065）pGEX6P1 质粒 | 可应要求提供。 | ||
| 离心机：Heraeus Multifuge X3R，带制冷功能，配备 TX-1000 摆动转子 | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| 离心过滤装置：Amicon Ultra-15 离心过滤管，截留分子量 3 kDa，Ultracel-PL 膜 | EMD Millipore | UFC900324 | |
| 氯霉素 | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L-甲硫氨酸 | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| 一次性脱盐移液枪头：Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| 一次性层析柱，Econo-Pac 1.5 × 12 cm | Bio-Rad | 7321010 | |
| 二硫苏糖醇 | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 菌株 | EMD Millipore | 71403 | |
| 电喷雾电离傅里叶变换离子 | Bruker Amazon | Apex III | |
| 回旋共振质谱仪 | |||
| 电喷雾电离离子阱质谱仪 | Bruker Amazon | custom | |
| 固定角转子：Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC 系统：Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| 凝胶过滤柱：Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| 谷胱甘肽琼脂糖 | Pierce | 16101 | |
| 还原型谷胱甘肽 | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| 培养摇床：Multitron 摇床 | Infors | I10102 | |
| 异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| 卡那霉素 | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres 质粒 | 可应要求提供。 | ||
| LB 培养基（Luria Bertani 培养基） | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| 微量离心机 5418R，带制冷功能 | Eppendorf | 5401000013 | |
| 微量离心管（0.5 mL） | Eppendorf | 30121023 | |
| 微量离心管（1.5 mL） | Eppendorf | 30120086 | |
| 镍亲和凝胶：His-Select 镍亲和凝胶 | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 质粒 | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS 蛋白酶：PreScission 蛋白酶 | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag 丙烯酰胺 | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| 还原型谷胱甘肽 | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| 圆底离心管（Oakridge 管） | Fisher Scientific | 055291D | |
| 定点突变试剂盒：QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| 定点突变试剂盒 | |||
| 超声破碎仪：Branson S-250D 超声破碎仪 | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC 透析膜（截留分子量 6–8 kDa） | Spectrum Labs | 08 670B | |
| 摆动转子 TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
参考文献
- Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
- Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature.
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