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方法文章

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

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DOI：

10.3791/57674

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2018年5月3日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, State University of New York at Binghamton

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外 使用Cdk1进行激酶活性检测，可鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，从而确定该重要激酶的细胞内作用靶点。

摘要

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）是所有真核生物细胞周期的主要调控因子，可磷酸化约8%至13%的蛋白质组；然而，目前鉴定出的Cdk1靶点数量仍然较少，尤其是在人类细胞中。鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点具有重要意义，因为这些位点能够提供关于Cdk1如何调控细胞周期的机制性见解。细胞周期的调控对于染色体的准确分离至关重要，这一复杂过程中的缺陷会导致染色体异常和癌症。

此处，我们描述一种 体外 用于鉴定Cdk1特异性磷酸化位点的激酶实验。在该实验中，纯化的蛋白质被磷酸化 体外 通过市售的人源Cdk1/细胞周期蛋白B进行磷酸化。磷酸化成功与否通过SDS-PAGE确认，随后通过质谱鉴定磷酸化位点。我们还描述了可获得高纯度且均一的蛋白样品的纯化方案，适用于激酶活性检测；并介绍了用于功能验证所鉴定磷酸化位点的结合实验，该实验检测经典核定位信号（cNLS）与其核转运受体karyopherin α之间的相互作用。为辅助实验设计，我们综述了从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点的方法。这些方案共同构成了一种强有力的方法，可鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，并推动对Cdk1如何调控细胞周期的机制研究。由于该方法依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，尤其与细胞功能研究相结合时，能够获得可靠的结果。

引言

激酶是一类将磷酸基团从ATP转移至底物上的酶，可调控多种细胞过程。这种磷酸化修饰具有可逆性，反应迅速，可引入两个负电荷，并储存自由能，是细胞中最常见的翻译后修饰之一。Cdk1（也称为细胞分裂周期蛋白2同源物（cdc2））是所有真核生物细胞周期的主控调节因子1,2,3,4,5，据估计可磷酸化蛋白质组中8-13%的蛋白6,7。

尽管近期的蛋白质组学研究已鉴定出蛋白质中的许多磷酸化位点，但在大多数情况下，负责这些修饰的激酶仍未知。目前已知的Cdk1底物数量较少，尤其是在人类细胞中7。鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点具有重要意义，因为它能够推动机制性研究，阐明Cdk1如何调控细胞周期。细胞周期的调控对于精确的染色体分离和细胞分裂至关重要，多种细胞过程需协同进行以支持这一重要的生理功能。这些过程包括在有丝分裂开始前停止转录和翻译，以及细胞结构和组织发生显著的重组，例如核膜解体、染色体凝缩和有丝分裂纺锤体的组装。这些过程的失调或错误可导致癌症、出生缺陷或有丝分裂性细胞死亡。目前已开发出Cdk1的特异性抑制剂（如RO-3306）8，这些抑制剂为功能研究提供了有力工具，其中一些抑制剂已进入癌症治疗的临床试验阶段（详见9的综述）。

此处，我们描述了一种 体外 一种激酶活性检测方法，可用于鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点。在该实验中，使用商业化的人源Cdk1/细胞周期蛋白B复合物对纯化的靶蛋白进行磷酸化 体外底物的磷酸化会增加其分子量并添加两个负电荷；因此，成功的磷酸化可通过SDS-PAGE中蛋白质条带的上移来确认。随后通过质谱分析鉴定Cdk1特异性磷酸化位点 体外 磷酸化蛋白。为了辅助实验设计，我们还综述了可用于从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点的计算工具和参考文献。此外，我们描述了可获得高纯度且均一的蛋白样品的纯化方案，适用于激酶活性检测。最后，所鉴定出的磷酸化位点必须通过功能研究加以验证，本文介绍了一种简单的结合实验用于此目的。综合而言，这是一种非常强大的方法，能够鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，并推动对Cdk1如何调控细胞周期的机制研究。7,10,11由于该方法依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，并能获得可靠的结果。然而，对于所获得的磷酸化位点的功能验证 体外 建议采用这种方法，因为细胞具有其他调控机制，例如翻译后修饰、相互作用伴侣蛋白或细胞定位，这些机制可能使磷酸化位点对Cdk1的识别变得可及或不可及。

Cdk1 识别一个由（Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg）组成的共有序列磷酸化位点，其中 X 为任意氨基酸残基，丝氨酸或苏氨酸是磷酸化的位点。对于识别而言，+1 位置的脯氨酸尤为重要。此外，+2 或 +3 位置更倾向于存在碱性残基，大多数 Cdk1 特异性的磷酸化位点在 +3 位置含有一个 Lys 或 Arg6,12。

Cdk1的激活受到严格调控，并引发有丝分裂的启动1,2,3,4,5。总体而言，周期蛋白依赖性激酶的活性依赖于其与不同周期蛋白（在人类中包括周期蛋白A、B、C、D和E）的结合，这些周期蛋白在细胞周期中呈振荡性表达13。Cdk1在细胞周期中的表达水平保持恒定，其活性调控主要依赖于与调节亚基周期蛋白A和周期蛋白B的结合5,13,14,15，以及翻译后修饰。Cdk1/周期蛋白B复合物的形成为激酶的激活所必需5,14,15,16,17,18。在G2期，周期蛋白B在细胞质中被翻译并转运至细胞核，在那里与Cdk1结合5,14,15,16,17,18；然而，Cdk1/周期蛋白B复合物在Thr14和Tyr15位点被人类Cdk1抑制性激酶Myt1（膜结合的酪氨酸和苏氨酸特异性cdc2抑制激酶）和Wee1分别磷酸化，从而维持其失活状态19,20,21。在G2晚期，细胞分裂周期25磷酸酶（cdc25）对Thr14和Tyr15进行去磷酸化，从而激活Cdk1/周期蛋白B复合物的激酶活性，并触发有丝分裂的启动12,14,18,20,22,23。Thr161位点的磷酸化也是Cdk1/周期蛋白B激活所必需的，该过程由Cdk7（Cdk激活激酶，CAK）介导18。在后期，周期蛋白B的降解使Cdk1失活，从而允许细胞退出有丝分裂24,25。因此，Cdk1/周期蛋白B的激活是一个复杂的过程。本文所介绍的实验方案使用的是 commercially available Cdk1/周期蛋白B。在昆虫细胞中进行该复合物的重组表达时，其可在体内被内源性激酶激活in vivo14,20，并在纯化后仍保持活性。所获得的具有活性的重组人源Cdk1/周期蛋白B适用于体外激酶活性检测 in vitro kinase assays。

本文描述了一种用于鉴定人着丝粒蛋白F（CENP-F）中Cdk1特异性磷酸化位点的实验方案。10CENP-F 是一种着丝粒蛋白，在间期的大部分时间（G1 期和 S 期）位于细胞核内，并在 G2 期被转运至细胞质26,27,28 以Cdk1依赖性的方式10,11核定位由一个两部分组成的cNLS赋予26cNLS 由核转运因子 importin α 识别，在 importin β 和 RanGDP 的协同作用下，介导 cNLS 货物蛋白进入细胞核29G2期的核输出通过一种未知的输出途径实现10一旦CENP-F定位于细胞质中，它会被招募至核膜，并进而招募马达蛋白复合物动力蛋白（dynein）。30,31该通路以动力蛋白依赖的方式在有丝分裂纺锤体组装初期调控细胞核相对于中心体的位置，这对于有丝分裂进入的正确时序以及脑发育中的一个基本过程具有重要意义30,31,32从G2期开始，CENP-F也会组装到动粒中，在染色体的准确分离过程中发挥重要作用27,28,33,34,35这些通路的一个关键调控步骤是CENP-F在G2期依赖Cdk1的核输出10,11我们在此描述了一种用于鉴定CENP-F蛋白cNLS区域中Cdk1特异性磷酸化位点的实验方案。这些位点的磷酸化模拟突变会减缓CENP-F的核输入，表明Cdk1/细胞周期蛋白B通过磷酸化CENP-F的cNLS直接调控其细胞内定位。10.

总体而言，这 体外 激酶实验可用于鉴定激酶Cdk1的特异性底物。纯化的靶蛋白被磷酸化 体外 通过市售的Cdk1/细胞周期蛋白B复合物进行磷酸化，随后通过质谱法鉴定磷酸化位点。Cdk1特异性磷酸化位点的鉴定有助于揭示Cdk1调控细胞周期的分子机制。

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方案

1. 从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点

  1. 开始激酶实验前，分析目标蛋白序列中预测的Cdk1特异性磷酸化位点，并查阅文献以寻找已通过实验验证但激酶特异性未知的磷酸化位点。使用以下总结的工具、数据库和参考文献。
    1. 使用iGPS 3.0软件36,37（http://gps.biocuckoo.org/online_full.php）预测目标蛋白序列中的Cdk1特异性磷酸化位点。点击此处链接可进行综合预测，包括二级结构和表面可及性的注释。
    2. 在软件中以FASTA格式输入蛋白序列。针对激酶特异性，勾选Serine/Threonine kinase、CMGC、CDK、CDC2、CDK1，取消勾选所有其他特异性。选择“medium”作为阈值，然后点击Submit按钮。
    3. 将预测得到的位点与Cdk1共识磷酸化位点（Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg）进行比对。
    4. 重要的是，检查磷酸化残基旁边是否存在脯氨酸（某些Cdk1底物可在最小位点（Ser/Thr-Pro）上被磷酸化）6,12。此外，检查+2或+3位置是否含有碱性残基，其中大多数Cdk1特异性磷酸化位点在+3位置含有Lys或Arg6,12。
  2. 还需确认该位点是否可被识别，因为仅存在完整的共识序列并不足以支持Cdk1介导的磷酸化。
    1. 检查iGPS输出结果中的表面可及性和二级结构预测注释，以判断该位点是否被预测为可及；蛋白的N端和C端在多数情况下具有较高的灵活性，易于发生磷酸化。
    2. 若目标蛋白已有X射线晶体结构，可通过观察其在结构中的位置来评估潜在磷酸化位点的可及性。
  3. 利用UniProtKB/Swiss-Prot数据库38（http://www.uniprot.org）检索已通过实验验证但激酶特异性未知的磷酸化位点。
    1. 在搜索框中输入蛋白名称，点击Search按钮，选择正确的序列条目。磷酸化位点信息及其参考文献将在amino acid modifications部分中注释。
    2. 查找针对人源细胞系有丝分裂提取物的蛋白质组学研究7,39,40，这类研究特别有用，因为Cdk1在细胞周期G2期被激活。
  4. 使用NLSmapper识别双分型经典核定位信号（cNLS）（可选）。
    注意：对于在细胞质与细胞核之间穿梭的蛋白，一种常见的定位调控机制是Cdk1在双分型cNLS主基序的-1位点进行磷酸化。该磷酸化作用可抑制蛋白在G2期的核定位10,41,42,43。
    1. 对于此类穿梭蛋白，可通过NLSmapper43（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）在蛋白序列中识别cNLS。将蛋白序列以文本形式粘贴至序列输入框，设置评分阈值为5.0，并选择在entire region范围内搜索NLS。点击Predict NLS按钮。
    2. 将预测得到的cNLS与双分型cNLS的共识序列进行比对，后者由次要基序（Lys-Arg）、至少10个氨基酸的连接区以及主基序（Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg）组成，其中X为任意非带负电荷的残基。
    3. 检查预测的Cdk1磷酸化位点（*）是否位于连接区主基序的-1位点附近：Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg。
      注意：Cdk1在-1位点对双分型cNLS进行磷酸化已被证实是多种穿梭蛋白细胞定位调控的重要机制10,41,42,43。

2. 重组蛋白的表达 大肠杆菌

  1. 使用第 2.1.1-2.1.2 步骤中的表达质粒在 E. coli 中表达重组蛋白。
    1. 为构建人源 CENP-F（第 2,987 - 3,065 位氨基酸）表达载体，以全长 CENP-F 构建体（GenBank 登录号：U19769.1）为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增 DNA 片段获得插入片段。使用以下引物：AGTCGGGGATCCCAGCAATCTAAACAAGATTCCCG 和 AGTCGGCTCGAGTCATTATTCTGCAGGGTGAATACCACTCATG。
      注：全长人源 CENP-F 质粒由中华人民共和国中国科学院生物科学研究所朱博士（Dr. X. Zhu）慷慨提供。
      1. 将插入片段克隆至 pGEX6p1 载体的 BamHI 和 XhoI 限制性酶切位点中。使用该质粒表达 CENP-F（第 2,987-3,065 位氨基酸）的 N 端谷胱甘肽 S-转移酶（GST）融合蛋白。
        注：GST 标签可通过 PreScission 蛋白酶（下文简称 PS 蛋白酶）切除。
    2. 为构建人源karyopherin α 表达载体，以全长 karyopherin α2 cDNA 为模板（序列登录号 NM_002264.3），通过 PCR 扩增 DNA 片段获得插入片段（引物序列：GCACTACATATGTCCACCAACGAGAATGCTAATA 和 TCACGCCTCGAGTTATCAAAAGTTAAAGGTCCCAGGAGCC）。
      注：由于各亚型之间具有高度相似性，本文后续将该 karyopherin α2 构建体统称为 karyopherin α。
      1. 将插入片段克隆至 pET28a-pres 载体的 NdeI 和 XhoI 限制性酶切位点中。
        注：该载体为经修饰的 pET28a 载体，其中编码凝血酶切割位点的序列已被编码 PS 蛋白酶切割位点的序列取代。使用该质粒可表达带有 N 端 His6 标签的 karyopherin α 融合蛋白，且该 His6 标签可通过 PS 蛋白酶切除。
  2. 为构建靶蛋白的点突变体，使用定点突变试剂盒进行定点突变。
  3. 在 E. coli 中表达重组蛋白，用于后续纯化。
    1. 配制以下母液：50 mg/mL 卡那霉素（1:1,000 储存液）、35 mg/mL 氯霉素溶于 70% 乙醇（1:1,000）、100 mg/mL 氨苄青霉素（1:1,000）以及 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；1:5,000）。
    2. 对母液进行无菌过滤后，于 -20 °C 保存。IPTG 应避免反复冻融。
    3. 按照生产商说明书，将 1 µL 表达质粒转化至 50 µL 的 E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 感受态细胞中。
    4. 将菌液涂布于含氯霉素（35 µg/mL LB）和氨苄青霉素（100 µg/mL LB）的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上（用于 CENP-F 构建体），或含氯霉素和卡那霉素（50 µg/mL 培养液）的平板上（用于 karyopherin α 构建体）。于 37 °C 培养 12-20 小时。
    5. 挑取单菌落，接种至 50 mL 含相应抗生素的 LB 培养基中（参见步骤 2.3.4）。于 37 °C、160-180 rpm 摇床培养 12-20 小时，获得预培养物。
    6. 在 2,800 mL 挡板 Fernbach 三角瓶中准备 1 L LB 培养基。每份预培养物准备两个三角瓶，并进行高压灭菌。为保证通气，培养液体积不得超过三角瓶容积的三分之二。也可使用锥形瓶。
    7. 向每升冷却的 LB 培养基中加入抗生素（参见步骤 2.3.4）和 10 mL 经无菌过滤的 40%（w/v）葡萄糖溶液。每升 LB 培养基中加入 20 mL 预培养物。
      注：预培养物经 1:10 稀释后，其在 600 nm 处的吸光度应在 0.15-0.2 之间。
    8. 将三角瓶置于 37 °C、160-180 rpm 摇床中培养。定期测定细菌培养物在 600 nm 处的吸光度。当吸光度达到 0.5-0.6 时，加入 0.2 mM IPTG（每升 LB 培养基加入 200 µL 1 M 储存液）以诱导蛋白表达。
      注：必须在正确的吸光度下诱导细胞，通常需要 3-4 小时达到该阶段。
    9. 继续在 37 °C、160-180 rpm 摇床中培养 3 小时。通过离心收集细胞（15 分钟，4,100 × g，4 °C，水平转子）。弃去上清液。每升培养物用 20 mL GST 结合缓冲液（用于 CENP-F）或 His6 结合缓冲液（用于 karyopherin α）重悬菌体沉淀。将细胞于 -80 °C 保存。
      1. 提前配制 GST 结合缓冲液（10 mM Tris，25 °C 时 pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），0.5 mM EDTA）和 His6 结合缓冲液（10 mM Tris，25 °C 时 pH 8.0，250 mM NaCl，5 mM 咪唑，pH 8.0，5 mM β-巯基乙醇（BME））。

3. 通过谷胱甘肽亲和层析和凝胶过滤纯化重组蛋白

  1. 配制以下贮存液：1 M DTT（1:1,000 贮存液，用孔径为 0.2 µM 的滤器无菌过滤并脱气）；250 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF；用二甲基亚砜配制成 1:1,000 贮存液）。于 -20 °C 保存，避免反复冻融。
  2. 配制以下缓冲液，并将其冷却至 4 °C。
    1. 使用 25 °C 下 pH 8.0 的 10 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM DTT 和 0.5 mM EDTA 配制 GST 结合缓冲液。
    2. 将 10 mM 还原型谷胱甘肽（0.15 g/50 mL）溶解于含 25 °C 下 pH 8.0 的 50 mM Tris、150 mM NaCl 和 1 mM DTT 的缓冲液中，配制 GST 洗脱缓冲液。确认最终缓冲液的 pH 为 8.0，并在配制当天使用。
    3. 使用 25 °C 下 pH 7.5 的 20 mM Tris、60 mM NaCl 和 2 mM DTT 配制 凝胶过滤缓冲液。用瓶顶滤器（孔径 0.2 µM）对缓冲液进行无菌过滤。在真空（-6 psi）下搅拌脱气 15 分钟。
    4. 在使用当天向上述所有缓冲液中添加 DTT。
  3. 解冻第 2 节中含 CENP-F 构建体的细胞。用 GST 结合缓冲液将体积调至 40 mL。加入 1 mM DTT、0.25 mM PMSF、0.5 mM EDTA（0.5 M 贮存液，pH 8.0）、7 mg 盐酸苯甲脒（1 mM）和 40 mg D/L 蛋氨酸。
    注：为减少蛋白水解降解，除非另有说明，所有操作均应在 4 °C 下进行，最好在冷室中完成。细胞、裂解物和纯化蛋白组分始终置于冰上，并添加蛋白酶抑制剂。为防止半胱氨酸和蛋氨酸残基氧化，实验当天加入 DTT 和蛋氨酸等还原剂。为减少蛋白水解降解，操作应迅速进行。
  4. 裂解细胞，方法如下：将裂解液倒入玻璃烧杯并浸入冰水浴中。对培养物进行超声处理（总时长 1 分 40 秒，输出/振幅为 100 W（50%），脉冲 10 秒，间歇 10 秒）。超声后加入 250 µM PMSF。观察细胞裂解液，应变得透明且不再黏稠。
  5. 澄清裂解液：在 4 °C 下以 12,000–40,000 × g 离心 25 分钟。使用圆底离心管和固定角转子。
  6. 进行平衡：将 2 mL 谷胱甘肽琼脂糖 1:1 悬浮液加入一次性层析柱中。所得柱体积为 1 mL。用 25 mL 超纯水和 25 mL GST 结合缓冲液洗涤柱子。
  7. 进行结合操作：在冷室或冷箱中操作，将裂解液从沉淀物上清出。用 0.2 µm 孔径滤器过滤裂解液，并将其倒入已封底的柱子中。盖上柱子，于 4 °C 轻柔振荡孵育 30 分钟。
  8. 进行洗涤：将柱子置于支架上，待树脂沉降后收集穿流液。用 25 mL GST 结合缓冲液洗涤柱子两次。
  9. 通过蛋白水解切割进行洗脱
    1. 封住柱子。加入 400 µL GST 结合缓冲液和 250 µL PS 蛋白酶（2 mg/mL 贮存液，活性为 1,000 U/mg，可为实验室纯化或购买，参见材料表）。
    2. 盖上柱子，轻轻摇动使树脂在缓冲液中重悬。于 4 °C 孵育 16–20 小时。然后加入 4 mL GST 结合缓冲液，将经蛋白水解切割的 CENP-F 片段从柱子中洗脱下来。
  10. 谷胱甘肽洗脱
    1. 封住柱子，加入 4 mL GST 洗脱缓冲液（4 倍柱体积），孵育 10 分钟以洗脱结合的 GST 标签。收集洗脱液。按照制造商说明在重复使用前对柱子进行再生。
  11. 在 16% 丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分析 PS 蛋白酶洗脱组分和谷胱甘肽洗脱组分。以 25 V/cm 电泳 45 分钟。用考马斯亮蓝染色凝胶。PS 蛋白酶组分应含有纯化的 CENP-F 片段，而谷胱甘肽组分应含有切割下来的 GST 标签。通过凝胶观察评估蛋白水解切割效率。
  12. 浓缩 PS 蛋白酶洗脱液：使用截留分子量为 3 kDa 的离心过滤装置（参见材料表）将体积浓缩至 0.5 mL。将洗脱液加入过滤器的上室，于 4 °C 以 4,100 × g（摆动转子）离心 10–15 分钟为一个增量，直至样品浓缩完成。每个增量后用移液器混匀。
  13. 将合适的凝胶过滤柱（购买信息参见材料表）连接至快速蛋白液相色谱（FPLC）系统，并用 1 倍柱体积的凝胶过滤缓冲液进行平衡。
  14. 将浓缩后的 CENP-F 片段在微量离心机中离心（20 分钟，21,700 × g，4 °C）。将样品上样至柱子，并用 1 倍柱体积的凝胶过滤缓冲液进行洗脱。收集 0.6 mL 的组分。
    注：凝胶过滤缓冲液已优化，适用于后续激酶活性测定。测试目标蛋白在此缓冲液中的稳定性。若蛋白不稳定，可尝试增加氯化钠浓度。
  15. 通过 SDS-PAGE（步骤 3.11）分析峰组分。合并含有纯 CENP-F 片段的峰组分。将纯化的 CENP-F 片段浓缩至 3.3 mg/mL（步骤 3.12）。通过 SDS-PAGE（步骤 3.11）分析纯化的 CENP-F 片段。
  16. 蛋白浓度测定
    1. 将样品用超纯水稀释 1:100，置于石英微量比色皿中。在分光光度计中记录 220–300 nm 波长范围的光谱。
      注：蛋白浓度 c（mg/mL）由以下公式计算：
      用于浓度计算的吸光度公式，c=(A228.5-A234)×稀释倍数/3.14，光谱法。
  17. 将纯化蛋白以 50 µL 分装至 0.5 mL 微量管中，并在液氮中速冻。于 -80 °C 保存。

4. 通过镍-NTA亲和层析纯化重组蛋白

  1. 配制以下缓冲液并冷却至 4 °C.
    1. 制备 他的6结合缓冲液 使用 10 mM Tris（pH 8.0）于 25 °C，250 mM NaCl，5 mM 咪唑（pH 8.0），5 mM BME。BME 需在使用当日加入所有缓冲液中。
    2. 制备 他的6-洗涤缓冲液 与His相同的方式6结合缓冲液，但使用 20 mM 咪唑。
    3. 制备 他的6-洗脱缓冲液 以与结合缓冲液相同的方式操作，但使用 150 mM 咪唑。
  2. 解冻细胞 来自第2部分含有karyopherin α构建体的组分，并用His缓冲液调整体积至40 mL6-结合缓冲液。加入 5 mM BME、0.250 mM PMSF、7 mg 盐酸苯甲脒（1 mM）和 40 mg D/L-蛋氨酸。
    1. 按照步骤 3.4-3.8 所述操作，但作如下修改：使用 His6-结合缓冲液替代 GST-结合缓冲液用于所有步骤。不使用谷胱甘肽琼脂糖，改为使用 4 mL 镍亲和凝胶（参见 材料表）制备层析柱，其柱体积为 2 mL。
      注意：镍亲和柱与DTT和EDTA不兼容。可使用Ni亲和凝胶替代镍亲和凝胶，2+-氮川三乙酸（NTA）琼脂糖可用于纯化，但洗脱缓冲液中的咪唑浓度需提高至250 mM（参见 材料表).
  3. 洗涤 含8 mL His的柱子6-洗涤缓冲液。
  4. 洗脱核转运蛋白α 使用12 mL的His6-elution 缓冲液，并通过 SDS-PAGE 分析洗脱液（步骤 3.11）。
  5. 添加 250 µL PS蛋白酶 （步骤 3.9）向洗脱液中加入并置于 16–20 小时，于 4 °C. 同时，将洗脱液用 1 L 的 His 缓冲液透析两次6使用截留分子量为6-8 kDa的透析膜，在结合缓冲液中透析2-20小时。
  6. 按照制造商说明再生镍亲和凝胶柱。用25 mL His缓冲液平衡柱子6结合缓冲液。将透析后的蛋白质加入柱中并进行结合 结合步骤 如步骤 3.7 中所述
  7. 收集流穿液，其中含有纯化的karyopherin α（带有His6-标签被切除），并用额外的4 mL His缓冲液洗脱剩余的蛋白6结合缓冲液。合并这些组分，然后用 12 mL 的 His 洗脱柱子6-洗脱缓冲液。该组分含有杂质。
  8. 分析第4.4-4.5步获得的未切割和已切割的karyopherin α，以及本步骤的两个洗脱组分 SDS-PAGE （步骤 3.11）以评估 His 的效率6标签切割与纯度
  9. 浓缩 karyopherin α 至 8 mg/mL 并 闪冻 在液氮中（步骤 3.15-3.17）。

5. 体外 使用Cdk1/细胞周期蛋白B进行激酶活性检测

  1. 体外激酶实验
    注意：激酶到货后，应分装成小份，用液氮速冻，并于 -80 °C 保存。请在6个月内使用。尽管Cdk1的分子量为34 kDa，cyclin B为48 kDa，但在SDS-PAGE上cyclin B的表观分子量约为60 kDa。
    1. 配制10× PK缓冲液（随激酶提供）：使用0.5 M Tris-HCl、0.1 M MgCl2、1 mM EDTA、20 mM DTT、0.1% Brij 35，调节pH至7.5（25 °C）。
    2. 配制10× ATP储存液：将ATP溶于1× PK缓冲液中，制成4 mM溶液，并检测其最终pH值。分装后于-20 °C保存，避免反复冻融。
    3. 在0.5 mL微量离心管中混合以下组分：40 µL CENP-F片段（浓度为3.3 mg/mL，或400 µM）、6 µL 10× PK缓冲液、3 µL超纯水、6 µL 10× ATP储存液和5 µL人源Cdk1/cyclin B（1 µg，100 U）。
      注意：CENP-F片段的摩尔质量为8.6 kDa，含有四个Cdk1特异性的磷酸化位点。对于新的底物，应根据蛋白的摩尔浓度及磷酸化位点数量调整激酶的使用浓度。人重组Cdk1/cyclin B储存液的活性为20,000 U/mL，比活性为1,000,000 U/mg。1 U定义为在30 °C条件下，1分钟内催化1 pmol磷酸基团转移至Cdk1肽底物PKTPKKAKKL-NH2（50 µM）所需的Cdk1/cyclin B量（见材料表）。
    4. 设置一个不含Cdk1/cyclin B的对照反应。将反应体系置于30 °C水浴中孵育1–16小时。
  2. 取2.5 µL激酶反应体系及2.5 µL对照样品，通过SDS-PAGE（步骤3.11）进行分析，使用含16%丙烯酰胺的凝胶。为提高分辨率，可延长电泳时间。
  3. 向剩余的激酶反应体系（及对照）中加入等体积的6 M盐酸胍溶液，使终浓度达到3 M。将这些样品用于质谱分析（第6节），以鉴定磷酸化位点；也可将样品送至质谱平台进行分析，随后进行功能验证（第7节）。
    注意：在后续质谱分析中，各磷酸化位点的磷酸化效率应尽可能高，最好达到100%，否则无法准确定位磷酸化位点。为显著提高磷酸化效率，可增加Cdk1/cyclin B的用量，并将孵育时间延长至16小时，也可将ATP浓度加倍。
  4. 如需排除故障，可将CENP-F（残基2,987–3,065）作为阳性对照进行体外激酶实验。应使用新鲜批次且活性较高的Cdk1/cyclin B。

6. 通过质谱法鉴定 Cdk1 特异性磷酸化位点

  1. 为使蛋白质样品变性并脱盐，进行微孔柱处理 反相液相色谱 使用 PLRP300 柱。
  2. 为了获得CENP-F片段中磷酸化位点的数量，分析完整片段 体外 磷酸化 CENP-F 84-聚体 电喷雾电离离子阱质谱法 (ESI-ITMS)44,45.
  3. 为了评估 CENP-F 的磷酸化氨基酸位点位置， 制备胰蛋白酶消化液 的 体外 磷酸化CENP-F蛋白样品。使用脱盐移液吸头对胰蛋白酶消化产物进行脱盐。
  4. 通过分析CENP-F的胰蛋白酶消化产物 电喷雾电离傅里叶变换离子回旋共振质谱（ESI-FTICR MS）. 在 ESI-FTICR 带有累积时间的质谱仪 169 µs.
    注意：电喷雾电离傅里叶变换离子回旋共振质谱（ESI-FTICR MS）测定的质量精度在 0.005 amu 以内。为量化每种磷酸化物种相对于总蛋白量的比例，需测定质谱图中各峰的高度。

7. 功能验证：通过分析型尺寸排阻色谱检测磷酸化模拟突变对蛋白质-蛋白质相互作用的影响

注意：为了对鉴定出的 Cdk1 特异性磷酸化位点进行功能验证，通过将鉴定出的磷酸化位点替换为天冬氨酸，构建了CENP-F 片段的磷酸化模拟突变体。天冬氨酸所带的负电荷可模拟磷酸化的效应。构建了 CENP-F 片段（残基 2,987-3,065）的 S3048D 突变体。

  1. 为进行功能验证，比较野生型和磷酸化模拟的 CENP-F 片段与karyopherin α的结合能力。采用分析型凝胶过滤作为结合实验方法。在分析型凝胶过滤中，通过谷胱甘肽亲和层析纯化CENP-F 片段（步骤 3.1–3.12），并跳过凝胶过滤步骤。
  2. 将蛋白浓缩至 5–6 mg/mL。用液氮速冻蛋白分装样品（步骤 3.15–3.17）。
  3. 混合纯化的 CENP-F 片段（0.1 mg，野生型或 S3048D 变体）与纯化的 karyopherin α（0.7 mg），按 1:1 的摩尔比进行。用凝胶过滤缓冲液将样品体积调至 200 µL。冰上孵育 30 分钟，经 0.2 µm 孔径滤膜过滤样品，并通过离心（25 分钟，21,700 × g，4 °C）澄清样品。
  4. 通过尺寸排阻色谱分离样品（步骤 3.13–3.14）。使用含 20 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl 和 2 mM DTT 的凝胶过滤缓冲液。所有样品均在相同条件下进行分析型凝胶过滤实验。
  5. 按照制造商说明，使用已知摩尔质量的分子量标准品对分析型凝胶过滤柱进行校准。
  6. 通过 16% SDS-PAGE（步骤 3.11）分析洗脱组分。

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结果

我们最近使用了一种 体外 激酶活性检测图1) 以鉴定含有经典核定位信号（cNLS）的 CENP-F 片段中 Cdk1 特异性的磷酸化位点10该信号在大部分间期过程中介导CENP-F的核内定位。在G2期，CENP-F以Cdk1依赖的方式从细胞核转运至细胞质。为了深入理解Cdk1调控CENP-F细胞定位的分子机制，我们利用iGPS服务器分析了CENP-F的序列，以预测Cdk1特异性的磷酸化位点36,37在CENP-F的cNLS区域内，预测存在三个Cdk1特异性的磷酸化位点，分别位于第3,042、3,045和3,048位氨基酸残基表1）。还预测到另一个Cdk1特异性磷酸化位点位于第3,007位残基（表1)10因此，我们推测C...

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讨论

我们的 体外 激酶活性检测是一种非常强大的方法，可用于鉴定作为细胞周期主控因子的激酶Cdk1的分子靶标，该激酶调控多种重要的细胞过程。该方法可确定纯化的蛋白质是否为Cdk1的底物，并能够鉴定特异性的磷酸化位点。这有助于深入研究Cdk1通过磷酸化作用调控细胞过程的分子机制。

成功通过质谱鉴定磷酸化位点最关键的因 素是激酶反应中磷酸化的效率。各个磷酸化位点的磷酸化效率应尽可能高，最好达到100%。可通过增加Cdk1/cyclin B的用量并将孵育时间延长至16小时来实现。在计算所需Cdk1/cyclin B的量时，应考虑底物蛋白的摩尔浓度以及磷酸化位点的数量，当目标蛋白中含有多个磷酸化位点时，这一点尤为重要。还需注意， commercially available Cdk1/cyclin B的活性可能因批次不同而存在差异，且该激酶的活性可能迅速丧失。如果 体外 若磷酸化不成功，建议检测激酶的活性。作为故障排除的阳性对照， 体外 可以使用CENP-F（残基2,987-3,065）的磷酸化。作为阴性对照，应进行不添加Cdk1/细胞周期蛋...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢加州大学伯克利分校霍华德·休斯医学研究所的大卫·金（David King）博士提供质谱分析和有益的建议。感谢中国科学院上海生命科学研究院朱雪莲（Xuelian Zhu）博士提供全长CENP-F质粒。最后，感谢宾汉顿大学的苏珊·贝恩（Susan Bane）博士、布莱恩·卡拉汉（Brian Callahan）博士和克里斯托夫·格鲁维尔（Christof Grewer）博士提供仪器设备的使用权限。本研究由纽约州立大学研究基金会和纽约州立大学宾汉顿分校化学系资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2800 mL 带挡板的 Fernbach 培养瓶Corning44232XL
氨苄青霉素Gold BiotechnologyA-301-25
ATPFisher ScientificBP413-25
盐酸苄脒Millipore SigmaB6506-25
瓶顶过滤器Corning431161
Cdk1/细胞周期蛋白 B 重组蛋白，人源，20,000 U/mLNew England BiolabsP6020
Cdk1/细胞周期蛋白 B（替代来源）EMD Millipore14-450
Cdk1/细胞周期蛋白 B（替代来源）InvitrogenPV3292
Cdk1/细胞周期蛋白 B + 10× PK 缓冲液New England BiolabsP6020
CENP-F（残基 2987 – 3065）pGEX6P1 质粒可应要求提供。
离心机：Heraeus Multifuge X3R，带制冷功能，配备 TX-1000 摆动转子Thermo Scientific10033-778
离心过滤装置：Amicon Ultra-15 离心过滤管，截留分子量 3 kDa，Ultracel-PL 膜EMD MilliporeUFC900324
氯霉素Gold BiotechnologyC-105-100
D/L-甲硫氨酸Agros Organics / Fisher125650010
一次性脱盐移液枪头：Zip tipsMillipore SigmaZTC18S008
一次性层析柱，Econo-Pac 1.5 × 12 cmBio-Rad7321010
二硫苏糖醇Gold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 菌株EMD Millipore71403
电喷雾电离傅里叶变换离子Bruker AmazonApex III
回旋共振质谱仪
电喷雾电离离子阱质谱仪Bruker Amazoncustom
固定角转子：Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
FPLC 系统：Äkta Pure FPLCGE Healthcare29032697
凝胶过滤柱：Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
谷胱甘肽琼脂糖Pierce16101
还原型谷胱甘肽Millipore SigmaG4251-50g
培养摇床：Multitron 摇床InforsI10102
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷Gold BiotechnologyI2481C50
卡那霉素Gold BiotechnologyK-120-25
karyopherin α pet-28a pres 质粒可应要求提供。
LB 培养基（Luria Bertani 培养基）Fisher ScientificBP1426-2
微量离心机 5418R，带制冷功能Eppendorf5401000013
微量离心管（0.5 mL）Eppendorf30121023
微量离心管（1.5 mL）Eppendorf30120086
镍亲和凝胶：His-Select 镍亲和凝胶Millipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 质粒Millipore SigmaGE28-9546-48
苯甲基磺酰氟Gold BiotechnologyP470-10
PS 蛋白酶：PreScission 蛋白酶GE Healthcare27084301
Phos-tag 丙烯酰胺Wako Pure Chem. Ind.304-93521
还原型谷胱甘肽Millipore SigmaG4251-50g
圆底离心管（Oakridge 管）Fisher Scientific055291D
定点突变试剂盒：QuikChange LightningAgilent210518
定点突变试剂盒
超声破碎仪：Branson S-250D 超声破碎仪Branson15 338 125
Spectra/Por 1RC 透析膜（截留分子量 6–8 kDa）Spectrum Labs08 670B
摆动转子 TX-1000Thermo Scientific10033-778

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