本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。
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摘要
摘要
一种体细胞类型转分化为另一种体细胞类型在人类疾病建模与治疗方面具有巨大潜力。先前研究表明，通过过表达包括GATA4、Hand2、Mef2c和Tbx5在内的心脏发生相关转录因子，小鼠胚胎、皮肤及心脏成纤维细胞均可被重编程为具有功能的诱导性心肌样细胞（iCMs） 体外 和 体内然而，以往的研究显示效率相对较低。为了在损伤后恢复心脏功能，必须阐明调控心脏重编程的机制，以提高诱导心肌细胞（iCMs）的重编程效率和成熟度。
我们先前已证明，抑制促纤维化信号通路可显著提高重编程效率。本文中，我们详细阐述了实现高达60%重编程效率的方法。此外，我们还描述了多种用于定量评估重编程效率及重编程后成纤维细胞成熟度的方法，包括流式细胞术、免疫荧光成像和钙成像。通过采用本文详述的实验方案，可开展机制性研究，以确定心脏重编程的正向与负向调控因子。此类研究有望鉴定出可靶向干预的信号通路，从而提升重编程效率与细胞成熟度，最终为治疗人类心脏病提供新型细胞疗法。
引言
缺血性心脏病是美国的主要死亡原因1。每年约有80万美国人经历首次或复发性心肌梗死（MI）1。心肌梗死后，心肌细胞（CMs）死亡以及由活化的心脏成纤维细胞沉积的心脏纤维化会损害心脏功能2,3。由于成年心肌细胞再生能力较差，心肌梗死后心力衰竭的进展在很大程度上是不可逆的4,5。尽管目前的临床治疗可延缓疾病进展并降低未来心脏事件的风险6,7,8,9，但由于无法在梗死后再生心肌细胞，尚无任何疗法能够逆转疾病的进展10。新型细胞疗法正在兴起，用于心肌梗死后患者的治疗。然而令人失望的是，迄今为止在心肌梗死后向心脏输送干细胞的临床试验均未显示出明确的再生潜力11,12,
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方案
所有需要使用动物的实验均经科罗拉多大学丹佛分校安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会批准。
1. 胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离
- 购买E13天的C57BL/6妊娠小鼠，进行隔夜运输。
- 根据批准的IACUC方案对母体实施安乐死（例如：约1.3 L/min CO₂）2 直到动物看似死亡后，再进行颈椎脱位
- 用70%乙醇喷洒母鼠并打开腹腔。取出含有胚胎的子宫角，置于含无菌PBS的10 cm培养皿中。
- 在胚囊上做切口以释放胚胎。将胚胎转移至含有无菌PBS的洁净10 cm培养皿中，充分冲洗。
- 在肝脏下方切断躯体，弃去头部和上半身。取出内脏器官并弃去。将剩余组织转移至含无菌PBS的洁净10 cm培养皿中，并将培养皿移至生物安全等级1级或2级操作台。将所有胚胎的组织合并于一个洁净干燥的10 cm培养皿中，切碎成细小组织块。
- 向切碎的胚胎中加入6 mL 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA，用移液器反复吹打数次以分散组织。在37 ˚C、5% CO₂条件下孵育40分钟。2.
- 在生长培养基中重悬细胞（表1根据收获的胚胎数量调整培养基体积。通常，每1.2个胚胎使用约25 mL培养基。
- 在15 cm培养皿中接种25 mL重悬细胞。24小时后，吸除培养基，每皿加....
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结果
采用上述重编程策略及图1B所示方法，我们在GHMT2m转导后第9天通过流式细胞术定量发现，约70%的细胞表达心肌肌钙蛋白T，约55%的细胞表达心肌α-肌动蛋白（图2A和B）。此外，在转导后第14天，大多数细胞表达心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、心肌α-肌动蛋白以及缝隙连接标志物Connexin 43（图2C和D）。高倍成像显示，细胞形成了清晰的肌节结构，并在相邻细胞之间形成缝隙连接（白色箭头，图2D）。此外，iCMs表现出自发性收缩及钙瞬变，表明其具有功能性（图3A–C和视频1）。
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讨论
本研究提出了一种高效策略，通过递送GHMT2m重编程因子并联合抑制促纤维化信号通路，直接将成纤维细胞重编程为功能性诱导心肌细胞（iCMs）。利用流式细胞术、免疫荧光成像、钙成像和搏动细胞计数，我们证明该方案中大多数细胞成功完成了重编程，并获得了心肌细胞谱系命运。我们先前已证实，加入抗纤维化化合物（包括TGF-β I型受体抑制剂A-83-01）后，相较于仅转导GHMT2m，搏动性iCMs的数量可提高约6倍，表明促纤维化信号是心脏重编程过程中一种强烈的内源性屏障。因此，该系统可用于药物筛选，以研究调控心肌发生的机制；在A-83-01基础上添加小分子化合物，可能揭示心肌发生的负调控因子；相反，在仅使用GHMT2m的基础上添加小分子化合物，则可能阐明心肌发生的正调控因子。解析这些正负调控因子调控心肌细胞分化的机制，将有助于更深入理解心肌发生过程，并推动更高效的心肌细胞重编程与成熟方案的建立。
许多变量会影响重编程效率。我们发现，细胞接种密度对PE细胞中逆转录病毒颗粒的产生以及MEF细胞对所有重编程因子的有效摄取均有显著影响。此外，传代次数也可能影响这些参数。为确保病毒颗粒的最佳产生，应在P.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了博特彻基金会韦伯-沃林生物医学研究计划、美国心脏协会科学家发展基金（13SDG17400031）、科罗拉多大学医学院杰出早期职业学者计划、科罗拉多大学心脏病学部Barlow Nyle捐赠基金以及美国国立卫生研究院R01HL133230（资助对象：K.S.）的支持。A.S.R. 获得了美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心科罗拉多临床与转化科学奖（TL1TR001081）以及科罗拉多大学纤维化研究联盟博士前奖学金的资助。 & 翻译（CFReT）。本研究还得到了癌症中心支持基金（P30CA046934）、皮肤疾病研究核心基金（P30AR057212）以及科罗拉多大学安舒茨医学校区流式细胞术核心实验室的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 小鼠 | Charles River's Laboratory | 027 | 用于 MEF 分离 |
| Platinum E (PE) 细胞 | Cell Biolabs, INC | RV-101 | 用于逆转录病毒生产 |
| DMEM 高糖培养基 | Gibco | SH30022.FS | iCM、PE 和生长培养基的组分 |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | iCM 培养基的组分 |
| 胎牛血清 | Gemini | 100106 | iCM、PE 和生长培养基的组分 |
| 供体马血清 | Gemini | 100508 500 | iCM 培养基的组分 |
| MEM 必需氨基酸，50X | Life Technologies | 11130051 | iCM 培养基的组分 |
| 丙酮酸钠溶液，100X | Life Technologies | 11360070 | iCM 培养基组分及用于钙成像 |
| MEM 非必需氨基酸，100X | Life Technologies | 11140050 | iCM 培养基的组分 |
| MEM 维生素溶液，100X | Life Technologies | 11120-052 | iCM 培养基的组分 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Gibco | 41400045 | iCM 培养基的组分 |
| B27 | Gibco | 17504-044 | iCM 培养基的组分 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | iCM、PE 和生长培养基的组分 |
| GlutaMAX（L-谷氨酰胺补充剂） | Gibco | 35050-061 | iCM、PE 和生长培养基的组分 |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | PE 培养基的组分 |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | Life Technologies | A11138-03 | PE 培养基的组分 |
| 0.25% 胰蛋白酶/EDTA | Gibco | 25200-056 | 用于从培养皿中解离细胞 |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | 处理细胞以抑制 TGF-β 信号通路——促进高效重编程。使用浓度为 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | 用于 A-83-01 的稀释和储存，以及冻存培养基的组分 |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | 用于包被培养皿以接种 MEF |
| FuGENE 6 转染试剂 | Promega | E2692 | 转染试剂 |
| Opti-MEM 减血清培养基 | Gibco | 11058-021 | 转染试剂 |
| pBabe-X Myc-GATA4 | 含有重编程因子的质粒 | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | 含有重编程因子的质粒 | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | 含有重编程因子的质粒 | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | 含有重编程因子的质粒 | ||
| pBabe-X miR-1 | 含有重编程因子的质粒 | ||
| pBabe-X miR-133 | 含有重编程因子的质粒 | ||
| pBabe-X GFP | 含有重编程因子的质粒 | ||
| Polybrene（六亚甲基双胍溴化物） | Sigma | H9268-5G | 用于病毒感染诱导。使用浓度为 6 µg/mL |
| 真空滤器 + 瓶子（0.22 µm 孔径） | Nalgene | 569-0020 | 用于过滤培养基 |
| 注射器 | Bd Vacutainer Labware | 309654 | 用于病毒过滤 |
| 0.45 µm 滤膜 | Celltreat | 229749 | 用于病毒过滤 |
| 70 µm 细胞筛 | Falcon | 352350 | 用于 MEF 分离和流式细胞术 |
| Cytofix/Cytoperm 溶液 | BD | 554722 | 用于流式细胞术前细胞的固定和通透 |
| perm/wash 缓冲液 | BD | 554723 | 用于流式细胞术中细胞的洗涤 |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | 用于细胞洗涤 |
| 牛血清白蛋白 | VWR | 0332-100g | 用于流式细胞术和钙成像 |
| 山羊血清 | Sigma | G9023 | 用于流式细胞术前细胞的封闭 |
| 驴血清 | Sigma | D9663-10mg | 用于流式细胞术前细胞的封闭 |
| 小鼠肌钙蛋白 T | Thermo Scientific | ms-295-p | 免疫荧光 1:400，流式细胞术 1:200 |
| 小鼠 α-辅肌动蛋白 | Sigma | A7811L | 免疫荧光 1:400，流式细胞术 1:200 |
| 兔 Connexin 43 | Sigma | C6219 | 免疫荧光 1:400 |
| 兔肌钙蛋白 I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 免疫荧光 1:400 |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 免疫荧光 1:10000 |
| Alexa 488，兔二抗 | Life Technologies | A-11034 | 免疫荧光 1:800 |
| Alexa 555，小鼠二抗 | Life Technologies | A-21422 | 免疫荧光 1:800 |
| Alexa 647，小鼠二抗 | Life Technologies | A-31571 | 流式细胞术 1:200 |
| 27 色 ZE5 流式细胞仪 | Bio-RAD | 用于 FACS | |
| 多聚甲醛 | sigma | P6148-500mg | 用于免疫荧光前细胞固定 |
| 曲拉通 X-100 | Promega | H5142 | 用于免疫荧光前细胞通透 |
| EVOS™ FL 彩色成像系统 | Thermo Scientific | AMEFC4300 | 用于免疫荧光 |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | 用于钙成像 |
| KCl | VWR | 395 | 用于钙成像 |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | 用于钙成像 |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | 用于钙成像 |
| 葡萄糖 | sigma | G7528-250g | 用于钙成像 |
| HEPES | sigma | H4034-500g | 用于钙成像 |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | 用于钙成像 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | 用于钙成像 |
| 硝苯地平 | Sigma | N7634-1G | 用于干扰 iCM 中的钙瞬变——使用浓度为 10 µM |
| 异丙肾上腺素 | sigma | I6504-1g | 用于增加 iCM 中钙瞬变的数量——使用浓度为 1-2 µM |
| Marianas 旋转盘共聚焦显微镜 | 3i | 用于钙成像 | |
| 乙醇 | Decon Laboratories | 2801 | |
| 次氯酸钠溶液 | Clorox | ||
| 50 mL 锥形管 | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL 锥形管 | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm 细胞培养皿 | Falcon | 353025 | |
| 10 cm 细胞培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 60 mm 细胞培养皿 | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 孔细胞培养板 | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 孔细胞培养板 | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 孔细胞培养板 | GREINER BIO-ONE | 662160 |
参考文献
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D.
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