本文介绍了一种通过填充工程化胶原移植物来修复长达1.5 cm肌腱缺损的体外（in vitro）和原位（in situ）实验方案。该方法采用改良的缝合技术，在移植物成熟并整合入宿主组织之前承担机械负荷。
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本文内容
摘要
摘要
使用肌腱移植物对外科治疗大型肌腱缺损具有挑战性，因为可供识别和使用的供体部位数量有限。目前，此类缺损常采用自体、同种异体、异种或人工肌腱移植物进行修复，但由于尺寸差异，临床上用于固定这些移植物的方法未必适用于动物模型。为了评估新型生物材料或研究由Ⅰ型胶原构成的组织工程肌腱，我们开发了一种改良的缝合技术，以帮助维持工程化肌腱与宿主肌腱断端的对齐。然而，这些移植物的力学性能仍低于天然肌腱。为了将工程化肌腱整合到具有临床相关性的负荷修复模型中，我们采用了一种卸载组织工程肌腱移植物的策略，以促进其成熟与整合 体内 直至形成力学性能良好的新生肌腱。我们描述了使用I型胶原组织工程肌腱构建物整合的技术。
引言
肌腱断裂可能由外在因素引起，例如创伤性撕裂或肌腱承受过度负荷。由于肌腱修复部位会受到外部张力作用，大多数肌腱修复技术均不可避免地形成间隙。目前，肌腱缺损或间隙通常采用自体、同种异体、异种或人工移植物进行填充，但这些移植物的来源有限，且供体部位可能带来并发症。
利用胶原等天然聚合物通过组织工程技术构建肌腱移植物具有显著优势，即具备良好的生物相容性，并可提供促进细胞整合的关键细胞外基质（ECM）成分。然而，由于缺乏纤维的定向排列，所构建的工程化肌腱（ET）在机械性能上仍逊于天然肌腱。为提升力学性能较差的胶原材料，已采用多种方法，包括真空条件下的物理交联、紫外辐射以及脱水热处理等。1此外，通过核黄素的化学交联，酶法和非酶法均提高了胶原蛋白的密度及其杨氏模量 体外2,3然而，加入交联剂会降低胶原蛋白的生物相容性，研究显示其力学性能发生33%的改变，细胞活力下降40%3,4,5通过循环加载可获得逐渐累积的对准性和机械强度6；然而，这可以通过高效的方式获得 in 体内....
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方案
注意：实验设计和伦理审批由伦敦大学学院（UCL）机构审查委员会（IRB）批准。所有实验均按照英国内政部规定以及《1986年动物（科学程序）法案》的要求进行，并遵循欧洲指令2010/63/EU（2013年修订版）的立法规定。实验兔由指定兽医外科医生（NVS）定期检查，并由指定动物护理与福利官员（NACWO）每日检查两次（依据内政部的指南和规定）。在实施安乐死前，动物未表现出任何疼痛迹象。
1. 组织工程肌腱（ET）移植物的制备
- 制备胶原蛋白水凝胶时，加入4 mL大鼠尾部I型胶原单体溶液（2.15 mg/mL，溶于含0.6%乙酸并含有0.2% w/v总蛋白的溶液中）和500 µL 10倍浓度的最低必需培养基。用5 M和1 M氢氧化钠滴定中和，并加入500 µL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 将5 mL该溶液倒入定制的矩形金属模具（33 mm × 22 mm × 10 mm，120 g重量）中（图1）。将模具置于37 °C、5% CO2的CO2培养箱中孵育15分钟，以促进基质组装19。
2. 移植物的制备
- 聚合完成后，将胶原蛋白水凝胶从模具中取出，并置于标准塑料压缩装置中（
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结果
我们采用由I型胶原蛋白制备的胶原移植物，因为这是肌腱中主要存在的蛋白质。它占肌腱中总胶原蛋白的近95%，因此胶原蛋白表现出模拟肌腱所需的所有理想特性 体内21,22.
本研究中使用的Ⅰ型胶原从大鼠尾腱提取，并溶于乙酸（2.15 mg/mL）。为使该胶原聚合，采用氢氧化钠进行中和。 体外 形成非交联的各向异性胶原原纤维。该水凝胶含98%的液体，可模拟活体组织 体内 在制备过程中20分钟内23然而，这种水凝胶的机械性能较弱；因此，为了提高其机械性能，我们开发了一种通过称为“塑性压缩”的技术快速压缩胶原蛋白水凝胶的方法，其中压缩程度与施加在顶部的重量以及从流体释放表面（FLS）排出的液体量成正比。19
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讨论
在本研究中，选择组织工程I型胶原移植物作为肌腱移植物，因为胶原是一种天然聚合物，已被广泛用作多种组织工程应用的生物材料27,28. 此外，胶原蛋白占肌腱干重的60%，其中95%为Ⅰ型胶原蛋白 21,29,30,31,32为了实现成功的移植，移植物的力学性能应尽可能与天然肌腱相匹配33然而，采用当前的工程技术，工程化肌腱（ET）的力学性能（4.41 N）显著低于天然肌腱（NT）（261.08 N）33据推测，这归因于天然肌腱中胶原原纤维高度有序的层级排列结构，而这种结构的仿生构建及其力.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢伦敦大学学院（UCL）为本项目提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠尾部 I 型胶原蛋白 | First Link, 伯明翰, 英国 | 60-30-810 | |
| 6-0 普理灵缝合线 | Ethicon Ltd, 爱丁堡, 英国 | EP8726H | |
| 3-0 普理灵缝合线 | Ethicon Ltd, 爱丁堡, 英国 | D8911 | |
| 沃特曼滤纸 | SIGMA-ALDRICH | WHA10010155 | |
| Gibco DMEM，高糖 | Thermo Fisher Scientific | 11574486 | |
| 尼龙网筛 | Plastok (Meshes and Filtration) Ltd. | NA |
参考文献
- Wollensak, G., Spoerl, E., Seiler, T. Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. American Journal of Ophthalmology. 135, 620-627 (2003).
- Tanzer, M. L. Cross-Linking of Collagen. Science. 180, 561-566 (1973).
- Reiser, K., McCormick, R. J., Rucker, R. B.
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重印与许可
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