富血小板血浆注射治疗膝骨关节炎的制备、操作流程及疗效评估

摘要

膝骨关节炎在骨科门诊中十分常见。本文详细介绍了采用富血小板血浆注射治疗膝骨关节炎的完整治疗流程，包括治疗前准备、操作步骤及疗效评估。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是骨科临床中最常见的疾病之一。现有的非手术治疗方法对软骨修复和骨再生的作用有限。富血小板血浆（PRP）是一种自体生物活性物质，能够有效修复软骨损伤并促进骨再生。然而，临床研究中关于PRP制备方案的报告存在高度不一致，大多数研究提供的信息不足以支持方案的重复实施。本文以可视化方式描述了一种可重复的PRP制备方法、采用PRP关节腔内注射治疗膝骨关节炎的操作流程，以及疗效评估方法。PRP通过手动双次离心法制备，从外周血中分离出PRP层，用于膝关节腔注射。评估内容包括血小板浓度检测和临床疗效评价。与使用设备进行血浆过滤或离心的方法相比，手动离心制备PRP所需的设备更少，成本更低。本研究中双次离心法的离心时间分别为800 × g力下6分钟和1400 × g力下5分钟，以确保能够稳定制备标准化的PRP。然而，手动操作易受操作者误差影响，且无法实现PRP的批量制备。PRP关节腔内注射被证实是治疗膝骨关节炎的有效方法。整个治疗过程耗时不足30分钟，PRP的血小板浓度可实现标准化，随访评估结果证实治疗有效。

引言

膝骨关节炎（KOA）是骨科门诊中最常见的疾病之一；30%–50% 的 65 岁以上人群患有此病¹。目前，KOA 的保守治疗主要包括口服非甾体抗炎药和软骨营养药物、关节腔内注射透明质酸钠以及物理治疗。然而，这些方法均无法阻止膝关节退行性变的进程²。关节软骨缺损可导致关节面磨损、关节不稳及代谢改变，这些均是 KOA 发病机制的重要组成部分³。但由于关节软骨缺乏血管、神经和淋巴组织，损伤后的修复十分困难。因此，一种有效的软骨修复方法对于 KOA 的治疗尤为重要。骨硬化治疗同样是 KOA 治疗中的关键重点。

富血小板血浆（PRP）是一种自体生物活性物质，目前针对PRP在骨骼和关节问题中的应用研究日益增多。临床上使用PRP的生物学依据包括其对生长因子局部递送的作用、对炎症反应的调节，以及对细胞增殖与分化的促进作用⁴。关节腔内注射后，PRP在激活过程中通过脱颗粒释放α颗粒，并分泌多种生长因子，包括血小板源性生长因子、转化生长因子-β、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子以及成纤维细胞生长因子。这些因子可促进成骨细胞和软骨细胞的增殖，抑制软骨退变，增强软骨及软骨下骨的稳定性，调节金属蛋白酶组织抑制剂的基因表达，并维持蛋白聚糖合成与降解的平衡^5,6。因此，PRP能够修复软骨损伤并加速骨组织再生。

PRP 注射的效果受多种因素影响，包括采血部位⁷、离心制备方法的类型⁸、抗凝剂的使用⁹以及激活剂的使用¹⁰。目前大致有三种离心方法用于制备 PRP，包括手工离心法、基于设备的离心法和血浆过滤技术，其中手工离心法和基于设备的离心法应用最为广泛。手工法所需设备最少，操作简便、成本低且易于实施（图1）。PRP 通过两次手工离心制备：首先将混合外周血与抗凝剂进行离心，以分离血细胞与富含血小板的血浆；弃去底层的红细胞后，将上清液再次离心以进行重新分离，从而分为上层血小板贫乏血浆、中层 PRP 和下层残留红细胞。中层液体用于膝关节腔注射（若量不足，可吸取部分上清液）。该方法的评估包括血小板浓度测定和临床疗效评价。

临床研究中关于PRP制备方案的报告存在高度不一致，大多数研究未提供足以使该方案被重复的充分信息¹¹。本文介绍了一种可重复的PRP制备方法及通过PRP关节腔内注射治疗膝骨关节炎（KOA）的方法，并对治疗效果进行了评估。纳入标准为：患有膝骨关节炎且对单纯镇痛药物（如对乙酰氨基酚）和保守治疗镇痛效果不佳的患者。排除标准包括：存在静脉回流或淋巴引流障碍的患者；患有膝关节感染的患者；注射部位存在皮肤病或感染的患者；发热患者；凝血功能异常的患者；患有严重心血管疾病的患者。整个治疗过程耗时少于30分钟，且PRP的血小板浓度已证实可达到标准化测量水平。通过密切随访期间对治疗结果的评估，验证了该方法的有效性。

方案

所描述的方法已获得广东省人民医院伦理委员会的批准。

1. 通过手动离心获取富血小板血浆（PRP）

1. 在洁净的层流手术室内，将患者置于仰卧位，室温与湿度保持舒适：室温为 22 °C，相对湿度为 60%。
2. 使用 1 mL 注射器抽取 0.2 mL 肝素钠（2 mL = 12,500 U），然后用其润湿一支 50 mL 注射器。
   注意：此步骤中也可使用 3 mL 枸橼酸钠替代肝素钠。
3. 扎上止血带，对肘部消毒 2–3 次，使用润湿后的 50 mL 注射器从肘静脉采集 30 mL 外周血。
4. 进行第一次离心。
   1. 将外周血等量分装至两个 50 mL 无菌离心管中。
   2. 将两支离心管置于水平转子中，再放入离心机内，操作过程需保持无菌条件。
   3. 在 800 × g 条件下离心 6 分钟。
   4. 取出水平转子，佩戴无菌手套后取出离心管。
   5. 观察分层情况，确认外周血已分为两层。
   6. 使用一支洁净的 10 mL 注射器，将两支离心管中的上清液收集至一支洁净的离心管中。
5. 进行第二次离心。
   1. 使用一支洁净的 10 mL 注射器，向另一支洁净离心管中加入等量的无菌水或生理盐水以平衡重量，将两支管置于水平转子中。用胶布标记含有上清液的离心管。
   2. 在 1400 × g 条件下离心 5 分钟。
   3. 取出水平转子，观察分层情况，确认标记管中的液体分为三层。
   4. 使用 10 mL 注射器从中间颗粒细胞层（富含白细胞的富血小板血浆层）及下层上清液中抽取 4 mL 液体。若中间层量足够，仅从中抽取 4 mL 即可。
   5. 将 0.4 mL 液体注入一支无菌抗凝管（含 K₂EDTA，3.6 mg）中用于检测，注射器中剩余 3.6 mL 液体。
      注意：此步骤可作为暂停点。

2. PRP的关节内注射

1. 让患者仰卧于手术台上，膝关节屈曲至90度。
2. 在髌骨下缘且距髌腱外侧1 cm处确定穿刺点，使用记号笔标记该位置。
3. 佩戴无菌手套，使用安尔碘III对穿刺部位进行三次皮肤消毒，并覆盖无菌洞巾。
4. 将注射器平行于胫骨平台放置，以45度角进针，将针头完全刺入皮肤。
5. 将注射器中的3.6 mL PRP注入膝关节腔内。
6. 用无菌纱布覆盖穿刺部位，并用胶布固定。
7. 对伤口加压10分钟，观察30分钟，注意有无严重不良反应。
8. 每隔一个月注射一次，共注射三次。
   注意：此步骤可作为暂停点。

3. PRP 注射的术后评估

1. 评估PRP中血小板的浓度。
   1. 使用抗凝管（K₂EDTA，3.6 mg）中的0.4 mL PRP。
   2. 使用全自动血细胞分析仪分析PRP中的血小板浓度。
2. 评估PRP注射术后的治疗效果。
   1. 在每次治疗前1天进行一次门诊咨询，并在每次治疗后1天、每次治疗后3天、每次治疗后1周、第三次治疗后1个月、第三次治疗后3个月以及第三次治疗后6个月对患者进行随访。
   2. 采用视觉模拟评分（VAS）、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）、膝关节协会评分（KSS）以及Lysholm膝关节功能评分量表评估术后疗效。

结果

因此，富血小板血浆（PRP）的血小板计数达到了1121 × 10³/µL的标准浓度水平。我们按照方案对一名55岁男性早期膝骨关节炎（KOA）患者进行了15次随访调查。关节腔内注射PRP后的早期临床效果明显令人满意（图2）。然而，中期疗效略为逊色。观察到显著的镇痛效果（图2A）。KSS膝关节评分高于KSS功能评分（图2C、图2D），表明PRP对主观症状的改善效果优于对客观症状的改善。Lysholm膝关节功能评分显示，本研究的PRP治疗方案在改善软骨损伤和软组织损伤症状方面具有明确疗效（图2E）。总体而言，本PRP治疗方案的治疗效果显著。

...

讨论

正常人血液中血小板浓度介于 150,000/µL 至 350,000/µL 之间，普遍认为富血小板血浆（PRP）中的血小板浓度应达到 1,000,000/µL，即正常浓度的 3 至 5 倍⁹。根据 PAW 分级系统，当 PRP 中血小板浓度低于正常浓度 3 倍时，其疗效不明显；而当血小板浓度超过正常浓度 6 倍时，则会产生抑制作用¹²。因此，本实验方案的最低要求是 PRP 的血小板浓度应介于上述范围之间。

手工制备富血小板血浆（PRP）可通过单次离心或两次离心完成。由于离心参数不同，两种方法所获得的PRP质量存在差异。单次离心获得的血小板浓度较低，但PRP中不含白细胞和红细胞。两次离心获得的血小板浓度较高，但PRP通常含有少量白细胞，甚至可能含有红细胞¹³。PRP中是否存在白细胞对治疗效果是否有益，目前尚存争议。一些研究表明，富含白细胞的PRP具有更强的抗菌活性，有助于功能恢复，且刺激性较小，可减少镇痛药物的使用

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心	Eppendorf	5702
离心管	CORNING	430828
水平转子	Eppendorf	LL080
Anerdian III	上海利康消毒高科技有限公司	310173	消毒皮肤
1 ml 注射器	KDL  医疗设备有限公司	0.4*13 RWLB
10 ml 注射器	KDL  医疗设备有限公司	1.2*38 TWSB
50 ml 注射器	KDL  医疗设备有限公司	0.7*32 TWLB
医用止血带	常州金丽乳胶制品有限公司	0087-2011
一次性无菌橡胶外科手套	上海锦翔乳胶制品有限公司	17060
一次性采血针	KDL  医疗设备有限公司	0.55*20 L(II) RWLB
肝素钠注射液	SPH No.1 生化培养基 &；制药有限公司	1706101	2 ml：12500 U
Jifro 免冲洗手部消毒凝胶	上海利康消毒高科技有限公司	311793
医用棉签	佛山康正医疗器械有限公司	KZ3-12	消毒皮肤
10 ml 生理盐水	江西双实药业有限公司	140211458
全自动血细胞分析仪	贝克曼库尔特	LH-750
孔到井			无菌的
抗凝管（采血管，K2E 3.6mg）	Becton, Dickinson and Company	CNL17-COO56	在4至25摄氏度的阴凉干燥处保存
镊子	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10
无菌纱布	广东泽畅贸易有限公司	170915
粘性绷带	3M Transpore	1527C-0
皮肤标记笔	广州明嘉医疗器械制造有限公司	10110