离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

摘要

本文描述了一种实验方案 离体 钙成像 果蝇 脑。在该方法中，可将天然或合成化合物加入缓冲液中，以检测其激活脑内特定神经元的能力。

摘要

通过内分泌信号进行的器官间通讯，例如从外周到大脑的信号传递，对于维持内环境稳态至关重要。作为内分泌研究的模式动物， 黑腹果蝇，其具有复杂的遗传工具和基因组信息，正被越来越多地使用。本文描述了一种钙成像方法 果蝇 脑组织外植体。该方法可用于检测激素对脑组织的直接信号作用。众所周知，许多肽类激素通过G蛋白偶联受体（GPCRs）发挥作用，其激活可引起细胞内Ca²⁺水平升高。²⁺浓度。神经激活还会升高细胞内Ca²⁺ 水平，来自Ca²⁺ 钙离子内流与释放²⁺ 储存在内质网（ER）中。钙离子传感器GCaMP可用于监测这些Ca²⁺ 变化。在该方法中，目标神经元表达GCaMP，随后解剖表达GCaMP的幼虫脑并进行培养 离体 然后将测试肽施加于脑组织外植体，利用配备CCD相机的转盘共聚焦显微镜检测GCaMP的荧光变化。通过该方法，可检测任何水溶性分子，并可使用适当的荧光指示剂成像与神经元激活相关的多种细胞事件。此外，通过改造成像腔室，该方法还可用于成像其他组织 果蝇 器官或其他动物的器官。

引言

器官之间的相互通讯是一种在进化上保守的策略，用于维持稳态以应对环境变化。在人体中，多种激素由内分泌腺释放进入血液循环。这些激素中的许多作用于大脑的下丘脑，从而调控代谢过程以及摄食等基本行为^1,2。许多激素是利用哺乳动物模型发现的。然而，这些激素的作用机制，尤其是它们所参与的器官间网络，仍 largely 不清楚。

Drosophila melanogaster 已成为研究器官间通讯的有用模型。在昆虫中，许多生理过程由激素调控。早期关于生长和变态的研究使用了体型较大的昆虫。在这些研究中，通过特定器官的切除或移植，预测了器官间信号分子的存在；随后，昆虫激素中的保幼激素（Juvenile hormone, JH）、前胸腺促激素（Prothoracicotropic hormone, PTTH）和蜕皮激素（Ecdysone）被成功地通过生物化学方法纯化^3,4,5。目前认为，一大类细胞间信号肽参与调控昆虫生命周期中的多种生理事件^6,7。这些肽大多作用于....

方案

1. 幼虫脑外植体的制备

1. 制作成像室。
   注意：稳定的记录需要将脑组织外植块固定。此处使用一种低成本、手工制作的成像室进行 Ca²⁺ 成像系统
   1. 使用镊子在塑料培养皿（35 mm × 10 mm）底部中央轻轻刮擦，形成凹痕，以容纳幼虫脑的腹神经节，便于后续制片（步骤 1.3， 图1).
   2. 用牙签在凹槽两侧各放置一滴少量的超级胶水，然后将一根钨丝（直径0.125 mm，长度6至7 mm）粘附在胶水上。
   3. 使用一小块类似腻子的可重复利用粘合剂，在凹槽周围制作一个圆形壁（直径10 mm，高3 mm）图1).
      注意：墙体内部空间随后将用磷酸盐缓冲液（PBS；0.14 M NaCl，0.0027 M KCl，0.01 M PO₄^3-，pH 7.4 ± 0.05（25 °C 时）。
2. 动物准备
   注意：对于钙成像，需在目标细胞类型中表达钙指示剂 GCaMP6s，这通常通过组织特异性 GAL4 与 UAS-GCaMP6s为确保信号通过候选受体介导，还需在受体缺陷型突变体中表达 GCaMP6s。
   1. 当需要对不同基因型（如野生型和突变体）进行实验比较时，应使....

结果

通过本实验方案，研究了肽类激素 CCHa2 对脑内胰岛素生成细胞（IPCs）的激活作用。利用 dilp2-GAL4¹²（由 Rulifson 博士惠赠）与 UAS-GCaMP6s¹³（由 Kim 博士惠赠）组合，将野生型脑组织中的 IPCs 标记为 GCaMP6s。对幼虫脑组织离体样本施加合成的 CCHa2 肽，并实时记录 GCaMP6s 的荧光信号。本实验中，图像采集自单一焦平面。每个 IPC 簇约包含 14 个细胞¹⁴，检测到其中 3 至 6 个细胞的信号。施加 CCHa2 后，GCaMP6s 信号强度显著增强（图 2A，视频 1）。野生型脑组织对胃饥饿素（Ghrelin）或痛敏肽（Nociceptin）未表现出明显反应（视频 2 和 3），这两种为哺乳动物特有的肽.......

讨论

本文所述的Ca²⁺成像方法是一种用于检测激素在脑内功能的有效系统。在体条件下，脑接收来自多种内分泌器官的激素。此外，脑持续接收上行的感觉信息，从而引起神经元的自发性激活。该离体系统可消除此类干扰，相比在体成像具有更高的信噪比。在此系统中，可单独或联合测试分子。除肽类激素外，任何水溶性分子（包括天然或合成化合物）均可施加于脑组织外植体。

进行 Ca²⁺ 成像时，需要固定脑组织外植体。为此，以往曾使用由低熔点琼脂糖或纤维蛋白制成的凝胶基质^16,17。这些凝胶基质虽可稳定固定样品，但组织需暴露于30 °C以上的温度，而该温度会引发变温动物（如昆虫）的热休克反应。为避免热应激，可采用物理方式固定脑组织。将附着于体壁的脑组织用昆虫针固定¹⁸。我们使用钨丝的方法可实现简单且稳定的样品固定。该系统制备简便、可重复使用，并且与凝胶包埋法相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钨棒	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
蓝丁胶	Bostik, Paris, France	3049100	类似腻子的可重复使用粘合剂
方形表面皿，1 5/8 英寸	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	磷酸盐缓冲液
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		定制合成肽
Ghrerin	Peptide Institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
伤害感受素	Peptide Institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	荧光显微镜
物镜 W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	水浸式物镜
长行程P-725 PIFOC物镜扫描器	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	压电驱动镜头移动装置
共聚焦扫描单元 CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	转盘式共聚焦扫描头
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD相机
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488 nm激光器
488/568/647 nm Yokogawa二向色镜分光器	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	二向色分光镜
528/38 nm BrightLine单通带滤光片	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	发射滤光片
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	美国国立卫生研究院	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, 生物医学成像组，瑞士洛桑联邦理工学院	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/