离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

摘要

本文描述了一种实验方案 离体 钙成像 果蝇 脑。在该方法中，可将天然或合成化合物加入缓冲液中，以检测其激活脑内特定神经元的能力。

摘要

通过内分泌信号进行的器官间通讯，例如从外周到大脑的信号传递，对于维持内环境稳态至关重要。作为内分泌研究的模式动物， 黑腹果蝇，其具有复杂的遗传工具和基因组信息，正被越来越多地使用。本文描述了一种钙成像方法 果蝇 脑组织外植体。该方法可用于检测激素对脑组织的直接信号作用。众所周知，许多肽类激素通过G蛋白偶联受体（GPCRs）发挥作用，其激活可引起细胞内Ca²⁺水平升高。²⁺浓度。神经激活还会升高细胞内Ca²⁺ 水平，来自Ca²⁺ 钙离子内流与释放²⁺ 储存在内质网（ER）中。钙离子传感器GCaMP可用于监测这些Ca²⁺ 变化。在该方法中，目标神经元表达GCaMP，随后解剖表达GCaMP的幼虫脑并进行培养 离体 然后将测试肽施加于脑组织外植体，利用配备CCD相机的转盘共聚焦显微镜检测GCaMP的荧光变化。通过该方法，可检测任何水溶性分子，并可使用适当的荧光指示剂成像与神经元激活相关的多种细胞事件。此外，通过改造成像腔室，该方法还可用于成像其他组织 果蝇 器官或其他动物的器官。

引言

器官之间的相互通讯是一种在进化上保守的策略，用于维持稳态以应对环境变化。在人体中，多种激素由内分泌腺释放进入血液循环。这些激素中的许多作用于大脑的下丘脑，从而调控代谢过程以及摄食等基本行为^1,2。许多激素是利用哺乳动物模型发现的。然而，这些激素的作用机制，尤其是它们所参与的器官间网络，仍 largely 不清楚。

Drosophila melanogaster 已成为研究器官间通讯的有用模型。在昆虫中，许多生理过程由激素调控。早期关于生长和变态的研究使用了体型较大的昆虫。在这些研究中，通过特定器官的切除或移植，预测了器官间信号分子的存在；随后，昆虫激素中的保幼激素（Juvenile hormone, JH）、前胸腺促激素（Prothoracicotropic hormone, PTTH）和蜕皮激素（Ecdysone）被成功地通过生物化学方法纯化^3,4,5。目前认为，一大类细胞间信号肽参与调控昆虫生命周期中的多种生理事件^6,7。这些肽大多作用于G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs），尽管最初使用传统方法难以鉴定其对应的特异性GPCR。《Drosophila全基因组序列》的发表⁸ 成为关键突破，使得研究人员能够基于与其他昆虫中已知活性肽的同源性，鉴定出Drosophila中的生物活性肽。此外，通过基于细胞培养的GPCR-配体结合实验，结合基因组预测的GPCR信息，成功鉴定了多个肽的受体。随后，表达谱分析进一步预测了这些肽及其受体所介导的器官间信号通路。值得注意的是，许多假定的肽类受体在脑中表达，提示脑是肽类激素的主要靶组织之一⁹。此外，Drosophila中先进的遗传工具也推动了肽-GPCR组合生理功能的鉴定。例如，基于GAL4和LexA的双元转录系统可实现基因在特定空间和时间上的敲低或过表达。GAL4是一种在酵母中发现的转录因子，可结合一种称为上游激活序列（Upstream Activation Sequence, UAS）的顺式调控元件。在GAL4/UAS系统中，驱动品系提供组织特异性或发育阶段特异性的GAL4表达，而响应品系则在目标基因或shRNA表达构建的上游携带UAS序列。LexA/LexAop系统基于类似的机制。通过对组织特异性肽敲低和组织特异性GPCR敲低动物进行表型分析，可揭示肽-GPCR信号通路的作用模式和作用部位。然而，仅依靠遗传学数据得出的结论具有局限性。另一方面，当某一特定肽类激素的潜在靶标被缩小至特定组织或细胞类型时，可利用器官离体标本进行ex vivo钙成像，以阐明由肽-GPCR信号介导的器官间通讯。当Gq偶联的GPCR被激活时，由于内质网（ER）中Ca²⁺的释放，细胞内Ca²⁺浓度升高¹⁰。在脑组织中，神经元的激活同样会引起细胞内Ca²⁺水平的上升。此类Ca²⁺浓度的升高可通过钙离子传感器GCaMP进行检测；GCaMP在Ca²⁺存在时发生构象变化，从而产生荧光信号¹¹。

本文介绍了一种利用果蝇（Drosophila）脑组织离体标本进行钙成像的方法。为了检测某种肽是否能够激活特定神经元，将待测肽作用于表达GCaMP的脑组织离体标本，并通过共聚焦显微镜监测荧光变化。随后，通过在缺乏该G蛋白偶联受体（GPCR）的突变型脑组织中重复相同实验，验证GPCR的参与作用。这种成像与遗传学相结合的方法，可精确揭示肽-GPCR介导的器官间通讯机制。本文还讨论了该实验方案可能的改进方法及其应用前景。

方案

1. 幼虫脑外植体的制备

1. 制作成像室。
   注意：稳定的记录需要将脑组织外植块固定。此处使用一种低成本、手工制作的成像室进行 Ca²⁺ 成像系统
   1. 使用镊子在塑料培养皿（35 mm × 10 mm）底部中央轻轻刮擦，形成凹痕，以容纳幼虫脑的腹神经节，便于后续制片（步骤 1.3， 图1).
   2. 用牙签在凹槽两侧各放置一滴少量的超级胶水，然后将一根钨丝（直径0.125 mm，长度6至7 mm）粘附在胶水上。
   3. 使用一小块类似腻子的可重复利用粘合剂，在凹槽周围制作一个圆形壁（直径10 mm，高3 mm）图1).
      注意：墙体内部空间随后将用磷酸盐缓冲液（PBS；0.14 M NaCl，0.0027 M KCl，0.01 M PO₄^3-，pH 7.4 ± 0.05（25 °C 时）。
2. 动物准备
   注意：对于钙成像，需在目标细胞类型中表达钙指示剂 GCaMP6s，这通常通过组织特异性 GAL4 与 UAS-GCaMP6s为确保信号通过候选受体介导，还需在受体缺陷型突变体中表达 GCaMP6s。
   1. 当需要对不同基因型（如野生型和突变体）进行实验比较时，应使测试幼虫的年龄相匹配，以避免因发育阶段不同导致的GCaMP6表达水平差异和生理差异。
   2. 将亲代果蝇（每种性别各30只）置于含有标准果蝇培养基的培养管中，静置8小时，以允许果蝇在培养基表面产卵。在25 °C、60–70%相对湿度条件下，按12小时光照-12小时黑暗循环进行大量培养幼虫。
3. 幼虫脑解剖
   1. 在产卵后90-120小时，收集幼虫并用蒸馏水至少清洗3次，以去除附着的食物残渣。
   2. 将一条幼虫置于盛有冰冷 PBS 的 1.5 英寸方形表面皿中。
      注意：接下来的两个步骤需在解剖显微镜下的此培养皿中进行。
   3. 用镊子轻轻夹住幼虫的中部，用另一把镊子夹住口钩，轻柔地拉动口钩，将包含脑的幼虫前部与身体其余部分分离。
      注意：也可使用手术剪。
   4. 用镊子夹住幼虫前端，将幼虫翻转。去除附着在脑部的多余组织，例如成虫盘、脂肪体和围心体。轻柔地将脑部分离出口器。
   5. 在成像腔室中由可重复使用的腻子状粘合剂形成的环内加入 200 µL PBS。用巴斯德吸管轻轻吸取含有解剖所得脑组织的 PBS，然后将其转移至成像腔室中。
4. 将大脑置入成像室
   1. 用镊子夹住从腹神经节延伸出的肌纤维。将脑组织轻轻插入钨丝下方的凹槽内。
   2. 使用另一把镊子将钨丝轻轻向上提起，以将脑组织调整至成像的正确位置（图1).

2. 钙信号的获取²⁺ 荧光图像

注意：将浸没在PBS中的脑组织样本置于配备20倍水浸物镜（数值孔径N.A. = 0.5）的荧光显微镜下进行成像。PBS不会激活脑内细胞。若需采集Z轴图像，物镜需配备压电驱动的镜头移动装置。使用转盘共聚焦成像系统以提高时间分辨率。在弱光成像条件下，显微镜配备电子倍增电荷耦合器件相机。GCaMP6s荧光成像（激发/发射波长：488/509 nm）需使用488 nm激光器激发，并配备二向色镜和发射滤光片例如528 ± 38 nm 带通滤光片

1. 将含有脑组织外植体的成像室置于显微镜下。
2. 将物镜降低至接触PBS。在明场照明下，调整脑组织位置并使其对焦。切换至荧光照明，并对GCaMP6s标记的细胞进行调焦。
   注意：GCaMP6s 的基础绿色荧光应可见。
3. 在水冷模式下，使用适当的采集软件，以250 ms/帧的速度和512 × 512像素的分辨率开始采集例如，µManager）。调整曝光时间，使荧光值处于CCD相机的动态范围内，但不低于1000（任意单位），适用于16位图像（动态范围0-65,535）。
   注意：应使用较短的曝光时间以尽量减少GCaMP6s的光漂白。曝光时间需在每次实验中进行优化，因其取决于GCaMP6的表达水平和检测系统的灵敏度。在本实验中，曝光时间为100 ms。 dilp2>GCaMP6s 当特定成像深度需要进行z轴层扫时，可根据曝光时间和帧间隔获取多个z轴层面图像。若相机具有足够的空间分辨率，应增大像素合并（binning）尺寸（即芯片上合并为一个数字像素的感光单元数量），以缩短曝光时间。
4. 确定成像参数后，在给予肽之前采集1分钟图像以检测基线信号强度（F₀).
5. 加入测试肽；具体操作为，将100 µL肽溶液溶于PBS中，并直接用移液器加入幼虫浴液，以达到最佳浓度。
   注意：肽溶液应缓慢注射（例如，使用移液器将流速为20 µL/s的溶液加入浴液中。以溶于PBS的无关合成肽作为阴性对照。
6. 记录 GCaMP6s 发射信号数分钟。

3. 数据分析

注意：成像数据使用 ImageJ 离线分析。在延时成像过程中，移液操作会导致幼虫大脑移动，因此在分析前应校正连续图像的位置偏差。可使用 ImageJ 插件 TurboReg 按如下步骤进行校正。

1. 打开分析软件，使用第一帧图像（施加肽之前）作为参考图像。
2. 选择 Plugins | Registration | TurboReg。
3. 将序列图像文件选为 Source，将参考图像选为 Target。
4. 分别选择 Rigid Body（图像的平移和旋转）和 Accurate（"Fast" 为粗略但快速的分析）作为处理方法和质量选项。
5. 点击 Batch 以开始图像处理。
6. 在 ImageJ 中使用 Analyze | Tools | ROI Manager 选择多个感兴趣区域（ROIs）。
7. 在 ROI Manager 窗口中点击 More | Multi Measure | OK，测量像素强度。
8. 计算 ΔF/F₀ = (F - F₀)/F₀，其中 F 为刺激发生时 ROI 的强度，F₀ 为特定实验事件发生前立即时间段内的强度（e.g., 刺激开始前的 30 帧）。
9. 使用多个脑组织样本重复实验，并进行统计分析，以获得每个时间点的均值和均值标准误（SEM）。

结果

通过本实验方案，研究了肽类激素 CCHa2 对脑内胰岛素生成细胞（IPCs）的激活作用。利用 dilp2-GAL4¹²（由 Rulifson 博士惠赠）与 UAS-GCaMP6s¹³（由 Kim 博士惠赠）组合，将野生型脑组织中的 IPCs 标记为 GCaMP6s。对幼虫脑组织离体样本施加合成的 CCHa2 肽，并实时记录 GCaMP6s 的荧光信号。本实验中，图像采集自单一焦平面。每个 IPC 簇约包含 14 个细胞¹⁴，检测到其中 3 至 6 个细胞的信号。施加 CCHa2 后，GCaMP6s 信号强度显著增强（图 2A，视频 1）。野生型脑组织对胃饥饿素（Ghrelin）或痛敏肽（Nociceptin）未表现出明显反应（视频 2 和 3），这两种为哺乳动物特有的肽...

讨论

本文所述的Ca²⁺成像方法是一种用于检测激素在脑内功能的有效系统。在体条件下，脑接收来自多种内分泌器官的激素。此外，脑持续接收上行的感觉信息，从而引起神经元的自发性激活。该离体系统可消除此类干扰，相比在体成像具有更高的信噪比。在此系统中，可单独或联合测试分子。除肽类激素外，任何水溶性分子（包括天然或合成化合物）均可施加于脑组织外植体。

进行 Ca²⁺ 成像时，需要固定脑组织外植体。为此，以往曾使用由低熔点琼脂糖或纤维蛋白制成的凝胶基质^16,17。这些凝胶基质虽可稳定固定样品，但组织需暴露于30 °C以上的温度，而该温度会引发变温动物（如昆虫）的热休克反应。为避免热应激，可采用物理方式固定脑组织。将附着于体壁的脑组织用昆虫针固定¹⁸。我们使用钨丝的方法可实现简单且稳定的样品固定。该系统制备简便、可重复使用，并且与凝胶包埋法相...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钨棒	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
蓝丁胶	Bostik, Paris, France	3049100	类似腻子的可重复使用粘合剂
方形表面皿，1 5/8 英寸	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	磷酸盐缓冲液
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		定制合成肽
Ghrerin	Peptide Institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
伤害感受素	Peptide Institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	荧光显微镜
物镜 W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	水浸式物镜
长行程P-725 PIFOC物镜扫描器	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	压电驱动镜头移动装置
共聚焦扫描单元 CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	转盘式共聚焦扫描头
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD相机
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488 nm激光器
488/568/647 nm Yokogawa二向色镜分光器	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	二向色分光镜
528/38 nm BrightLine单通带滤光片	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	发射滤光片
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	美国国立卫生研究院	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, 生物医学成像组，瑞士洛桑联邦理工学院	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/