方法文章

秀丽线虫生殖的计算分析研究细胞核、蛋白质和细胞骨架的分布

DOI：

10.3791/57702

⸱

2018年4月19日

 , 
1Development and Stem Cells Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们为秀丽线虫生殖提供三维重建的自动方法.我们的方法确定生殖中每个核的数量和位置, 并分析生殖蛋白质分布和骨架结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

秀丽线虫(C. 线虫) 生殖用于研究几个生物学上重要的过程, 包括干细胞发育、细胞凋亡和染色体动力学。虽然生殖是一个很好的模型, 分析往往是二维由于时间和劳动力需要的三维分析。这些研究的主要读数是生殖中细胞核和蛋白质分布的数量/位置。在这里, 我们提出了一个方法来执行生殖的自动分析使用共焦显微镜和计算方法, 以确定核在每个区域的生殖的数量和位置。我们的方法还分析了生殖蛋白的分布, 使三维检测的蛋白质表达在不同的遗传背景。此外, 我们的研究显示在生殖的不同区域骨架体系结构的变化, 可以适应特定的空间发展要求。最后, 我们的方法可以自动计数的精子在每个生殖的蝗受精囊。结合起来, 我们的方法实现了对C. 线虫生殖的快速和可重现的表型分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与哺乳动物的信号通路守恒使线虫成为研究多个生物过程的优秀模型1,2。在实验室中, 我们使用线虫生殖研究干细胞的发育、凋亡和基因表达。虽然生殖是一个三维结构, 但由于三维分析的耗时和劳动密集型性质, 许多研究是二维的。二维分析极有可能会在生殖中歪曲体内事件。C. 线虫成体雌雄同体有两个生殖臂, 每个手臂都有一个躯体远端尖端细胞 (DTC), 在未分化状态3,4中维持远端生殖细胞。这些生殖细胞开始分化, 因为它们离开 DTC, 逃避其影响, 并成为卵母细胞和精子, 因为它们到达生殖的近端。在此过程中, 生殖细胞核发生有丝分裂, 然后过渡到减数分裂5,6。精子生产由发育的幼虫阶段 4 (L4) 完成, 之后卵母细胞在成年期间产生。精子储存在蝗受精囊卵母细胞中, 以生成胚胎。

有多种遗传和环境因素可以影响线虫中的生殖发展, 导致细胞核数量、凋亡事件数、染色体动态、蛋白质表达和/或定位的变化7 ,8,9,10,11。对这些事件的分析需要确定基于核形态和分布的各个分化阶段。要用大量的样本量手动准确地分析这些参数, 是劳动密集型和耗时的。为了规避这些缺点, 并使分析的一致性, 我们开发了一种自动化的方法, 三维检查的线虫生殖核计数, 核分布, 蛋白质表达, 和骨架结构。将共焦显微术与三维渲染相结合, 生成了粒度和形状参数, 用于鉴定生殖细胞分化的各个阶段。此外, 这种方法可以计数的生殖细胞核和精子加评分的染色体数在每个卵母细胞。

生殖的一个关键结构是骨架, 它提供了生殖室的稳定性, 艾滋病细胞质流和保护生殖核12。利用计算渲染, 我们对生殖细胞骨架进行了三维重建, 并在生殖中发现了明显的骨架特征。在这里, 我们描述了一步一步的协议, 以说明计算分析如何结合共焦成像, 使对C. 线虫生殖的综合分析。

我们提出了一个快速的方法, 三维分析线虫生殖 (图 1)。利用三维分析, 可以研究生殖核的三维分布 (图 2和图 3), 自动计数单元格 (图 2), 重建生殖骨架 (图 3), 蛋白质的分布 (图 4), 并评分卵母细胞中蝗受精囊和染色体中的精子数量(图 5)。该方法不仅能方便准确地量化生殖, 而且能识别生理上相关的表型。

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方案

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1. 制剂和畜牧业

注: 有关所有产品信息, 请参阅材料表。

  1. OP50 大肠杆菌文化: OP50 细菌溶源性汤 (磅) (1% 胰蛋白胨, 0.5% 酵母, 0.5% NaCl, pH 7.0) 隔夜在37°c 没有抗生素.
  2. 种子400µL OP50 细菌的线虫生长培养基 (NGM) 板 (1.5 克氯化钠, 8.5 克琼脂, 1.25 克蛋白胨, 1 毫升1米 CaCl2, 1 毫升5毫克/毫升胆固醇在乙醇, 1 毫升1米 MgSO4, 25 毫升1米 KPO4缓冲器), 空气干燥细菌为 48 h。
  3. 在种子 NGM 板上采摘蠕虫, 在15摄氏度或20摄氏度孵化。
    1. 为分析成年雌雄同体生殖, 选择喂养良好的 L4 蠕虫到细菌草坪和孵化过夜20摄氏度。
    2. 在雌雄同体的精子数量, 孵化 L4 蠕虫在20°c 12 小时, 直到蠕虫达到 L4/adult 蜕皮。要使蠕虫与 L4 阶段同步, 请在漂白溶液中用大量的鸡蛋采摘成虫 (1 米氢氧化钠和漂白剂1:1 的比例) 来准备鸡蛋。让鸡蛋孵化和采摘 L4 动物的实验。
  4. 通过将25µL 的聚 l-赖氨酸溶液放在滑梯上, 用吸管尖端将溶液涂好, 制备聚四氟乙烯显微镜幻灯片。除去多余的聚 l-赖氨酸与纸巾, 让幻灯片的空气干燥和孵化的幻灯片在65°c 15-20 分钟。

2. 生殖解剖和染色6,13

  1. 斑点10µL 0.01% 四咪唑 (麻醉剂) 在22毫米 x 22 毫米盖玻片并且选择一天老成人蠕虫入它。
  2. 解剖蠕虫在尾部, 因为它成为镇静剂使用注射器 (5 毫升) 和针 (24 "x 1"), 并确保生殖没有损坏。
    注意: 解剖必须在蠕虫完全瘫痪之前进行, 这样蠕虫和蠕虫运动中的负压就能帮助生殖的弹射。对于精子的评分, 必须采取预防措施, 以防止在解剖过程中蝗受精囊针的损伤。避免接触生殖与针, 除了解剖点后, 蝗受精囊。如果生殖车厢内有断裂或生殖的任何排出物被观察到, 则生殖不应用于分析。
  3. 将倒置的盖玻片放在聚 l-赖氨酸涂层的滑动上, 使解剖生殖保持在幻灯片上。
  4. 将纸塔放在盖玻片的一个角上, 将盖玻片下的多余液体移开, 然后在液氮中放置1分钟的滑动. 用针与幻灯片上的 germlines 快速移除盖玻片。
  5. 将幻灯片转移到-20 °c 甲醇 30-六十年代在一个房间里, 然后孵化30分钟在新配制的固定溶液 (1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 含0.08 米 HEPES pH 6.9, 1.6 毫米 MgSO4, 0.8 毫米乙二醇-双 (β氨基乙基醚)-n, n, n ', n-'-四乙酸四酸 (EGTA), 和3.7% 多聚甲醛) 室温。
  6. 通过放置在包含 1x PBS 的房间, pH 值7.4 与 0.1% Tween-20 10 分钟, 洗涤幻灯片. 重复此步骤一次。
  7. 将湿纸巾放在室温下的塑料盒中, 用30µL 的 germlines (30% 的山羊血清, 在1700年µL 的蒸馏 H2O 和300µL 10x PBS) 在潮湿的房间里, 在室温下放置30分钟。
  8. 在30% 山羊血清中添加50µL 的 REC-8 抗体溶液, 每种样品的比值1:300。在4°c 一夜间孵化。
  9. 在装有 1x PBS 的腔室中放置 0.1% Tween-20 10 分钟, 将其冲洗干净. 重复步骤一次, 通过在幻灯片的拐角处放置纸巾来去除多余的液体。
  10. 通过稀释绿色荧光 (488 nm 发射波长) 共轭二级抗体 (1:1000), 罗丹明 (肌动蛋白染色, 1:4000) 和 DAPI (DNA 染色, 1:4000) 在30% 正常山羊血清中制备二级抗体溶液。
  11. 在幻灯片中添加50µL 二级抗体溶液。
  12. 室温下孵育1小时。
  13. 在装有 1x PBS 的腔室中放置两次幻灯片, 0.1% Tween-20 10 分钟。
  14. 将30µL 的固定试剂添加到幻灯片上, 并将12毫米2 x 1.5 µm 盖玻片放在顶部, 并在4°c 一夜之间干燥幻灯片。

3. 共焦显微术

  1. 打开共焦显微镜、激光器、共振扫描仪和共焦显微镜软件。将带有染色 germlines 的幻灯片放在63X 目标上方的幻灯片架上。
  2. 找到一个生殖, 聚焦在生殖的顶端, 并用共焦显微镜软件标记它。同样专注于底部的生殖和标记它建立总生殖厚度。
  3. 图像的整个生殖通过定义的厚度, 每片0.5 µm. 标记完整的生殖并开始获取。扫描每个切片8次, 并平均值以提高图像质量。共振扫描仪将允许快速扫描, 以避免在成像过程中漂白。如果显微镜没有共振扫描仪, 将扫描次数减少到四, 以避免漂白。

4. 核数和分布的后成像分析

注: 有关使用的软件工具和按钮的屏幕截图, 请参阅辅助图 1 。

  1. 将图像导入 Imaris 8.4.1 或更高版本的软件。
  2. 通过确定各区域核形态, 定义生殖的有丝分裂区、过渡区、减数分裂区、卵母细胞区和蝗受精囊。
  3. 使用软件的 "曲面函数" 按钮 (辅助图 1A) 选择感兴趣的区域。
  4. 取消自动曲面创建向导, 并手动从三维堆栈中绘制图像的第一个和最后一个切片所感兴趣的区域。
  5. 单击创建曲面。
    注意: 该软件将自动开发堆栈之间的第一和最后一栈。
  6. 通过单击掩码通道按钮 (辅助图 1 b-C), 屏蔽除 DAPI 之外的所有通道。
  7. 使用 "现场功能" 按钮 (辅助图 1A) 定义核尺寸参数。对于有丝分裂区域, 定义一个 XY 直径为2µm, 同时留下 Z 直径未定义。对于过渡区域, 将2µm 和 Z 直径的 XY 直径定义为1.5 µm. (补充图 1D)。
    注: 根据显微镜的放大倍数和规格, 对直径进行故障诊断。对于当前的协议, 使用的目标是 63X, 在成像过程中提供额外的1.70 倍放大倍数。如果目标改变, 例如 40X, 直径应该相应地改变。应使用 wildtype germlines 执行故障排除以建立正确的参数。野生型生殖臂的有丝分裂区有大约250个细胞核。应修改直径以达到此值。使用至少 15 germlines 来确定直径的最佳值。对过渡区 (150-170 核) 和减数分裂区 (600-700 核) 进行标定时, 应采用类似的方法。
  8. 通过定义最小阈值 (辅助图 1E) 来限制对斑点的检测。使用 DAPI 染色的野生型 germlines, 通过增加最小三维渲染阈值来建立最小阈值, 直到第一个点出现在生殖之外。
  9. 保存图像并获取由软件自动生成的表中的核数。将图像导出为 TIF 文件。

5. 评分精子和染色体编号的后成像分析

  1. 通过选择蝗受精囊作为感兴趣的区域来执行三维渲染。要检测每个精子, 请在 X 和 Y 轴之间定义 0.75-1.0 µm 之间的光斑直径, 而 Z 直径仍未定义。使用 "斑点函数" 按钮, 如辅助图 1所示。
  2. 通过滴答作响的背景减法框减去背景, 并使用软件计算的背景校正值 (辅助图 1D)。
    注: Imaris 软件首先选取高强度点, 因此背景的影响是最小的, 只要感兴趣区域与背景有显著差异。第二种方法是手动定义背景校正, 在这里可以为背景提供适当的值。如果独立样本的强度需要比较, 手动背景校正将是适当的。
  3. 调整三维渲染阈值以检测蝗受精囊中所有 DAPI 染色的精子(辅助图 1E)。
  4. 对于染色体计数, 在开发三维模型之前, 定义 X 和 Y 轴的光斑直径 < 0.75 µm。
  5. 保存图像并导出为 TIF 文件。

6. 生殖骨架重建后的影像学分析

  1. 通过单击掩码通道按钮, 标识生殖中感兴趣的区域, 并屏蔽除罗丹明之外的所有通道。
  2. 使用 "曲面函数" 按钮 (辅助图 1) 定义0.25 µm 的曲面细节。
    注: 这意味着每0.25 µm 将被渲染成三维模型。表面细节可以是恒定的任何区域的生殖, 三维表面模型将创建每0.25 µm。然而, 对于卵母细胞区域, 由于该地区有明确的肌动蛋白纤维, 表面细节可以增加到 0.35-0.5 µm。
  3. 通过滴答作响的背景减法框减去背景, 并使用软件计算的背景校正值 (辅助图 1D)。
  4. 根据需要分析的结构调整三维渲染阈值 (辅助图 1E)。
  5. 保存已开发的三维图像并导出为 TIF 文件。

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结果

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图 1表示三维生殖分析所需的时间。L4 雌雄同体孵化20摄氏度被解剖, 以隔离 germlines 和染色 DAPI, 罗丹明和抗体对生殖蛋白。Germlines 是用共焦显微镜成像的。染色和共焦显微术需要大约24小时的完整生殖计算分析需要 10-15 分钟来计算细胞核的数量和位置, 确定蛋白质分布, 分析骨架结构, 并评分精子数量。完整的手动分析要求每生殖超过2小时, 并受操作员的影响, 因此, 我们的自动化高通量方法降低了分析时间, 提高了重现性。

自动核评分显示, 生殖 arm 大约有 1000-1200 核 (图 2C), 与以前发布的手动评分数据1相应。为了确认评分的准确性, 使用了多个突变体和不同的条件 (

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讨论

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该协议的目标是提高准确性, 减少生殖分析所需的时间。在解剖 germlines 的标准制备后, 通过计算渲染, 制备了一个三维生殖核模型。在允许观测生殖核在空间中的分布时, 三维渲染计算了生殖特定区域的核数目。我们的方法的关键方面是准确定义的大小和形状参数的原子核。这取决于染色的清晰度和图像的放大倍数。通过与已发布的手动分析数据1进行比较, 我们确认了该方法的正确性。为了进一步确定方法的准确性, 我们在不同的条件下使用了多个突变体, 并以发表的文献证实了结果。它还确认了方法检测微妙和强表型- cpb-3和glp-1突变体的能力。此外, 该方法对生殖中的细胞核大小和形状的变化, 甚至在菌株之间的改变具有适应性。该属性还可以识别和评分较小的结构在生殖, 如染色体和精子。如果需要, 该方法还允许对大小和形状参数进行进一步的故障排除。我们的分析能够阐明细胞核在生殖中的分布, 并表明有丝分裂和粗线期区的细胞核是以不同的模式组织的。通过将三维渲染应用于 REC-8 和 DAPI 染色, 也显示了有丝分裂区细胞核内 REC-8 的分布。

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢显微成像的技术支持。有些菌株是由由 NIH 研究基础设施项目 (P40 OD010440) 资助的秀丽遗传学中心提供的。这项工作得到了一所大学生物医学发现奖学金, 澳洲项目赠款 (GNT1105374), 澳洲高级研究金 (GNT1137645) 和 veski 创新研究金的支持: VIF 23 到罗杰波科克。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
秀丽隐杆线虫菌株：野生型（N2，布里斯托尔），rnp-8（tm2435） I/hT2[bli-4（e937） let-？（q782） qIs48] （I;III）， cpb-3（bt17） I， glp-1 （e2141） III 隐球菌遗传学中心 （CGC）
OP50 大肠杆菌 细菌自制
线虫生长培养基 （NGM） 板自制
多克隆兔抗 REC-8 SDIX29470002
Alexa 488 偶联抗体在山羊中产生Thermofisher ScientificA-21236
细胞骨架染料鬼笔环肽 Thermofisher ScientificA-12380
DAPI 赛默飞世尔科技 62248
聚-L-赖氨酸 Sigma AldrichP5899
四醇 Sigma AldrichP5899
MgSO4Sigma AldrichM7506
1M HEPES 缓冲液，pH 7.4 Sigma AldrichG0887
10X PBS pH 7.4 Thermofisher ScientificAM9625
吐温-20 Sigma AldrichP1389
EGTASigma AldrichE3889
37% 多聚甲醛溶液Merck Millipore1040031000
正常山羊血清Sigma AldrichG9023
Fluoroshield 固定剂 Sigma AldrichF6182
乙醇 Millipore 
甲醇Sigma Aldrich34860
20°;C 和25 度C孵化器 任何品牌
的光学显微镜任何品牌
的共聚焦显微镜  任何品牌（徕卡、蔡司）
配备 Imaris 套装 8.4.1 或更高版本的计算机，使用软件和 Matlab 软件的完整许可。Bitplane
磷酸缓冲盐水，pH 7.4自制
特氟龙显微镜载玻片 泰克顿  941-322-8288
1009832511

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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