我们提出一种用于三维重建的自动化方法 秀丽隐杆线虫 生殖系. 该方法可确定生殖系中每个细胞核的数量和位置，并分析生殖系蛋白质分布及细胞骨架结构。
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本文内容
摘要
摘要
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称 C. elegans）的生殖系被广泛用于研究多种重要的生物学过程，包括干细胞发育、细胞凋亡以及染色体动态。尽管生殖系是一个优秀的研究模型，但由于三维分析所需的时间和劳动强度较大，目前多数分析仍局限于二维层面。此类研究中的主要观测指标包括细胞核的数量/位置以及生殖系内蛋白质的分布情况。本文介绍一种利用共聚焦显微镜和计算方法对生殖系进行自动化分析的技术，可确定生殖系各个区域中细胞核的数量和位置。该方法还可分析生殖系中蛋白质的分布，从而实现对不同遗传背景下蛋白质表达的三维检测。此外，我们的研究揭示了生殖系不同区域中细胞骨架结构的差异，这些差异可能适应了特定的空间发育需求。最后，本方法还能实现对每个生殖系的受精囊中精子数量的自动化计数。综上所述，该方法可实现对 C. elegans 生殖系快速且可重复的表型分析。
引言
信号通路在哺乳动物中的保守性使得 秀丽隐杆线虫 研究多种生物过程的优秀模型1,2在我们的实验室中，我们使用 秀丽隐杆线虫 生殖系用于研究干细胞发育、细胞凋亡和基因表达。尽管生殖系是一种三维结构，但由于三维分析耗时且劳动密集，许多研究仍采用二维方法。二维分析很可能无法准确呈现 体内 生殖系中的事件。该 秀丽隐杆线虫 成年雌雄同体具有两条生殖系臂，每条臂内含一个体细胞远端顶端细胞（DTC），该细胞维持远端生殖细胞处于未分化状态3,4这些生殖细胞在远离远端丝状细胞（DTC）并脱离其影响后开始分化，当它们到达生殖腺近端时，分别发育为卵细胞和精子。在此过程中，生殖细胞的细胞核先进行有丝分裂，随后转变为减数分裂。5,6精子的生成在发育的幼虫第四阶段（L4）完成，此后在成虫期开始产生卵母细胞。精子储存在受精囊中，在此处使卵母细胞受精并形成胚胎。
多种遗传和环境因素均可影响 C. elegans 的生殖系发育，导致细胞核数量、凋亡事件数量、染色体动态行为以....
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方案
1. 准备与线虫培养
注意：所有产品信息请参见材料表。
- OP50 Escherichia coli 培养物：将 OP50 菌株在溶菌肉汤（LB）（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.5% NaCl，pH 7.0）中于 37 °C 无抗生素条件下过夜培养。
- 将 400 µL OP50 菌液接种至线虫生长培养基（NGM）平板（含 1.5 g NaCl、8.5 g 琼脂、1.25 g 蛋白胨、1 mL 1 M CaCl2、1 mL 5 mg/mL 乙醇溶解胆固醇、1 mL 1 M MgSO4 和 25 mL 1 M KPO4 缓冲液）上，室温晾干细菌 48 小时。
- 将线虫转移至已接种细菌的 NGM 平板，并在 15 °C 或 20 °C 下培养。
- 分析成年雌雄同体生殖系时，挑选健康进食的 L4 期线虫至细菌菌苔上，于 20 °C 培养过夜。
- 对雌雄同体线虫进行精子计数时，将 L4 期线虫在 20 °C 下培养 12 小时，直至其达到 L4/成虫蜕皮阶段。为使线虫同步至 L4 期，可通过挑选产卵较多的成虫置于漂白液（1 M NaOH 与漂白剂按 1:1 混合）中制备卵，使卵孵化后挑选 L4 期个体用于实验。
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结果
图1展示了进行三维生殖系分析所需的时间。在20 °C下培养的L4期雌雄同体线虫经解剖以分离生殖系，并使用DAPI、鬼笔环肽以及针对生殖系蛋白的抗体进行染色。利用共聚焦显微镜对生殖系进行成像。染色与共聚焦显微镜成像约需24小时。对完整生殖系进行计算分析需10至15分钟，用于计数细胞核的数量与位置、确定蛋白分布、分析细胞骨架结构以及统计精子数量。而完全手动分析每条生殖系则需超过2小时，且易受操作者主观因素影响。因此，我们开发的自动化高通量方法显著缩短了分析时间，并提高了实验的可重复性。
自动核计数显示，一个生殖腺丝包含约 1,000 - 1,200 个细胞核图2C)，与先前发表的手工评分数据高度吻合1. 为确认评分的准确性，采用多种突变体和不同条件（
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讨论
本实验方案的目标是提高生殖系分析的准确性并减少所需时间。在完成生殖系组织的标准解剖制备后，通过计算机三维重建生成生殖系细胞核的三维模型。三维重建不仅能够观察生殖系细胞核在空间中的分布情况，还可计算生殖系特定区域内的细胞核数量。本方法的关键在于对细胞核的大小和形状参数进行精确界定，而这取决于染色的清晰度以及成像时所使用的放大倍数。我们通过与已发表的手动分析数据进行比较，验证了该方法的准确性1。为进一步确认本方法的准确性，我们在不同条件下检测了多种突变体，并将结果与已发表的文献数据进行比对。结果证实本方法能够有效检测细微表型和显著表型，分别以cpb-3和glp-1突变体为例。此外，该方法对生殖系内或不同品系间细胞核大小与形状的变化具有良好的适应性。这一特性还使得该方法可用于识别和计数生殖系中的更小结构，例如染色体和精子。若有必要，该方法还支持对细胞核大小和形状参数进行进一步的调试与优化。我们的分析揭示了生殖系中细胞核的分布特征，并表明有丝分裂区和粗线期区域的细胞核呈现出不同的排列模式。通过对REC-8和DAPI染色图像进行三维重建，我们还展示了REC-8蛋白.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Monash Microimaging提供的技术支持。Caenorhabditis遗传中心提供了一些菌株，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本研究得到了蒙纳士大学生物医学发现奖学金、澳大利亚国家健康与医学研究委员会项目资助（GNT1105374）、澳大利亚国家健康与医学研究委员会高级研究员奖学金（GNT1137645）以及veski创新奖学金（VIF 23）对Roger Pocock的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 秀丽隐杆线虫 品系：野生型（N2，Bristol） rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III)，cpb-3(bt17) I，glp-1(e2141) III | 秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC） | ||
| OP50 大肠杆菌 细菌 | 自制 | ||
| 线虫生长培养基（NGM）平板 | 自制 | ||
| 多克隆兔抗REC-8抗体 | SDIX | 29470002 | |
| 山羊来源的Alexa 488标记抗体 | 赛默飞世尔科技 | A-21236 | |
| 细胞骨架染料鬼笔环肽 | 赛默飞世尔科技 | A-12380 | |
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO₄4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1 M HEPES缓冲液，pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | 赛默飞世尔科技 | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% 甲醛溶液 | 默克密理博 | 1040031000 | |
| 正常山羊血清 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield 固定剂 | Sigma Aldrich | F6182 | |
| 乙醇 | Millipore | 1009832511 | |
| 甲醇 | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C &和 25°CIncubator | 任何品牌 | ||
| 光学显微镜 | 任何品牌 | ||
| 共聚焦显微镜 | 任何品牌（Leica，Zeiss） | ||
| 配备 Imaris 软件 8.4.1 或更高版本的计算机，具有使用该软件的完整许可证，以及 Matlab 软件。 | Bitplane | ||
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | 自制 | ||
| 聚四氟乙烯显微镜载玻片 | Tekdon | 941-322-8288 |
参考文献
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al.
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重印与许可
