本研究的目的是描述一种制备实用型脂肪-水体模的方案，该方案可进行定制，以制备具有不同脂肪百分比和体积的体模。
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摘要
摘要
随着成像脂肪组织的新技术不断发展，验证此类成像方案的方法正变得愈发重要。体模（phantom）作为目标组织或器官的实验复制品，提供了一种低成本且灵活的解决方案。然而，在缺乏昂贵且专用设备的情况下，构建具有高脂肪分数的稳定体模仍面临挑战。例如., >50%脂肪比例（如棕色脂肪组织中所见）由于脂质的疏水性质，制备过程可能较为困难。本研究提供了一种详细的低成本方案，用于制备5×100 mL 使用基础实验设备（加热板、烧杯）制备脂肪分数为0%、25%、50%、75%和100%的模体 等等）以及易获取的组分（蒸馏水、琼脂、水溶性表面活性剂、苯甲酸钠、钆-二乙烯三胺五乙酸（DTPA）对比剂、花生油和油溶性表面活性剂）。该方案设计具有灵活性，可用于制备不同脂肪分数和多种体积的模体。采用该技术制备的模体在可行性研究中进行了评估，该研究将脂肪-水磁共振成像测得的脂肪分数值与所构建模体中的目标值进行了比较。研究结果得到的组内相关系数为0.998（95%置信区间：0.972–1.000）。综上所述，这些研究表明了该方法的实用性 用于在一系列临床相关组织和器官中验证脂肪组织成像技术的脂肪模拟体
引言
利用磁共振成像（MRI）等影像学手段定量分析脂肪组织和甘油三酯含量的研究兴趣广泛存在于多个领域。研究范围包括白色和棕色脂肪组织库以及脂质在肝脏1、胰腺2和骨骼肌3等器官与组织中的异位沉积。随着这些新型脂肪定量技术的不断发展，亟需建立相应方法以验证成像参数在科研和临床应用中的有效性。
模体（phantom）是组织或器官的实验复制品，为成像技术的开发与验证提供了一种低成本、灵活且可控的工具4。具体而言，可构建具有与临床关注组织相似的体积比或脂肪分数（FF）的脂肪和水混合模体。在临床上，不同组织和器官中的FF值差异较大：棕色脂肪组织的FF介于29.7%至93.9%之间5；脂肪肝患者肝脏的平均FF为18.1 ± 9.0%6；有2型糖尿病风险的成年人胰腺FF范围为1.6%至22.2%7；而在某些晚期疾病情况下，杜氏肌营养不良症患者部分肌肉的FF值可接近90%8。
由于脂质等非极性分子在水等极性分子组成的溶液中难以溶解，制备具有高目标脂肪分数（FF）的稳定模体仍具挑战性。对于FF高达50%的情况，现有多种方法可用于制备脂肪-水模体9,10,11,12。其他实现更高FF的方法通常需要昂贵的设备，如均质器或超声细胞破碎仪13,14。尽管这些技术为高FF模体的制备提供了可行路径，但受限于设备条件以及实验细节的差异，制约了可重复且稳定的脂肪-水模体制备工作的开展。
在先前技术的基础上，我们开发了一种方法，可构建成本低廉且稳定的脂肪-水模体，其脂肪分数（FF）值可根据需要定制。本方案详细说明了使用一个加热板制备5份、每份100 mL、脂肪分数分别为0%、25%、50%、75%和100%的脂肪模体所需的操作步骤。该方法可轻松调整，用于制备不同体积（10至200 mL）和不同脂肪含量（0%至100%）的模体。通过可行性研究，将所构建模体的磁共振脂肪-水成像（MRI）测得的脂肪分数值与目标脂肪分数值进行比较，评估了该模体技术的有效性。
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方案
1. 准备工作站和材料
- 遵守所有实验室安全规定。佩戴护目镜和手套。阅读所用每种试剂的材料安全数据表，并采取适当的预防措施。查阅材料和设备清单、化学品操作规程以及玻璃器皿使用注意事项。
注意：本实验方案需使用高温电热板。操作高温容器时应小心谨慎，佩戴耐热手套，切勿触碰电热板表面。 - 清理工作台面，并用消毒剂清洁台面。洗手后戴上手套。
- 对所有器械及所有玻璃罐内部进行灭菌，以降低污染风险并延长模型的使用寿命。
注：若模型需使用数天以上，应定期用乙醇擦拭模型表面，以防止细菌生长。
2. 准备水溶液
- 为实验准备操作区域 水溶液。将以下材料和设备放置在实验台上：量筒、400 mL 烧杯、搅拌子、天平、两个称量皿、药匙、带针头的 1.0 mL 注射器两支、蒸馏水、钆-二乙烯三胺五乙酸（DTPA）对比剂、水溶性表面活性剂、琼脂和苯甲酸钠。
注意：注射器可配合或不配合针头使用。然而，使用针头可提高测量准确性，并在将内容物加入水相或油相溶液时有助于防止飞溅。 - 将一个搅拌子放入400 mL烧杯中。使用100或200 mL量筒量取300 mL蒸馏水，倒入烧杯中。将烧杯置于加热板上，设置温度为90 °C，搅拌速率为100 rpm。
注意：本实验方案使用高温以实现快速结果。由于溶液在加热板上放置时间较短，加热板的设定温度并不能反映溶液的实际温度。 - 使用校准的天平将0.30 g苯甲酸钠称量至称量舟中。将苯甲酸钠加入水溶液中。
- 使用注射器量取0.6 mL水溶性表面活性剂，确保无气泡。将针头置于溶液中心上方几毫米处，缓慢释放水溶性表面活性剂，避免溅到烧杯壁上。
- 使用一支洁净的注射器，量取 0.24 mL 钆喷酸葡胺（gadolinium-DTPA）对比剂。采用与步骤 2.4 相同的方法将其加入烧杯中。
注意：使用钆喷酸葡胺（Gadolinium-DTPA）调节模体的磁共振成像弛豫特性，以匹配目标组织的弛豫特性。读者可调整所添加钆喷酸葡胺的体积，以更精确地匹配目标组织的弛豫特性。 - 将9.0 g琼脂称量至称量舟中。用刮勺将琼脂缓慢舀入盛有水的烧杯中。
- 将所有成分加入水溶液后，将加热板温度升至 350 °C，搅拌子转速调至 1100 rpm，持续搅拌 5–10 分钟，以完全融化琼脂。
- 检查琼脂是否融化时，将溶液短暂移离加热板，停止搅拌，观察溶液颜色。融化的琼脂应呈透明状（无丝状物或结块），颜色为黄色或琥珀色。
- 琼脂完全融化后，用注射器或直接倾倒，将约3.5 mL水溶液转移至小瓶中。若测试溶液在5–10分钟内未凝固或出现分层，则说明琼脂尚未完全融化。将加热板温度调回350 °C，继续加热溶液。
- 重复步骤 2.8，直至测试管中的水溶液完全凝固。
- 将水溶液留在50 °C、100 rpm的加热板上。清洁工作区域，并准备油相溶液。
- 从实验台上移除以下物品：天平、两个称量皿、药匙、两支带针头的1.0 mL注射器（已使用）、蒸馏水、钆喷酸葡胺造影剂、水溶性表面活性剂、琼脂和苯甲酸钠。
- 将以下材料和设备放置在实验台上：400 mL烧杯（洁净）、搅拌子（洁净）、2.0 mL带针头注射器、花生油和油溶性表面活性剂。
3. 油溶液
- 将一个新的搅拌子放入一个干净的400 mL烧杯中。使用量筒量取300 mL花生油，倒入烧杯中。移开装有水溶液的烧杯，将装有油溶液的烧杯放在加热板上。设置温度为90 °C，搅拌速度为100 rpm，持续1分钟。
注意：使用花生油是因为其核磁共振谱与人体脂肪组织中的甘油三酯相似15。- 切勿让油在加热板上无人看管。如果油温过高并开始冒烟，应立即将其从加热板上移开，降低温度后再放回加热板。
- 使用干净的注射器量取3.0 mL油溶性表面活性剂。采用步骤2.4中所述的相同技术，将油溶性表面活性剂加入烧杯中。将加热板设置为150 °C和1100 rpm，持续5分钟，以充分混合油溶液。
- 将油溶液从加热板上取下，并清理工作台，为制备模体做准备。
- 从实验台上移除以下物品：已使用的带针头的2.0 mL注射器、花生油和油溶性表面活性剂。
- 将以下材料和设备放置在实验台上：250 mL锥形瓶、搅拌子（干净）、移液管、移液管架以及5个120 mL玻璃瓶。
4. 制备模拟乳液
- 为水溶液和油溶液分别准备容量移液管。移液管只能用于对应的溶液，以防止交叉污染。
- 根据实验方案中使用的体积选择合适规格的移液管。例如，使用2支50 mL容量移液管（50 mL水溶液 + 50 mL油溶液）来制备总体积为100 mL、目标脂肪分数（FF）为50%的模体。
- 将水溶液置于加热板上，设置加热板温度为300 °C、转速为1100 rpm。加热4–5分钟后，关闭搅拌器。
- 使用容量移液管检查水溶液是否已准备好进行转移：用少量溶液（5–10 mL）部分充满移液管，再将其释放回烧杯中。如果水溶液能够顺利吸出和排出，且移液管内残留极少，则可进入下一步；否则应继续将其留在加热板上，2–3分钟后再次检查。
注意：水溶液中的成分更容易发生凝固和分层，因此最好尽可能保持水溶液持续搅拌和保温。若在转移前未对水溶液进行加热和搅拌，琼脂容易因冷却而凝结，导致难以准确量取体积。 - 小心地将一根洁净的搅拌子放入250 mL锥形瓶中。将水溶液从加热板上取下，量取所需体积（表2），并转移至该锥形瓶中。
- 将油溶液置于加热板上，设置温度为90 °C、转速为1100 rpm，以确保溶液均匀。加热1–2分钟后，将油溶液从加热板上取下，并将锥形瓶放回加热板上。
- 量取所需量的油溶液（表2），缓慢加入锥形瓶中的水溶液中。
- 待全部油溶液加入后，将温度升至300 °C，并保持搅拌速度为1100 rpm。持续搅拌混合溶液4–5分钟（搅拌子应形成漩涡）。乳液应呈白色，具有奶油状质地。
- 使用磁力搅拌子回收器取出搅拌子。
注意：此后所有乳液制备过程中均应使用搅拌子回收器取出搅拌子。每次使用后应彻底清洁回收器。 - 佩戴耐热手套，小心地将锥形瓶中的混合物倒入一个洁净的120 mL玻璃瓶中。沿玻璃瓶壁缓慢倾倒，以避免混合物冷却过程中产生气泡。
- 清洗锥形瓶和搅拌子，然后重复步骤4.2–4.8，根据需要调整水溶液和油溶液的用量，直至所有模体制备完成。
注意：清洗前请确保玻璃器皿已冷却。
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结果
如果水溶液配制正确，取少量溶液应在测试小瓶中迅速凝固（图1，左侧）。如果溶液发生分层（图1，右侧），则应重新配制溶液（参见方案步骤3.8中的说明）。如果乳剂发生分离（见图2，左侧和右侧示例），则该模型无效，应予以丢弃。出现此情况通常是因为乳剂未达到足够高的温度。
成功的模体将凝结形成均匀的混合物，可通过磁共振成像（MRI）进行成像和测量（图3）。较高的组内相关系数（0.998；95% 置信区间：0.972–1.00），以及回归直线的95%置信带包含恒等线，表明在图像感兴趣区域测得的MRI观察脂肪信号分数（FSF）平均...
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讨论
我们介绍一种可靠的方法，用于制备适用于验证定量脂肪组织和甘油三酯含量的医学成像技术的油水模体 体内通过创建两个储液池（一个用于油溶液，另一个用于水溶液），无需昂贵设备即可构建具有多种脂肪分数（FF）值的稳定模体，包括超过50%的FF值。高FF模体（>50%）可确保用于脂肪定量的成像技术的有效性 适用于脂肪分数（FF）较高的组织或器官，例如棕色脂肪组织5MRI 对 FSF 的估算值与已知的 FF 值具有良好的相关性。
当仅有一个加热板可用时（如本方案所述），如何保持每种溶液的温度是首要考虑的问题。若不进行加热或搅拌，水溶液可能会冷却并开始凝固。为避免此情况，应尽可能将水溶液放置在加热板上（<100 °C，约 100 rpm），并在每次配制仿组织体模之间始终保持加热。重要的是，在提取每种溶液以制备仿组织体模时，油相和水相溶液均应充分混合。在提取溶液前，务必先将相应溶液置于加热板上至少 30 秒（< 100 °C，约 100 rpm）。理想情况下，应分别使用独立的加热板来处理水溶液、油溶液...
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）以及美国国家糖尿病、消化系统与肾脏疾病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, NIDDK）/NIH R01-DK-105371 项目资助。我们感谢胡厚存（Houchun (Harry) Hu）博士在脂肪-水模体构建方面提供的建议与指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蒸馏水 | Amazon | B000P9BY38 | 水溶液基础成分 |
| 琼脂 | Sigma Aldrich Incorporated | A1296-100G | 凝胶剂 |
| 水溶性表面活性剂 | Sigma Aldrich Incorporated | P1379-500ML | 表面活性剂/乳化剂 |
| 钆喷酸二钠对比剂 | Bayer Healthcare | 50419-0188-01 | 磁共振成像对比剂 |
| 苯甲酸钠 | Sigma Aldrich Incorporated | 71300-250G | 防腐剂 |
| 花生油 | Amazon | 54782-LOU | 油溶液基础成分 |
| 油溶性表面活性剂 | Sigma Aldrich Incorporated | S6760-250ML | 表面活性剂/乳化剂 |
| 带搅拌功能的加热板 | Fisher Scientific | 07-770-152 | |
| 搅拌子（卵形） | Sigma Aldrich Incorporated | Z127116-1EA | |
| 400 mL 烧杯 | Sigma Aldrich Incorporated | CLS1003400-48EA | |
| 250 mL 锥形瓶 | Sigma Aldrich Incorporated | CLS4450250-6EA | |
| 25 mL 玻璃容量吸管 | Fisher Scientific | 13-650-2P | 数量 = 2 |
| 50 mL 玻璃容量吸管 | Fisher Scientific | 13-650-2S | 数量 = 2 |
| 75 mL 玻璃容量吸管 | Fisher Scientific | 13-650-2T | 数量 = 2 |
| 3.0 mL 注射器 | Sigma Aldrich Incorporated | Z248002-1PAK | |
| 1.0 mL 注射器 | Sigma Aldrich Incorporated | Z230723-1PAK | |
| 刮勺 | Sigma Aldrich Incorporated | S3897-1EA | |
| 天平（100 g，分辨率 0.01 g） | Amazon | AWS-100-BLK | |
| 称量舟 | Sigma Aldrich Incorporated | Z740499-500EA | |
| 120 mL 玻璃广口瓶 | McMaster Carr Supply Co | 3801T73 | |
| 耐热手套（双） | Amazon | B075GX43MN | |
| 注射器针头 | Sigma Aldrich Incorporated | Z192341-100EA | |
| 18" 搅拌子取出器 | Fisher Scientific | 14-513-70 | |
| 1 dram 透明玻璃小瓶 | Fisher Scientific | 03-339-25B |
参考文献
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