用于科学研究的食蚜蝇（Eristalis tenax）的饲养与长期保育

摘要

这些操作的总体目标是在研究环境中建立、维持并更新一种食蚜蝇（Eristalis tenax）的人工圈养种群。

摘要

全世界估计有6000种食蚜蝇，它们在生态上具有重要意义，可作为家养蜜蜂之外的替代传粉者。然而，食蚜蝇也是一种有用的科学模型，可用于在受控的实验室环境中研究运动视觉和飞行动力学。由于其幼虫在有机污染的水中发育，因此它们也是研究微生物免疫投入的理想模型。尽管目前农业上已存在大规模商业化养殖，但尚无标准化的方案用于科学实验目的的圈养种群维持。这一点尤为重要，因为专注于授粉高峰期大量产出的商业性圈养繁殖项目，可能无法提供全年持续稳定且强健的种群，而这类种群往往是其他研究工作所必需的。因此，亟需一种方法来建立、维持并更新用于科研的圈养种群。本文中，我们描述了人工冬眠循环的应用，以及长期维持黑带食蚜蝇（Eristalis tenax）所需的营养与饲养条件。采用这些方法后，与以往报道相比，我们显著提高了圈养黑带食蚜蝇（E. tenax）种群的健康状况和寿命。此外，我们还讨论了小规模饲养方法，以及优化产量和调控种群结构的可行方案。

引言

食蚜蝇正逐渐成为研究多种科学问题的有用模型，包括飞行行为¹、运动视觉的神经机制²、授粉效率^3,4,5,6 以及微生物免疫⁷。然而，与果蝇（Drosophila）等其他双翅目模式生物不同⁸，目前尚无标准化的实验室饲养食蚜蝇以用于科学研究的方案。尽管现有文献中描述了某些食蚜蝇（如Eristalis tenax）的繁殖方法，但其中许多方法是为大规模养殖食蚜蝇用于作物授粉、有机废物生物降解或解剖学研究而开发的^9,10,11。因此，这些方法并未解决科研中对一种简便、可稳定提供健康强壮个体，同时维持种群遗传适应性的饲养方案的需求。

继蜜蜂和熊蜂之后，食蚜蝇是最重要的野生广食性传粉昆虫类群之一^12,13。全球约有6000种食蚜蝇^14,15，瑞典有超过300种，分属75个属¹⁶ ，印度有超过300种，分属69个属^17,18,19。例如，具有重要农业价值的黄斑蜂蚜蝇 Episyrphus balteatus 以及本研究重点关注的蜂蝇 Eristalis tenax，广泛分布于欧洲、美洲和亚洲^{6,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}。食蚜蝇的活动在一年之中和一天之内并不均匀。实际上，不仅季节和一天中的时间，光照强度、温度、湿度和风速的变化也会影响食蚜蝇的活动模式^26,27。在地中海气候地区，野外全年均可发现 Eristalis 属物种¹¹，但冬季活跃个体数量显著减少。相反，在寒冷温带气候下，Eristalis 会在冬季休眠，大约从10月到次年3月期间在野外无法观察到其活跃行为²⁸。

可在野外用网捕捉自由飞行的食蚜蝇。事实上，在温带气候条件下，它们在夏末至整个秋季的晴朗无风天气中，于上午中段至晚些时候数量最为丰富^26,27。或者，也可从腐烂的有机物（如粪堆或有机污染的溪流）中识别并采集成熟的 E. tenax 幼虫（二龄或三龄幼虫）^10,11。事实上，已发表的 E. tenax 实验室饲养技术均基于在有机污染的水中培养幼虫，污染源可以是某种形式的植物残体或粪便物质^{9,10,29,30,31,32,33}。然而，幼虫的采集受季节限制，仅在晚春至秋季初期可行¹¹。此外，幼虫的数量还受当地天气模式的影响，环境温度的变化会影响产卵行为以及幼虫的发育速率^9,28。

因此，需要通过在实验室中饲养食蚜蝇的幼虫和卵来维持健康的种群，以确保实验能够全年进行，不受季节或当地天气事件的影响。尤为重要的是，本文所述技术仅使用野外交配的雌性个体进行繁殖。这一点至关重要，因为Francuski的一项研究指出， 等¹⁰ 发现，最初由120只成熟幼虫建立的食蚜蝇实验室种群的遗传多样性迅速丧失。因此，他们建议，为了维持用于农作物商业授粉的种群遗传多样性，每年春季需通过采集野外个体对种群进行补充，甚至完全重新建立¹⁰.

在研究视觉或其他用于求偶和交配的感官时，我们建议保持遗传多样性，方法是定期重建种群或通过从野外采集个体来补充种群。这一点非常重要，因为性选择会影响种群的遗传漂变。事实上，在自然环境中，雄性食蚜蝇需要识别并拦截合适的配偶，同时通过保卫领地与其他雄性竞争交配权³⁴。这一过程确保了具有最佳视觉和空间注意力的雄性更有可能在交配中取得成功，因此这些性状得以传递给下一代。这些持续进行的过程所产生的结果，部分体现在食蚜蝇视觉通路中存在的性二型现象^35,36。在人工饲养条件下，雄性并不面临与野外相同的成功交配障碍：首先，雌性容易获得；其次，狭小且封闭的饲养环境消除了领地行为的影响，而这种行为在自然条件下会阻止其他竞争性雄性的交配机会。在Drosophila melanogaster中，实验性地消除性选择已被证明对人工种群产生显著影响，表现为整体体型减小、睾丸尺寸缩小、精子产量降低³⁷，以及雄性求偶行为频率下降³⁸。因此，若人工繁育项目完全不考虑性选择因素，可能对后续开展的视觉和行为研究产生深远影响。

本文介绍一种简单且经济高效的方案，可稳定提供健康的食蚜蝇。该方案具有灵活性，可根据研究需求轻松重启和/或扩大规模。

方案

1. 建立食蚜蝇（E. tenax）人工饲养种群

1. 通过采集成熟幼虫（步骤 1.2）或采集自由飞行的食蚜蝇（步骤 1.3）建立种群。
2. 成熟幼虫的采集
   1. 从奶牛场的粪坑中采集二龄和三龄幼虫。
      注：成熟幼虫在迁徙初期最容易找到，因为此时它们正主动寻找阴暗干燥的环境以化蛹。通常在粪坑边缘附近可发现，此处潮湿的粪便与含有大量稻草的较干燥区域相邻。我们在瑞典乌普萨拉附近的一家奶牛场获得许可后进行了采集。
   2. 按照步骤 3.2 所述，用牛粪饲养成熟幼虫。
3. 野生食蚜蝇的采集
   1. 在野外使用网具采集野生食蚜蝇，通常选择植物种类丰富的植物园和公园。
      注：我们在多个地点获得了采集许可，包括阿德莱德植物园中的任意一处、澳大利亚南澳大利亚州迈庞加的一家乳品农场，以及瑞典乌普萨拉市内的多处植物园和公园。
   2. 按照步骤 2 所述，饲养野外采集的食蚜蝇。

2. 食蚜蝇的饲养与长期保育

1. 将20只或更少的食蚜蝇饲养于30 cm × 45 cm的塑料袋中，较大群体则饲养于昆虫饲养笼（25 cm × 25 cm × 25 cm）中。
2. 提供食物和水 随意摄取，以10-20粒蜂花粉和2-3 mL蜂蜜的形式置于数个湿润的棉球上。
   注意：使用塑料袋饲养时，棉球应保持湿润但不可过度饱和，因为袋内积水会降低存活率。相反，在昆虫饲养笼中饲养时，由于笼体网状侧壁会导致大量水分蒸发，因此应将棉球置于浅容器中并完全浸透。
   1. 让食蚜蝇在室温下取食6小时。
   2. 将食蚜蝇连同食物和水一起放入饲养容器中，置于8-10 °C的冰箱内，并保持完全黑暗环境。
      注意：将食蚜蝇置于黑暗环境中8-10 °C条件下储存，可使其进入休眠状态，活动能力和代谢速率均会降低。
3. 每隔3-4天将食蚜蝇从冰箱中取出，以中断人工冬眠状态，使其能够进食和进行理毛行为。
   1. 将食蚜蝇转移至新的塑料袋或装有新鲜食物和水的清洁昆虫饲养笼中。少量个体可手动转移，大量个体则可利用趋光性进行转移。
   2. 利用趋光性，将一个洁净的昆虫饲养笼与旧笼连接，确保两者之间有开口，使食蚜蝇可在两笼间自由移动但不会逃逸。用不透光的织物覆盖旧的昆虫饲养笼。食蚜蝇将趋向光源，移入洁净的昆虫饲养笼中。
4. 让食蚜蝇在室温下取食和梳理6小时。
5. 将食蚜蝇连同其饲养容器中的食物和水一起放回冰箱，在8-10 °C及完全黑暗条件下继续进行人工冬眠。
6. 每隔3-4天重复一次打破滞育的循环，以确保食蚜蝇在人工饲养期间的健康与存活时间。

3. E. tenax 的实验室饲养

1. 从牧场采集的后期成熟幼虫（步骤 3.2），或 alternatively 培养野外捕获的怀卵雌虫所产的卵（步骤 3.3）。
2. 从牧场牛群中实验室培育成熟幼虫
   1. 将从奶牛场牛粪中采集的幼虫放入30 L的桶中。
   2. 将装有成熟幼虫的桶置于一个较大的箱或袋中（最小容积为50-60 L），并加入20-30 L木屑，使木屑高度达到桶口边缘。
      注意：这允许 3^rd 使龄期幼虫爬入木屑中化蛹。
   3. 从天花板悬挂双层蚊帐，使其垂覆于箱子和/或袋子上方，以确保幼虫或羽化的食蚜蝇均无法逃逸。
      注意：作为预防措施，可使用双面胶带围绕装置一周，以防逃逸的幼虫粘附在胶带上化蛹。若发生此情况，应在成虫羽化前移除蛹。
   4. 将幼虫和蛹置于室温（21.5 ± 2.5 °C）下饲养，在办公时间内暴露于间接阳光和室内灯光下，或维持12小时光照：12小时黑暗的光周期。
      注意：24小时持续光照可能对存活率产生不利影响。从 cattle farms 采集的幼虫，其化蛹时间因采集时的成熟度而异，通常在采集后1–20天内发生。
   5. 在预期羽化日期之前，于悬挂的蚊帐围栏内（按步骤2.2准备）提供食物和水，并每2-3天更换一次。羽化将在化蛹后7-10天发生。
   6. 让新羽化的食蚜蝇在室温下取食6小时，然后按照步骤2所述将其放入饲养装置中。
3. 野生 gravid 雌虫所产卵的实验室培育
   1. 检查食蚜蝇饲养容器中的卵，分别在更换饲养容器前（步骤2）以及将其放回冰箱前进行。野外捕获的怀卵雌蝇在8-10 °C和室温条件下均可产卵。
      1. 将卵放入含有70 mL自来水的100 mm × 20 mm培养皿中，于室温下静置直至孵化，通常在产卵后2-3天内完成。
   2. 将孵化的幼虫放入一个2.3 L的桶中，桶内含有1 L新鲜兔粪和1 L自来水。
      1. 每隔 2-3 天检查一次浆液，根据需要添加适量自来水，以确保浆液在第 3 天之前不会干涸^rd 龄幼虫孵化。
   3. 将装有兔粪浆液及幼虫的桶置于一个较大的容器（最小容积30 L）内，容器中加入20 L木屑，确保木屑高度达到桶口边缘。
      注意：这允许 3^rd 使龄期幼虫爬入木屑中化蛹。
      1. 在盒子上方覆盖双层蚊帐，以确保幼虫和羽化的食蚜蝇均无法逃逸。
   4. 将幼虫和蛹置于室温（21.5 ± 2.5 °C）下饲养，在工作时间暴露于间接阳光和室内灯光下，或维持12小时光照：12小时黑暗的光周期。
      注意：24小时光照可能对存活率产生不利影响。
   5. 预计在15至20天后发生化蛹。收集蛹并置于昆虫饲养笼中，使食蚜蝇在其中羽化。
   6. 在预期羽化日期之前提供食物和水（按2.2步骤制备），羽化将在化蛹后6-10天发生，每2-3天更换一次。
   7. 让食蚜蝇在室温下进食6小时后，再按步骤2所述将其放入饲养装置中。
      注意：将幼虫和蛹置于 8–10 °C 黑暗条件下储存，可延缓幼虫化蛹和蛹羽化。储存幼虫时使用兔粪浆，储存蛹时使用木屑。

结果

我们开发了一种三步策略，可维持食蚜蝇种群的健康状态，以用于视觉和行为研究（总结见图1）。该方法首先从野外采集食蚜蝇（步骤1，图1）。在实验室中，将食蚜蝇饲养于昆虫饲养笼或塑料袋内，并置于人工冬眠周期条件下（步骤2，图1），可显著延长其寿命。为增加个体数量，可从野外交配后的雌虫繁殖后代（步骤3，图1）。

我们发现，即使在环境条件有利的情况下，捕捉大量野生食蚜蝇也是一项耗时的工作。相比之下，从养牛场的粪坑中采集成熟幼虫并成功饲养，是获取大量野生食蚜蝇更为高效的方法（步骤1， 图 1），我们最多可采集到700条幼虫，采集面积为0.03 m²³ 粪便。此外，我们对捕获的怀卵雌性个体所产卵的孵化技术已被证明是成功的（步骤3， 图 1）。在地中海气候区（阿德莱厄）秋季和冬季捕获的雌虫产下了多批卵，在20周内共观察到19只雌虫产下24个卵块。其中10批卵被放入水中，全部具有受精能力并孵化出幼虫。随后选取3组幼虫继续培养，将其置于兔粪浆液中，最终羽化出163 ± 34（均值 ± 标准差，N=3）只食蚜蝇，性别分布无明显偏倚（图 2).

通过比较实验室饲养的雌性食蚜蝇与野外捕获个体的体重和运动活性，评估其健康状况。运动活性采用运动活性监测系统（LAMS）进行评估，方法如前所述³⁹。在人工冬眠周期下饲养4个月后，实验室饲养与野外捕获的食蚜蝇在体重（图 3A）和运动活性（图 3B）方面均未观察到显著差异。当不使用人工冬眠周期在实验室中维持E. tenax时，其寿命显著缩短，寿命仅为2.5至3个月（5只雌性为73 ± 7天，11只雄性为79 ± 4天）。而当食蚜蝇处于人工冬眠条件下时，其寿命可超过12个月。

此外，通过比较实验室饲养的食蚜蝇两性在长时间内的体重变化，进一步评估了采用我们所述方法进行长期维持的效果。我们观察到，在4个月的时间内，两性食蚜蝇的体重均显著增加，且雌性个体的体重始终高于雄性（p < 0.0001，双因素方差分析，N=12，图4）。

图 1: 健康圈养种群维持方法的流程图 E. tenax. (1此处所述的操作流程始于从牛粪中采集成熟幼虫（步骤1.2）或自由飞行的食蚜蝇成虫（步骤1.3）。2食蚜蝇根据数量多少被饲养在昆虫饲养笼或塑料袋中。它们被置于人工冬眠循环条件下，温度保持在8-10 °C，每隔3-4天更换一次。3收集的幼虫保留在其原有的牛粪中（步骤 3.2）。在实验室中产下的卵置于兔粪悬液中（步骤 3.3）。当发育至成熟阶段时，3^rd 二龄幼虫爬入周围的木屑中化蛹。羽化发生在6-10天后，将羽化的食蚜蝇移入饲养装置中（步骤2）。 请点击此处下载此文件。

图 2：从单个卵批次成功培育出的E. tenax的数量及性别比例。 数据显示了从实验室中野生捕获雌蝇所产的3批卵发育而来的蛹羽化的 E. tenax 数量。数据以不同颜色标示果蝇的性别。性别比例之间无显著差异。

图 3: 长期圈养后对实验室饲养与野外采集的雌性食蚜蝇种群健康状况的评估。（A） 人工越冬条件下圈养4个月后，实验室饲养与野外捕获的雌性食蚜蝇体重比较（N=12）。 （B） 人工越冬条件下饲养4个月后，实验室培育与野外捕获的雌性食蚜蝇活动水平。食蚜蝇的运动活动通过运动活动监测系统记录，以个体移动时阻断红外光束的次数进行测量。与之前相同，我们取进入运动活动监测系统后的第二个完整天的中午连续6.7小时内的活动量均值。³⁹ (N_野外捕获9，N_{实验室培育}=12)。每个箱线图的中心标记表示中位数，方框的边缘表示25^th 至 75^th 数据的百分位数，须线从最小值延伸至最大值。

图 4: 长期维持对实验室饲养的两种性别食蚜蝇体重影响的比较 数据显示了在人工冬眠条件下圈养期间食蚜蝇体重随时间的变化。所有食蚜蝇均来自本实验室所产卵（每个数据点 N=12），且 t=0 对应蛹孵化时间，因此圈养时间与动物年龄相同。每个箱线图中央标记表示中位数，箱体边缘表示第25百分位数和第75百分位数。^th 至 75^th数据的百分位数，须线从最小值延伸至最大值。 

讨论

利用我们的技术（图 1），食蚜蝇已在实验室中维持超过1年，并在圈养7个月后仍成功用于行为学实验³⁹。事实上，尽管这看似违反直觉，但在更接近自然的环境中饲养食蚜蝇（12小时光照：12小时黑暗条件，室温下），其寿命反而显著缩短至2–3个月。将E. tenax置于我们的人工冬眠循环中维持超过一年，远长于以往采用不同方案的研究结果（77天³³、4个月⁹、18周³⁰）。延长寿命的主要因素可能是采用了8–10 °C的人工冬眠条件。通过每3–4天周期性地中断冬眠（步骤2，图 1），我们使食蚜蝇能够摄食和自我清洁，从而维持其营养状态和健康状况；这一点得到了体重增加（图 4）以及长期圈养后运动活动未发生改变（图 3，另见³⁹）的证据支持。事实上，文献中报道的人工冬眠失败案例均未周期性中断冬眠过程，从而导致死亡率升高和霉菌滋生⁹。

此外，关于将花粉作为食物来源是否合适，文献中仍存在一些争议。多篇论文指出，蜂花粉本身并不充足，特别是对于产卵而言，只有提供干燥或新鲜的花粉才合适^9,29。我们的研究结果表明，通过在蜂花粉基础上补充蜂蜜和水，可显著延长食蚜蝇的寿命并促进其产卵，即使在长期圈养条件下，两性个体体重均有所增加（图 4），且雌性在圈养超过5个月后仍能持续产卵³⁹。这种寿命的延长使我们能够对食蚜蝇各个生活阶段的行为进行系统研究。

在野外，雌性食蚜蝇在季节性冬眠前完成受精，并进入生殖滞育状态，此时精子被储存，卵母细胞保持未发育状态，直至春季²⁸。鉴于一只典型的雌性个体可在60天内产卵3000枚²⁹，因此人工饲养这些卵是快速高效扩大圈养种群数量的有效途径。然而，目前对于冬眠结束后促使卵母细胞发育的相关因素仍了解有限。温度、湿度、光照强度和营养状态均被认为在调控生殖滞育过程中发挥一定作用^28,40。对这些因素进行实验性调控，可能有助于更有效地控制产卵的时间和速率。

类似地，我们已成功通过在8-10 °C黑暗条件下储存2周来延缓幼虫的发育以及蛹的羽化，尽管其存活时间可能更长。事实上，Heal³⁰ 报道指出，当蛹期温度从25 °C降至10 °C时，蛹期可延长至多37天。采用这些策略，延缓卵的产生和/或蛹的发育，将有助于更有效地调控人工饲养种群的种群结构。

尽管与高产量相比，供应的时间稳定性对我们的需求更为重要，但对于其他用途（如温室中的授粉）而言，产量可能更加关键。我们发现，使用兔粪饲养时，每个卵块可羽化出163 ± 34只食蚜蝇（N=3）。鉴于典型雌虫可产卵多达200枚⁴⁰，我们或许可通过降低幼虫密度过高和食物竞争，或通过调节温度来进一步提高产量，因为这些因素已被证实显著影响幼虫生长^9,31,40,41。然而，并无证据表明培养基成分对产量有显著影响³²。此外，与其他脊椎动物粪便相比^29,30,31,42，兔粪相对无味，因此可在常规实验室条件下饲养种群，无需额外通风。降低培养基中幼虫密度，添加酵母等营养补充物，并将温度维持在20–25 °C之间，可能已足以充分优化产量^31,32,40。

对于小规模研究项目而言，收集足够数量的自由飞行的食蚜蝇，或维持一个遗传多样性丰富的圈养种群，均不切实际且耗时。因此，可通过饲养野生交配雌蝇的后代，并通过采集成熟幼虫来补充样本供应。⁷，为全年使用提供了最实用的选择 E. tenax 在研究环境中，由于这些方法受限于可采集样本的季节，因此有必要确保成年食蚜蝇的长期存活，并对捕获的怀卵雌蝇所产的卵进行人工饲养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蜂花粉	Forest Super Foods		任何品牌的蜂花粉均可使用
蜂蜜	Bramwells		任何品牌的液态蜂蜜均可使用
兔粪			可用牛粪或猪粪制成的浆状物替代
BugDome	Australia Entomological Supplies	EM42222
塑料袋	Woolworths Homebrand
蚊帐网	Clas Ohlson	34-1113
棉球	Woolworths Select
冰箱	Hisense		冰箱需维持稳定的 8-10°C
桶（2-3L）
大型塑料箱（30L）
木屑	Pollards Sawdust Supplies	MaxiFlake (75)
封口夹	IKEA	Bevara 303.391.70
培养皿（100mm x 20mm）	Corning	430167