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方法文章

利用二溴马来酰亚胺-二硫键化学法制备偶联诱导荧光的聚乙二醇化病毒样颗粒

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DOI：

10.3791/57712

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2018年5月27日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用二溴马来酰亚胺对Qβ病毒样颗粒（VLP）上的二硫键进行荧光功能化的实验方法。我们描述了Qβ的表达与纯化过程、二溴马来酰亚胺功能化分子的合成，以及二溴马来酰亚胺与Qβ之间的偶联反应。所得到的黄色荧光偶联颗粒可作为细胞内的荧光探针使用。

摘要

病毒样颗粒（VLPs）在生物医学和材料研究中的应用近期迅速增长，这归因于其易于生物合成、尺寸均一、可遗传编程以及可生物降解的特性。尽管这些水相形成的衣壳非常适合通过生物偶联反应在其表面添加合成配体，但目前针对它们的生物偶联方法种类仍相对有限。为了推动功能型生物材料研究的发展，必须考虑非传统的生物偶联反应。本实验方案所描述的反应利用二溴马来酰亚胺，对基于噬菌体Qβ的病毒样颗粒中暴露于溶剂的二硫键进行修饰，从而引入新的功能基团。此外，最终产物具有荧光性，结合市售滤光片组，可进一步作为可追踪的in vitro探针使用。

引言

利用纳米级病毒衣壳已成为一个令人瞩目的研究领域，旨在拓展其在生物医学研究中的应用范围1,2,3。重组表达的病毒样颗粒（VLPs）在结构上源于病毒，但缺乏原始的病毒遗传物质，因此属于无感染性的蛋白质纳米颗粒。由于其表面特征可通过基因编程控制，且每个衣壳的表达与其前后完全一致，因此能够以原子级精度确定氨基酸反应性侧链的位置和数量。在许多情况下，衣壳的内外表面均含有多种溶剂暴露的氨基酸残基，这些残基可通过生物偶联反应进行功能化修饰——即在生物分子与合成分子之间形成共价键的化学反应4,5。

生物偶联反应能够以相对简便的方式使目标生物分子具备更多样化的功能。在将治疗性药物6、荧光标记物7和聚合物8,9等目标分子连接到病毒样颗粒（VLP）表面之前，可预先对其进行合成和表征。在生物医学和生物材料研究中，一种特别常见的VLP是基于噬菌体Qβ的病毒样颗粒；该颗粒经重组表达后形成直径为28 nm的二十面体病毒衣壳10。Qβ上最常见的反应位点是赖氨酸残基，但近期我们已报道了通过Haddleton-Baker反应成功将二溴马来酰亚胺类化合物偶联至Qβ孔道内还原态二硫键上的研究进展11。该反应产率良好，更重要的是，反应过程中颗粒的热稳定性得以保持。同时，该反应可产生偶联诱导的荧光信号，可用于追踪这些颗粒进入细胞的过程。在本研究中，我们展示了通过Haddleton-Baker反应将聚乙二醇（PEG）偶联至Qβ表面，从而生成强黄色荧光团的方法。这些颗粒随后可在被细胞摄取时进行实时追踪。本文所述实验方案将有助于研究人员基于Qβ开发新型荧光标记的PEG化蛋白纳米颗粒，且其原理亦适用于其他多种含有溶剂可及二硫键的VLP。

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方案

1. 准备

  1. 制备LB（Lysogeny broth）琼脂并倒平板12。
  2. 将含有wtQβ衣壳蛋白序列的pET28质粒转化至BL21(DE3)中。
    1. 在冰浴中解冻E. coli BL21(DE3)感受态细胞。取50 μL细胞置于微量离心管中。
    2. 向其中一管加入2 μL质粒，轻轻弹击管壁混匀，然后在冰上孵育30分钟。
    3. 将细胞在精确控温为42 °C的水浴中热激45秒。热激后立即将离心管放回冰浴中，继续孵育5分钟。
    4. 加入950 μL不含任何抗生素的LB液体培养基。
    5. 在37 °C、200 rpm条件下振荡培养60分钟。
    6. 取100 μL菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。必要时挑选白色菌落。
  3. 制备SOB（Super Optimal Broth）液体培养基。
    1. 将两个2 L带挡板的锥形瓶在超干循环条件下进行高压灭菌。
    2. 在无菌环境下，向每个锥形瓶中称量并加入20.0 g胰蛋白胨、5.0 g酵母提取物、2.469 g无水硫酸镁、0.584 g氯化钠和0.186 g氯化钾。
    3. 用超纯水定容至1 L，并在液体循环条件下进行高压灭菌。
    4. SOB培养基高压灭菌后冷却至室温，向每升培养基中加入1 mL卡那霉素溶液（100 mg/mL），4 °C保存。
  4. 制备0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.00）。
    1. 将68.045 g磷酸二氢钾溶于500 mL超纯水中，配制成1 M磷酸一碱溶液。
    2. 将87.09 g磷酸氢二钾溶于500 mL超纯水中，配制成1 M磷酸二碱溶液。
    3. 取38.5 mL磷酸一碱溶液和61.5 mL磷酸二碱溶液，加入1 L容量瓶中。
    4. 必要时调节pH至7.00，并用超纯水定容至1 L。
  5. 在0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.00）中制备5–40%的蔗糖梯度。
    1. 在50 mL离心管中，用0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.00）配制5–40%（以5%为增量递增）的蔗糖溶液。
    2. 使用长针头注射器将3.3 mL的5%蔗糖溶液缓慢注入38 mL圆底聚碳酸酯离心管底部，并对另外五个离心管重复此操作。
    3. 小心地将3.3 mL的10%蔗糖溶液注入同一离心管底部，随后缓慢抽出针头，避免扰动已形成的梯度。对其他五个离心管重复此步骤。
       
  6. 继续小心地逐层加入3.3 mL的蔗糖溶液，依次从15%递增至40%，注意避免扰动已形成的梯度。
  7. 完成后，用铝箔封住梯度管口，并于-80 °C保存。

2. Qβ的表达

  1. 用1:1的漂白剂/乙醇擦拭实验台区域。
  2. 在无菌环境中，分别接种单菌落制备两份3 mL的预培养物 E. coli 在无菌环境中，将BL21(DE3)接种至3 mL SOB培养基中。
  3. 在37 °C、0%相对湿度（rH）环境中，以250 rpm振荡培养过夜。
  4. 在SOB培养基中接种起始培养物：
    1. 从摇床中取出两个3 mL的种子培养物，在无菌环境下，将每份种子培养物分别倒入装有1 L新鲜SOB培养基的两个2 L带挡板的锥形瓶中。
    2. 将接种后的培养基置于37 °C、0% rH的环境中，以250 rpm振荡培养。
  5. 在37 °C、0% rH的环境中，以250 rpm振荡培养细菌至OD600 达到 0.9–1.0。
  6. 使用 P1000 移液器加入 1 mL 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达。
  7. 将培养基置于37 °C、0%相对湿度的环境中，以250 rpm转速摇动过夜。 
  8. 次日早晨从摇床中取出培养基，使用1000 mL离心瓶在4 °C条件下以20,621 × g离心1 h，收集细胞。
  9. 弃去上清液，收集细胞沉淀。
    1. 将上清液倒入含有约 5 mL 漂白剂的烧瓶中，以灭活细菌。此为废弃物。
    2. 使用刮勺将离心瓶底部的细胞沉淀刮下，并将沉淀转移至50 mL离心管中。

3. Qβ的纯化

  1. 用约 20–30 mL 的 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.00）重悬细胞沉淀。
  2. 确保重悬液中无团块，然后根据制造商的说明（参见 材料表）使用微流化处理器裂解细胞。至少裂解两次以提高颗粒的得率。
  3. 将裂解液分装至 250 mL 离心瓶中，在 4 °C、20,621 × g 条件下离心 1 小时。
  4. 弃去沉淀，测量上清液的体积（mL）。将该数值乘以 0.265，并向上清液中加入相应克数的硫酸铵。
  5. 在 4  °C、200 rpm 条件下搅拌至少 1 小时，使蛋白质沉淀析出。
  6. 在 250 mL 离心瓶中，于 4 °C、20,621 × g 条件下离心 1 小时。
  7. 弃去上清液，用约 10 mL 的 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.00）重悬沉淀。
  8. 向粗样品中加入等体积的 1:1 氯仿/正丁醇溶液，涡旋混匀数秒。
  9. 将混合液分装至 38 mL 离心管中，在 4 °C、20,621 × g 条件下离心 30 分钟。
  10. 使用巴斯德移液管回收上层水相。注意避免吸取水相与有机相之间形成的凝胶样中间层。
  11. 解冻六根 5–40% 预制蔗糖梯度管，每根上样约 2 mL 提取物。
  12. 在 4 °C 条件下以 99,582 × g 超速离心 16 小时，采用自由减速模式。
  13. 用发光二极管（LED）光源照射每根离心管底部，应可见一条蓝色条带。用长针头注射器回收这些颗粒。
  14. 在 4 °C、370,541 × g 条件下超速离心 2.5 小时，使颗粒沉淀。
  15. 弃去上清液，用 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.00）重悬所得透明纯化颗粒。

4. 产物的定量与验证

  1. 使用 Bradford 法测定产物含量13。
  2. 进行还原性和非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以确认产物14。
    注意：还原性 SDS-PAGE 用于确认衣壳蛋白的分子量；非还原性 SDS-PAGE 用于确认其高级结构。

5. 在Qβ上偶联DB化合物

  1. 还原Qβ上的二硫键。
    1. 将0.0020 g三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶于1 mL超纯水中，配制成100倍浓度的储备液。
      注意：还原前需新鲜配制TCEP。
    2. 取200 µL Qβ（5 mg/mL）加入微量离心管中。
    3. 随后加入20 µL 100倍浓度的TCEP储备液。
    4. 室温孵育1小时。
  2. 使用二溴马来酰亚胺聚乙二醇（DB-PEG）重新桥接被还原的二硫键。
    1. 将0.0017 g二溴马来酰亚胺-聚乙二醇（DB-PEG）溶于100 µL DMF中。
    2. 加入680 µL 10 mM磷酸钠溶液（pH 5.00）。
    3. 将还原后的Qβ加入DB-PEG溶液中，并在365 nm紫外灯下观察混合过程。混合后立即可在365 nm手持式紫外灯下观察到明亮的黄色荧光。
    4. 将反应液置于旋转混合仪上，室温下反应过夜。
  3. 使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置，以1×PBS缓冲液在4 °C、3,283 × g条件下离心20分钟，重复洗涤三次，纯化反应混合物。
  4. 通过非还原性SDS-PAGE和天然琼脂糖凝胶电泳监测偶联反应。
    注意：病毒样颗粒（VLPs）在天然琼脂糖凝胶中以完整颗粒形式迁移，其分离基于电荷、大小和形状。

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结果

二溴马来酰亚胺衍生物可通过二溴马来酰亚胺酸酐与伯胺之间的缩合反应合成15。或者，本研究采用了一种温和的合成方法16，即利用N-甲氧羰基活化的3,4-二溴马来酰亚胺与甲氧基聚乙二醇（PEG）反应，生成DB-PEG（图1）。采用核磁共振（NMR）对化合物结构进行鉴定（图2）。Qβ病毒样颗粒（VLP）是一种直径为28 nm的二十面体蛋白纳米颗粒，由180个相同的衣壳蛋白组成。这些衣壳蛋白通过其α-螺旋结构域与相邻衣壳蛋白的β-折叠结构域形成非共价互锁二聚体17。病毒样颗粒通常因其在高温、极端pH值以及多种溶剂组成条件下具有稳定性而被选用18。在此情况下，由于Qβ衣壳上位于五重和六重对称轴处的180个链间二硫键的存在，其稳定性优于Leviviridac科中...

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讨论

与小规模蛋白质纯化相比，纯化噬菌体Qβ的一个独特步骤是蔗糖梯度离心。在氯仿/正丁醇萃取步骤之后，进一步使用5-40%的蔗糖梯度对Qβ进行纯化。离心过程中，颗粒根据其大小被分离：较大的颗粒迁移至高密度区域，而较小的颗粒则停留在低密度区域。Qβ迁移至梯度的下三分之一处并停留于此，而较小的蛋白质杂质则被截留在离心管顶部。Qβ在蔗糖梯度中形成的胶体悬浮液表现出强烈的丁达尔散射现象，当从下方照射LED光源时，可观察到一条蓝色条带。该条带可通过长针头注射器轻松提取。随后，将含有Qβ的蔗糖溶液通过超速离心形成沉淀，获得清晰的沉淀物。该沉淀物可重悬于所需缓冲液中，或进一步通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行纯化。最终所得颗粒的纯度可通过SDS-PAGE进行验证。

TCEP 在磷酸盐缓冲液中不稳定，因此应在还原反应前用纯水新鲜配制 100 倍浓度的 TCEP 储存液。此外，TCEP 本身不含游离巯基，也不会与其他氨基酸发生反应，因此在进行偶联反应前无需去除过量的 TCEP。二溴马来酰亚胺化合物溶解于 pH 5.00 的磷酸钠溶液中，随后加入还原后的 Qβ。在 pH 5.00 条件下，半胱氨酸（还原态...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

J.J.G. 感谢美国国家科学基金会（DMR-1654405）和德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT）（RP170752s）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB肉汤（Miller） EMD Millipore1.10285.0500
胰蛋白胨，粉末Research Products InternationalT60060-1000.0
酵母提取物，粉末Research Products InternationalY20020-1000.0
无水硫酸镁P212121CI-06808-1KG
氯化钠（结晶/ACS认证）Fisher ScientificS271-10
氯化钾Fisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 水纯化系统Fisher Scientific4474524
磷酸二氢钾Fisher ScientificBP362-1
无水磷酸氢二钾Fisher ScientificP288-500
蔗糖Fisher ScientificS25590B
乙醇Fisher ScientificBP2818500
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX 转子 Fisher Scientific096-041053
硫酸铵P212121KW-0066-5KG
氯仿Alfa Aesar32614-M6
1-丁醇Fisher ScientificA399-4
SW 28 Ti 转子，摆桶式，铝制Beckman Coulter342204: SW 28 Ti 转子 / 342217: 摆桶组件
70 Ti 型转子，固定角转子，钛制，8 × 39 mLBeckman Coulter337922
考马斯亮蓝（Bradford）蛋白质测定试剂盒Fisher ScientificPI23200
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS Hydrochloride）Research Products InternationalT60050-1000.0
四甲基乙二胺Alfa AesarJ63734-AC
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride）Sigma AldrichC4706-2G
2,3-二溴马来酰亚胺 97%Sigma Aldrich553603-5G
聚乙二醇Alfa Aesar41561-22
磷酸钠Fisher ScientificAC424375000
丙烯酰胺/双丙烯酰胺P212121RP-A11310-500.0
十二烷基硫酸钠Sigma AldrichL3771-100G
过硫酸铵Fisher ScientificBP179-100
FV3000 共聚焦激光扫描显微镜Olympus FV3000 
Labnet Revolver 可调式旋转混合仪 Thomas Scientific 1190P25 
1000 mL Sorvall 高性能瓶，聚碳酸酯，带铝盖 Thermo Scientific010-1459
Nalgene 离心管（带盖），聚丙烯共聚物Thermo Scientific3141-0250
Nunc 圆底管；38 mL；聚碳酸酯Thermo Scientific3117-0380
2 L 细口耐热锥形瓶，加厚瓶缘Pyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 离心过滤单元Millipore SigmaUFC801024
M-110P 微流体材料处理器MicrofluidicsM-110P
Nalgene 高速聚碳酸酯圆底离心管Thermo Scientific3117-0380PK
带盖组件的聚碳酸酯瓶Beckman Coulter41121703
量筒，聚丙烯，250 mLPolyLab80005
533LS-E 系列蒸汽灭菌器Getinge533LS-E
TrueLine 细胞培养板，经处理，聚苯乙烯，96 孔，带盖LabSourceD36-313-CS
Falcon 15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-959-53A
微量离心管：1.5 mLFisher Scientific05-408-129
VWR Os-500 轨道摇床VWR Scientific Products14005-830
Tetra Handcast 系统Bio-Rad1658000FC
聚丙烯，250 mLBeckman Coulter41121703
NanoDrop 荧光分光光度计Thermo Fisher Scientific3300
长针头 Hamilton 7693
Exel International 5 至 6 cc 鲁尔锁注射器Fisher Scientific14-841-46
P1000 移液器GilsonF123602
P200 移液器GilsonF123601
P100 移液器GilsonF123615
P20 移液器GilsonF123600
P10 移液器GilsonF144802
Intel Weighing PM-100 实验室经典高精度天平Intelligent Weighting TechnologyIWT_PM100
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX 凝胶，10 孔，50 µLBio-Rad456-1084

参考文献

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