本文介绍了一种利用二溴马来酰亚胺对Qβ病毒样颗粒（VLP）上的二硫键进行荧光功能化的实验方法。我们描述了Qβ的表达与纯化过程、二溴马来酰亚胺功能化分子的合成，以及二溴马来酰亚胺与Qβ之间的偶联反应。所得到的黄色荧光偶联颗粒可作为细胞内的荧光探针使用。
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本文内容
摘要
摘要
病毒样颗粒（VLPs）在生物医学和材料研究中的应用近期迅速增长，这归因于其易于生物合成、尺寸均一、可遗传编程以及可生物降解的特性。尽管这些水相形成的衣壳非常适合通过生物偶联反应在其表面添加合成配体，但目前针对它们的生物偶联方法种类仍相对有限。为了推动功能型生物材料研究的发展，必须考虑非传统的生物偶联反应。本实验方案所描述的反应利用二溴马来酰亚胺，对基于噬菌体Qβ的病毒样颗粒中暴露于溶剂的二硫键进行修饰，从而引入新的功能基团。此外，最终产物具有荧光性，结合市售滤光片组，可进一步作为可追踪的in vitro探针使用。
引言
利用纳米级病毒衣壳已成为一个令人瞩目的研究领域，旨在拓展其在生物医学研究中的应用范围1,2,3。重组表达的病毒样颗粒（VLPs）在结构上源于病毒，但缺乏原始的病毒遗传物质，因此属于无感染性的蛋白质纳米颗粒。由于其表面特征可通过基因编程控制，且每个衣壳的表达与其前后完全一致，因此能够以原子级精度确定氨基酸反应性侧链的位置和数量。在许多情况下，衣壳的内外表面均含有多种溶剂暴露的氨基酸残基，这些残基可通过生物偶联反应进行功能化修饰——即在生物分子与合成分子之间形成共价键的化学反应4,5。
生物偶联反应能够以相对简便的方式使目标生物分子具备更多样化的功能。在将治疗性药物6、荧光标记物7和聚合物8,9等目标分子连接到病毒样颗粒（VLP）表面之前，可预先对其进行合成和表征。在生物医学和生物材料研究中，一种特别常见的VLP是基于噬菌体Qβ的病毒样颗粒；该颗粒经重组表达后形成直径为....
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方案
1. 准备
- 制备LB（Lysogeny broth）琼脂并倒平板12。
- 将含有wtQβ衣壳蛋白序列的pET28质粒转化至BL21(DE3)中。
- 在冰浴中解冻E. coli BL21(DE3)感受态细胞。取50 μL细胞置于微量离心管中。
- 向其中一管加入2 μL质粒，轻轻弹击管壁混匀，然后在冰上孵育30分钟。
- 将细胞在精确控温为42 °C的水浴中热激45秒。热激后立即将离心管放回冰浴中，继续孵育5分钟。
- 加入950 μL不含任何抗生素的LB液体培养基。
- 在37 °C、200 rpm条件下振荡培养60分钟。
- 取100 μL菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。必要时挑选白色菌落。
- 制备SOB（Super Optimal Broth）液体培养基。
- 将两个2 L带挡板的锥形瓶在超干循环条件下进行高压灭菌。
- 在无菌环境下，向每个锥形瓶中称量并加入20.0 g胰蛋白胨、5.0 g酵母提取物、2.469 g无水硫酸镁、0.584 g氯化钠和0.186 g氯化钾。
- 用超纯水定容至1 L，并在液体循环条件下进....
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结果
二溴马来酰亚胺衍生物可通过二溴马来酰亚胺酸酐与伯胺之间的缩合反应合成15。或者，本研究采用了一种温和的合成方法16，即利用N-甲氧羰基活化的3,4-二溴马来酰亚胺与甲氧基聚乙二醇（PEG）反应，生成DB-PEG（图1）。采用核磁共振（NMR）对化合物结构进行鉴定（图2）。Qβ病毒样颗粒（VLP）是一种直径为28 nm的二十面体蛋白纳米颗粒，由180个相同的衣壳蛋白组成。这些衣壳蛋白通过其α-螺旋结构域与相邻衣壳蛋白的β-折叠结构域形成非共价互锁二聚体17。病毒样颗粒通常因其在高温、极端pH值以及多种溶剂组成条件下具有稳定性而被选用18。在此情况下，由于Qβ衣壳上位于五重和六重对称轴处的180个链间二硫键的存在，其稳定性优于Leviviridac科中.......
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讨论
与小规模蛋白质纯化相比，纯化噬菌体Qβ的一个独特步骤是蔗糖梯度离心。在氯仿/正丁醇萃取步骤之后，进一步使用5-40%的蔗糖梯度对Qβ进行纯化。离心过程中，颗粒根据其大小被分离：较大的颗粒迁移至高密度区域，而较小的颗粒则停留在低密度区域。Qβ迁移至梯度的下三分之一处并停留于此，而较小的蛋白质杂质则被截留在离心管顶部。Qβ在蔗糖梯度中形成的胶体悬浮液表现出强烈的丁达尔散射现象，当从下方照射LED光源时，可观察到一条蓝色条带。该条带可通过长针头注射器轻松提取。随后，将含有Qβ的蔗糖溶液通过超速离心形成沉淀，获得清晰的沉淀物。该沉淀物可重悬于所需缓冲液中，或进一步通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行纯化。最终所得颗粒的纯度可通过SDS-PAGE进行验证。
TCEP 在磷酸盐缓冲液中不稳定，因此应在还原反应前用纯水新鲜配制 100 倍浓度的 TCEP 储存液。此外，TCEP 本身不含游离巯基，也不会与其他氨基酸发生反应，因此在进行偶联反应前无需去除过量的 TCEP。二溴马来酰亚胺化合物溶解于 pH 5.00 的磷酸钠溶液中，随后加入还原后的 Qβ。在 pH 5.00 条件下，半胱氨酸（还原态.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
J.J.G. 感谢美国国家科学基金会（DMR-1654405）和德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT）（RP170752s）提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB肉汤（Miller） | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| 胰蛋白胨，粉末 | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| 酵母提取物，粉末 | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| 无水硫酸镁 | P212121 | CI-06808-1KG | |
| 氯化钠（结晶/ACS认证） | Fisher Scientific | S271-10 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 水纯化系统 | Fisher Scientific | 4474524 | |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| 无水磷酸氢二钾 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S25590B | |
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX 转子 | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| 硫酸铵 | P212121 | KW-0066-5KG | |
| 氯仿 | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-丁醇 | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti 转子，摆桶式，铝制 | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti 转子 / 342217: 摆桶组件 | |
| 70 Ti 型转子，固定角转子，钛制，8 × 39 mL | Beckman Coulter | 337922 | |
| 考马斯亮蓝（Bradford）蛋白质测定试剂盒 | Fisher Scientific | PI23200 | |
| 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS Hydrochloride） | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| 四甲基乙二胺 | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride） | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2,3-二溴马来酰亚胺 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| 聚乙二醇 | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| 磷酸钠 | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| 过硫酸铵 | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver 可调式旋转混合仪 | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall 高性能瓶，聚碳酸酯，带铝盖 | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene 离心管（带盖），聚丙烯共聚物 | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc 圆底管；38 mL；聚碳酸酯 | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L 细口耐热锥形瓶，加厚瓶缘 | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 离心过滤单元 | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P 微流体材料处理器 | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene 高速聚碳酸酯圆底离心管 | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| 带盖组件的聚碳酸酯瓶 | Beckman Coulter | 41121703 | |
| 量筒，聚丙烯，250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E 系列蒸汽灭菌器 | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine 细胞培养板，经处理，聚苯乙烯，96 孔，带盖 | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 微量离心管：1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 轨道摇床 | VWR Scientific Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast 系统 | Bio-Rad | 1658000FC | |
| 聚丙烯，250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| NanoDrop 荧光分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| 长针头 | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 至 6 cc 鲁尔锁注射器 | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 移液器 | Gilson | F123602 | |
| P200 移液器 | Gilson | F123601 | |
| P100 移液器 | Gilson | F123615 | |
| P20 移液器 | Gilson | F123600 | |
| P10 移液器 | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 实验室经典高精度天平 | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX 凝胶，10 孔，50 µL | Bio-Rad | 456-1084 |
参考文献
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M.
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重印与许可
