记录行为小鼠海马中空间限制性振荡

摘要

本方案描述了使用多叉线性硅探针记录局部场电位的方法。通过电流源密度分析对信号进行转换，可重建小鼠海马中的局部电活动。利用该技术，可在自由活动的小鼠中研究空间受限的脑节律振荡。

摘要

局部场电位（LFP）源于神经元膜上的离子移动。由于LFP电极记录到的电压反映了大脑组织大范围内总和的电场，因此提取局部活动的信息具有挑战性。然而，研究神经元微环路需要可靠地区分真正局部的事件与来自远端脑区容积传导的信号。电流源密度（CSD）分析通过提供电极附近电流汇与电流源的信息，为这一问题提供了解决方案。在具有层状细胞构筑的脑区（如海马体）中，可通过估算LFP的第二空间导数来获得一维CSD。本文描述了一种使用线性硅探针植入背侧海马体以记录多层LFP的方法。CSD轨迹沿探针的各个分支进行计算。因此，本方案描述了一种在自由活动小鼠海马体中解析空间受限的神经网络振荡的实验流程。

引言

局部场电位中的振荡在神经环路的信息处理中起着关键作用。其频率覆盖范围广泛，从慢波（约1 Hz）到快速的涟波振荡（约200 Hz）。¹不同的频率波段与认知功能相关，包括记忆、情绪处理和导航^2,3,4,5,6,7神经元膜上的电流流动构成了局部场电位信号的主要部分⁸. 进入细胞的阳离子（例如 通过谷氨酸能兴奋性突触的激活，形成局部的主动电流 sinks（正电荷离开细胞外介质）。相反，正电荷净流向细胞外介质，例如通过 GABA 能抑制性突触的激活，则在该位置表现为一个主动电流源。在神经元偶极子中，由于补偿电流影响远端位置的膜电荷分布，电流 sinks 与被动 sources 成对出现，反之亦然。

远端神经活动产生的电场也可能在记录电极上引起显著的电压偏转，从而可能被错误地视为局部事件。这种容积传导现象对局部场电位（LFP）信号的解释构成了严重挑战。电流源密度（CSD）分析能够提供有关LFP信号背后局部电流汇与电流源的信息，因此可作为降低容积传导影响的一种方法⁸。在海马体等层状结构中，可通过垂直于层状平面排列的等距电极记录的LFP信号进行空间二阶导数计算，获得一维CSD信号⁹。商用线性硅探针的出现使研究人员得以应用CSD方法研究海马体中的局部振荡活动。例如，已有研究表明，在CA1区，不同类型的γ振荡以特定层的方式出现¹⁰。此外，CSD分析还识别出齿状回主细胞层中独立的γ活动热点¹¹。重要的是，这些现象仅在局部CSD信号中可见，而在LFP信号中并不明显。因此，CSD分析为深入理解海马体微环路功能提供了一种强有力的工具。

在本实验方案中，我们提供了一种使用硅探针获取一维电流源密度（CSD）信号的全面指南。这些方法将使研究人员能够研究行为小鼠海马中局部的振荡事件。

方案

所有涉及活体动物的实验方法均已获得德国弗莱堡行政区政府根据《德国动物福利法》的批准。

1. 准备工作

1. 设计并制作一种合适的植入工具，在植入过程中临时携带硅探针和电极连接器。示例定制的植入工具参见图1。
2. 使用陶瓷尖镊子小心地将硅探针和电极连接器从包装中取出。
3. 抬起连接器板，并使用固定在支架上的鳄鱼夹将其牢固固定。
4. 在体视显微镜下，使用陶瓷尖镊子将探针与植入工具对齐。用灼烧器熔化石蜡，涂抹约2 mm厚的石蜡层，将探针粘附在植入工具上。操作过程中注意不要触碰探针的针臂部分。
5. 使用普通胶带将电极连接器固定在植入工具的杆部。请注意，根据制造商的不同，接地导线可能需要在植入前焊接到电极连接器板上。使用电烙铁（400 °C）加热焊锡，去除两段漆包铜线的绝缘层，然后将接地导线焊接到电极连接器板的相应插槽中。
6. 去除另外两段铜线的绝缘层。将每根裸露的铜线在不锈钢螺钉（直径1 mm，长度2 mm）上缠绕三圈。使用适用于焊接钢材的助焊剂，将铜线焊接到螺钉帽的底部。确保螺纹的下半部分不沾焊锡。
7. 使用标准万用表检测导线与螺钉之间的电接触是否良好。
8. 将硅探针的针臂部分和接地螺钉浸入70%乙醇中（10秒）进行消毒。
9. 通过将塑料巴斯德移液管的头部切半，为探针植入制作一个保护罩。

2. 植入手术

1. 使用热珠灭菌器对手术器械（剪刀、尖头镊子、手术钳）进行灭菌。用70%乙醇擦拭所有表面。
2. 使用氧气（流速约为1 L/min）输送3%异氟烷诱导麻醉。
   1. 维持麻醉时，使用 1 - 1.5% 异氟烷。请注意，不同动物达到手术耐受所需的异氟烷浓度可能有所差异。
   2. 当动物对脚趾夹捏无反应时，即达到稳定的手术麻醉状态。监测小鼠的呼吸频率，并根据需要调整异氟烷浓度。
   3. 将药膏涂抹于动物眼部，以防干燥。
3. 将小鼠固定于立体定位仪上，轻轻将耳杆插入耳道。当耳杆稳定小鼠头部后，将面罩置于吻部以持续输送异氟烷。将小鼠置于加热垫上的毛巾或垫子上，并皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg 体重）以确保术后镇痛。
4. 用标准剃刀剃除头部毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。使用手术剪沿颅骨中线切开皮肤，再用手术钳撑开皮肤。
5. 使用立体定位对准工具调整动物头部，使前囟（bregma）与后囟（lambda）处于同一水平面，二者之间的高度差应小于50 µm。此外，通过测量前囟在颅骨表面左右两侧规定距离处的深度，调整头部在正中-侧向轴上的水平度。例如， 在前后囟之间左右各 1 mm 处。如有必要，调整头部的倾斜角度。
6. 用3%过氧化氢清洁头部，并用无菌棉片擦干。
7. 根据适当的标准脑图谱，确定颅骨开窗位置相对于前囟的位置¹².
8. 使用0.9 mm钻头，在小脑上方的颅骨上钻两个螺钉孔，用于放置接地螺钉和参考螺钉。此外，建议再钻1–3个用于固定螺钉的孔，以稳定植入物。固定螺钉的位置取决于开颅部位。若植入目标为海马体，则应将固定螺钉置于对侧顶叶皮层和同侧额叶皮层上方。使用合适的螺丝刀将螺钉旋入颅骨，注意避免穿透脑组织。
9. 使用钻头在植入侧周围呈矩形区域缓慢磨薄颅骨，进行开颅手术。操作过程中应频繁用无菌磷酸盐缓冲液（PB）润湿骨面。剩余的薄层颅骨可用细（27G）注射针轻轻刺破，并借助镊子小心移除。
10. 用细（27G）注射针小心刺穿硬脑膜。用镊子将针尖弯成小钩状，钩起硬脑膜并将其移除。滴加磷酸盐缓冲液（PB）以防止脑表面干燥。
11. 将电极插入装置安装在立体定位仪上，以颅骨前囟点为基准将探针归零，然后将探针移至颅骨开孔上方的立体定位坐标处。缓慢刺入脑表面，确保探针杆不发生弯曲。避免通过血管处进行植入。
12. 缓慢降低探针，直至其位于目标深度上方约200 µm处。用灭菌的凡士林覆盖颅骨开窗区域及硅探针的针柄部分以作保护。涂抹牙科水泥，将探针基部固定于颅骨的锚定螺钉上。
13. 在涂抹水泥后，立即将探针缓慢移动至目标深度。涂抹水泥后，再推进最后约200 µm，可减少探针的横向移动，并确保目标区域的组织损伤最小化。需注意，所用水泥的固化时间可能影响本步骤的操作。若使用快速固化的水泥，应省略此步骤，直接将探针植入目标深度，以避免对硅探针造成损伤。
14. 水泥固化后，使用电灼器熔化石蜡，将探针从插入工具上释放。
15. 从植入装置上取下连接板，并使用连接手柄上附带的鳄鱼夹将其固定在颅骨的合适位置。若将探针植入海马体，则将连接板置于对侧顶骨上。使用牙科水泥将连接板固定在颅骨上。
16. 将连接板的接地线和参考电极线焊接到小脑上方两个螺钉所连接的导线上。
17. 修剪保护套至合适高度，并将其套在硅探针上。使用牙科水泥将保护套固定在连接板和颅骨上，注意避免接触暴露颅骨周围的皮肤。通常无需缝合植入部位周围的皮肤。

3. 术后恢复

1. 至少应用适当的镇痛治疗2天（例如 白天每6小时皮下注射一次丁丙诺啡，夜间将其加入饮水中，并联合每24小时皮下注射一次卡洛芬（4–5 mg/kg体重）。建议单只饲养，以防止对植入物造成损伤。
2. 至少留出一周时间用于恢复，并咨询当地动物福利指南。

4. 数据采集

1. 使用通过换向器连接的合适数据采集系统，记录自由活动小鼠的局部场电位（LFP）。为采集 LFP，采样频率应设置为 1 - 5 kHz。若需同时记录单个神经元放电，则需更高的采样率（20 - 30 kHz）。
2. 将各个通道的原始记录文件保存下来，用于离线分析。

5. 组织学

1. 记录完成后，对动物实施深麻醉（例如 按2 g/kg体重剂量腹腔注射乌拉坦。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉状态。
2. 采用标准的心内灌注方法，用冰冻的磷酸盐缓冲液对小鼠进行经心灌注（约1分钟），随后用4%多聚甲醛灌注（约10分钟）¹³灌注前，可对记录位点进行电解损毁（例如 通过施加10 - 20 V恒定电压，持续时间最长1秒）实现。或者，可在植入前将荧光染料涂于探针杆尖端，用于追踪定位。建议测试多种电极位置识别方法，以针对不同类型的硅探针获得最佳结果。
3. 切取脑组织切片（约100 µm），用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1 µg/mL）染色，随后在PB缓冲液中洗涤三次（每次10分钟，室温）。
4. 将切片置于显微镜载玻片上，滴加一滴封片介质，盖上盖玻片。室温下避光干燥过夜。
5. 使用落射荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜确定记录位点的位置。
6. 为尝试回收硅探针以供再次使用，用鳄鱼夹夹住探针，然后使用电烙铁（400 °C）小心熔化牙科水泥，将探针从颅骨上取下。操作过程中切勿触碰探针的探臂！
7. 将探针在热的蒸馏水（约 80 °C，15 分钟）中清洗，随后用酶溶液（1% Tergazyme 溶于蒸馏水，室温下 30 分钟）处理，再用蒸馏水清洗一次（15 分钟）。请注意，探针回收的成功率较低。

6. CSD 分析

1. 使用合适的分析环境（例如 Python），通过沿探针 Shank 近似计算局部场电位（LFP）数据的二阶空间导数，将其转换为电流源密度（CSD），公式如下：
   
   其中 LFP_n,t 表示在时间 t 时第 n^个 电极上的 LFP 信号，Δz 为电极间距。需要注意的是，由于涉及 n−1 和 n+1 的运算，探针 Shank 上第一个和最后一个电极的 CSD 无法估算，因此在探针放置时需考虑此限制。通过一段简短的代码实现该近似公式，在时间维度上迭代计算每个电极的 CSD 信号（参见补充代码文件）。
2. 将获得的 CSD 信号用于后续分析（例如，通过应用带通滤波器研究脑振荡的特定频段）。

结果

图1展示了用于植入硅探针的插入工具。图中显示了针对海马CA1区和齿状回颗粒细胞层的慢性植入式硅探针的记录结果（图2）。我们在动物于家园笼中自由活动时，从探针的探臂上记录局部场电位（LFP）。为了最小化容积导电效应的影响，将获得的信号沿探针的每个探臂转换为电流源密度（CSD）（图2B、D）。在图2B所示的第一个示例中，单个尖波涟漪事件在CA1区的辐射层引起显著的电流流入。在图2C-E所示的第二个示例中，我们从齿状回颗粒细胞层的两个不同位点（横向距离为400 µm）进行记录。通过将60–80 Hz的带通滤波器应用于CSD信号，分离出高伽马频段，揭示了位于颗粒细胞层的两个记录位点之一出现局部伽马爆发（

讨论

越来越多的证据表明，海马神经环路中的脑振荡发生在离散的空间区域^10,11,16。电流源密度（CSD）分析可显著降低容积导电的影响，这是研究局部振荡事件的关键前提。本视频提供了将硅探针植入小鼠海马以进行CSD数据分析的操作指南。我们展示了CA1区尖波涟漪以及齿状回局部伽马振荡的典型CSD信号示例。然而，该方案也可用于研究其他海马振荡活动模式，例如θ振荡或与呼吸相关的网络振荡¹⁷。

植入的成功在很大程度上取决于动物头部在立体定位仪框架中的正确对齐。我们使用固定在立体定位夹持器中的注射针，测量头部在前后方向和内外侧方向上的偏移。依次移动针尖接触前囟和后囟，并通过倾斜立体定位框架来补偿两点高度之间的任何偏差。类似地，测量前囟左右各1 mm处的高度，可指示是否存在内外侧方向的偏移，该偏移可通过向左或向右倾斜框架进行调整。为获得最佳的植入效果，建议偏移量小于&#...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带支架的鳄鱼夹	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
硅探针	Cambridge Neurotech	P-series 32
体视显微镜	Olympus	SZ51
漆包铜线	Bürklin Elektronik	89 F 232
接地螺丝	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
助焊剂	Stannol	114018
陶瓷尖镊子	Fine Science Tools	11210-60
石蜡	Sigma-Aldrich	327204
电灼器	Fine Science Tools	18010-00
电烙铁	Kurtz Ersa	OIC1300
万用表	Uni-T	UT61C
乙醇	Carl Roth	9065.1
巴斯德吸管	Carl Roth	EA65.1
热力灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
立体定位仪	David Kopf	Model 1900
立体定位电极夹持器	David Kopf	Model 1900
异氟烷	Abbvie	B506
氧气浓缩器	Respironix	1020007
丁丙诺啡	Indivior UK Limited
电动剃毛器	Tondeo	Eco-XS
加热垫	Thermolux	463265/-67
手术钳	Fine Science Tools	18050-28
过氧化氢	Sigma-Aldrich	H1009
无菌棉片	Carl Roth	EH12.1
钻头	Proxxon	Micromot 230/E
21G 注射针头	B. Braun	4657527
磷酸盐缓冲液/磷酸盐缓冲生理盐水
立体定位图谱	Elsevier	9.78012E+12
手术剪刀	Fine Science Tools	14094-11
手术镊	Fine Science Tools	11272-40
27G 注射针头	B. Braun	4657705
凡士林
牙科水泥	Sun Medical	SuperBond T&M
卡洛芬	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
记录放大器	Intan Technologies	C3323
USB 数据采集板	Intan Technologies	C3004
记录电缆	Intan Technologies	C3216
电滑环（电气换向器）	Doric lenses	HRJ-OE_FC_12_HARW
数据采集软件	OpenEphys (www.open-ephys.org)	GUI	支持跨平台数据采集
数据采集用计算机
数据分析环境	Python (www.python.org)		支持跨平台数据分析
氨基甲酸乙酯（尿烷）	Sigma-Aldrich
振动切片机	Leica	VT1000
载玻片	Carl Roth	H868.1
盖玻片	Carl Roth	H878.2
包埋介质	Sigma-Aldrich	81381-50G
蒸馏水	Millipore	Milli Q	用于生产蒸馏水的台式设备
特洁酶（Tergazyme）	Alconox	Tergazyme