果蝇分子和免疫组化分析制备周围嗅组织的研制

Summary

在这里, 我们提出了一个阶段和解剖发展的嗅觉组织从果蝇物种的协议。解剖后的组织可用于分子分析, 如定量 rt-pcr (反向转录-聚合酶链反应) 或 RNA 测序 (RNAseq), 以及体内分析, 如免疫组化或原位杂交。

Abstract

果蝇嗅觉系统是发展神经生物学、神经系统神经系统学、神经生理学、行为学和行为进化等广泛应用的系统。果蝇嗅觉组织家的嗅觉受体神经元 (ORNs), 检测挥发性化学线索, 除了水力和热感官神经元。在本议定书中, 我们描述了发展成人果蝇周围嗅觉组织的解剖。我们首先描述如何分期和年龄果蝇幼虫, 其次是解剖的触角盘从早期蛹阶段, 其次是解剖的触角从中蛹阶段和成人。我们还展示了在分子技术中可以利用制剂的方法, 如 RNA 提取 qRT PCR、RNAseq 或免疫组化。这些方法也可以应用于其他果蝇物种后, 物种特定的蛹开发时间确定, 并为适当的老化计算各个阶段。

Introduction

果蝇嗅觉系统是发展神经生物学、神经系统神经系统学、神经生理学、行为研究和行为进化^1、2、3的一种广泛应用的系统, ⁴。果蝇嗅觉组织家的嗅觉受体神经元 (ORNs), 检测挥发性化学线索除了水力和热感官神经元^1,5,6。本手稿的总体目标是演示如何在果蝇物种中进行蛹和成人嗅觉组织的分期和解剖。这种技术的基本原理是从不同的蛹阶段生成样本, 用于对外围嗅觉系统进行分子和发展分析, 如 RNAseq 和定量 rt-pcr, 除了体内组织标记技术.这项技术对于识别发育中的成人嗅觉系统中非腹果蝇物种的转录剖面的动力学特别有用, 因为它没有所有的细胞类型特定的转基因试剂。标签和分析。在这篇手稿中, 我们演示如何解剖触角光盘和触角从蛹和成年果蝇物种。首先, 我们展示了如何识别果蝇0 h 的蛹壳形成 (APF, 白蛹或预蛹) 的发展分期和物种特定的衰老。接下来, 我们展示了如何解剖触角盘和....

Protocol

以下议定书符合杜克大学研究伦理学委员会制定的道德准则。

1.果蝇蛹的组织制备及发育分期

1. 首先, 确定解剖需要多少苍蝇。对于 RT PCR 和 RNAseq, 收集 100-200 触角光盘和触角的个人, 这是必要的 prepupal, 8 h apf, 40 h 有源电力, 和成人阶段。免疫组化, 解剖 10-20 个人。
2. 清洁所有材料, 包括解剖垫和镊子, 使用70% 乙醇的湿巾。如果被解剖的材料用于 RNA 提取, 清洁所有与 RNase 中和剂并且使用无核酸酶或二乙基焦碳酸 (DEPC) 处理的水的所有解答。
   注: 本协议使用硅胶夹层垫代替玻璃进行解剖。硅胶垫是友好的超细钳和促进快速和高质量的解剖。
3. 在 0 h 型 APF/prepupal 阶段采集蛹。
   1. 为了确保最精确的分期, 监测幼虫在30分钟至1小时间隔。
      注意: 在适度拥挤的瓶子里游荡的第三龄幼虫可能会在几个小时内蛹。
   2. 一旦幼虫变得不动, 被一个非常轻 (几乎是白色) 的彩色蛹壳所包围, 将它们转移到一个小的2在培养皿中, 带有湿润的滤纸。
   3. 继续 1-2 小时, 偶尔监视、识别和转移预蛹。
      注: 另外, 清除一瓶所有蛹, 并允许幼虫发育2小时。所有2小时后收集的蛹将在 0-2 h APF 范围内。
4. 立即移动到步骤 ....

Results

经解剖开发的嗅觉组织可用于 RNA 提取, 其次是 rt-pcr 评估基因表达, 或通过免疫组化协议, 以确定其表达模式, 以及基因的亚细胞定位兴趣。在本节中, 我们从任一议定书中提出代表的结果。图 1是典型的定量 rt-pcr, 显示了野生型成人触角中细胞表面受体和嗅觉受体基因的转录。图 2显示了染色 (1:1000) 和抗 lamin 抗体 (1:100) (图 2A和2B) 的 EGFP 转基因苍蝇上的 6-8 h 和 12 h APF 触角盘。EGFP 在触角光盘的早期蛹阶段标记特定区域。我们还显示了 40 h APF 蛹触角抗 GFP 抗体染色Or67d-GAL4 UAS-CD8GFP转基因苍蝇和成人触角抗 elav (1:100) 抗体染色 ORNs (图 .......

Discussion

该协议是一个有用的资源, 实验室有兴趣确定的基因和转录程序在开发果蝇嗅觉组织, 以及对这些项目的比较分析果蝇物种。如果需要从不同发育阶段的系统级转录剖面作为未来研究的入门资料, 则特别有用。这里描述的协议演示了如何分期和隔离开发果蝇的嗅觉组织, 从从前阵列到末端分化的四个关键阶段从嗅觉系统开发中获取样本, 用于分子和免疫组织学研究。解剖果蝇触角盘和触角在不同的蛹阶段可以用来识别基因表达谱在系统水平上的嗅觉系统的发展中的 RNA 序列, 或在个别基因水平的定量 rt-pcr。样品也可用于免疫组化和原位杂交, 以确定组织特异基因表达的体内模式。该协议的另一个优点是, 解剖样本可以进一步分离使用标准方法, 并为获得一个纯化细胞群体 (或单细胞) 细胞类型特异的分子分析, 如定量rt-pcr 或 RNAseq。

尽管该协议显示了从蛹 (在0小时/预蛹, 8 小时, 40 h APF) 和成人阶段的触角光盘和天线的解剖, 它可以适应其他蛹时间点。同样值得一提的是, 学习这些解剖需要时间.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X 磷酸盐缓冲盐水	Gibco	70011-044	在不含 RNase 的水中稀释至 1X
< > 罐	空气	CD R200
两个锋利的镊子 （Dumont #55）	精细科学工具	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA 分离溶液
解剖显微镜
装有冰的小
P20 和 P200 微量移液器和吸头
1.7 mL 微量离心管			购买不含核酸酶以获得最佳结果
0.2 mL PCR 管
多聚甲醛粉末	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	在 1X PBS 中稀释至 0.2% v/v
2" 培养皿
55 mm 滤纸	Whatman	1001-055	用水润湿并放入培养皿中以保持蛹湿润
25 C 培养箱
去离子 H2O			购买无核酸酶或用 DEPC
Sylgard 184 有机硅弹性体套件	Dow Corning		处理用于制作 Terizaki 板盖的解剖垫。
带盖 MicroWell 迷你托盘	Nunc	438733	盖子可用于制作硅胶解剖垫
兔抗 GFP 抗体	MBL 国际抗体	PM005	一抗
小鼠抗大鼠 CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	一抗
ADL195（抗核纤层蛋白，小鼠）	开发研究 水肿禁令	ADL195-s	一抗
Alexa Fluor 注册488 只山羊抗兔 IgG （H+L）	invitrogen	A11008	二抗
Cy3 山羊抗小鼠 IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	二抗
Triton X-100，蛋白质级去污剂，10% 溶液，无菌过滤	CALBIOCHEM	648463	去污剂
实验室旋转器	Thermo scientific		旋转器
无核酸酶水	Growcells.com	NUPW-0125	水性
轻型纸巾擦拭器	VWR	82003-822	用于清洁解剖用品
Superscript II	invitrogen	18064014	逆转录酶
QIAshredder （50）	RNA提取	QIAGEN	79654
Oligo（dT）12-18 引物	生命科学	技术	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit （50）	RNA提取	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER （5 ML）（500 RXN）	qPCR	罗氏	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&NBSP;	qPCR	罗氏	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - 多孔板 96	qPCR 罗	氏	04729692001
NEBNext 高保真 2X PCR 预混液	qPCR	NEB	M0541S