为分子与免疫组织化学分析制备发育中的外周嗅觉组织 果蝇

摘要

在此，我们介绍一种用于对发育中的嗅觉组织进行分期和解剖的实验方案 果蝇 物种。解剖所得组织后续可用于分子分析，例如定量逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）或RNA测序（RNAseq），以及 体内 免疫组织化学等分析 原位 杂交。

摘要

嗅觉系统 果蝇 在发育神经生物学、系统神经科学以及神经生理学、行为学和行为进化研究中被广泛使用。 果蝇 嗅觉组织包含能够检测挥发性化学信号的嗅觉感受神经元（ORNs），以及水感受和温度感受神经元。本方案中，我们描述了成体发育中外周嗅觉组织的解剖方法 黑腹果蝇 物种。我们首先描述如何进行分期和确定年龄 果蝇 幼虫，随后解剖早期蛹阶段的触角盘，再解剖中期蛹阶段及成虫的触角。我们还展示了如何将样本用于分子生物学技术，例如用于qRT-PCR、RNAseq或免疫组织化学的RNA提取。这些方法也可应用于其他 果蝇 在确定各物种特定的蛹期发育时间后，计算相应阶段以进行准确的年龄判定。

引言

嗅觉系统 果蝇 在发育神经生物学、系统神经科学、神经生理学、行为研究以及行为进化领域中被广泛应用^1,2,3,4. 果蝇 嗅觉组织中含有嗅觉感受神经元（ORNs），可检测挥发性化学信号，此外还含有水感受和温度感受神经元^1,5,6本文的总体目标是展示如何对发育中的蛹期和成体嗅觉组织进行分期和解剖 果蝇 物种。该技术的原理是获取不同蛹期的样本，用于外周嗅觉系统的分子与发育分析，例如RNA测序和定量RT-PCR，此外还包括 体内 组织标记技术。该技术在研究成年嗅觉系统发育过程中转录谱动态变化方面尤为有用，尤其适用于非黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 物种，这些物种并不具备用于细胞类型特异性标记和分析的全部转基因试剂。在本文中，我们演示了如何从蛹期和成虫期样本中解剖分离出触角盘和触角 果蝇 物种。首先，我们展示如何识别 果蝇 0 小时蛹壳形成（APF，白色....

方案

以下方案符合杜克大学研究伦理委员会制定的伦理指南。

1. 组织制备与发育阶段的确定 黑腹果蝇 蛹

1. 首先确定解剖所需的果蝇数量。进行 RT-PCR 和 RNA 测序时，需收集蛹前期、8 小时蛹后（APF）、40 小时 APF 及成虫阶段个体的 100 至 200 个触角盘和触角。进行免疫组织化学实验时，解剖 10 至 20 只个体即可。
2. 使用含 70% 乙醇的擦拭纸清洁所有材料，包括解剖垫和镊子。若解剖材料将用于 RNA 提取，则所有物品均需用 RNase 中和剂清洁，并使用无核酸酶水或焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水配制所有溶液。
   注意：本方案使用硅胶解剖垫而非玻璃解剖垫。硅胶垫对超细镊子更友好，有助于实现快速且高质量的解剖。
3. 收集 0 小时 APF/蛹前期阶段的蛹。
   1. 为确保最精确的发育阶段判定，以 30 分钟至 1 小时间隔监测幼虫。
      注意：在适度拥挤的培养瓶中，游走期三龄幼虫可能在数小时内化蛹。
   2. 一旦幼虫停止活动并被极浅色（近乎白色）的蛹壳包裹，立即将其转移至含湿润滤纸的小型 2 英寸培养皿中。
   3. 继续操作 1 至 2 小时，期间定期观察、识别并转移蛹前期个体。
      注意：也可将培养瓶中所有蛹清除，让幼虫继续发育 2 小时。此后收集的所有蛹其发育时间均处于 0 至 2 小时 APF 范围....

结果

分离的发育中嗅觉组织可用于RNA提取，随后进行RT-PCR以检测基因表达，也可用于免疫组织化学实验，以确定目标基因的表达模式及其亚细胞定位。本节展示了上述任一实验方案的代表性结果。图1为野生型成虫触角中细胞表面受体和嗅觉受体基因转录的代表性定量RT-PCR结果。图2显示了使用抗GFP抗体（1:1000）和抗lamin抗体（1:100）对Rn-EGFP转基因果蝇在6–8小时和12小时蛹期（APF）触角盘进行染色的结果（图2A和2B）。Rn-EGFP在蛹早期阶段标记触角盘内的特定区域。我们还展示了Or67d-GAL4 UAS-CD8GFP转基因果蝇在40小时APF蛹期触角的抗GFP抗体染色，以及成虫触角中嗅觉神经元（ORNs）的抗elav抗体（1:100）染色结果（图2

讨论

该方案为致力于鉴定发育过程中发挥作用的遗传与转录程序的实验室提供了有价值的参考资源 果蝇 嗅觉组织，以及这些项目在不同情况下的比较分析 黑腹果蝇 物种。如果需要不同发育阶段的系统级转录谱作为后续研究的前期基础，该方法尤为有用。本文所述方案展示了如何对发育中的嗅觉组织进行分期并分离获取 黑腹果蝇 获取从嗅觉系统发育的四个关键阶段（从预先构图到终末分化）的样本，用于分子和免疫组织学研究解剖的果蝇 不同蛹期的触角盘和触角可用于通过RNA-seq在系统水平上鉴定嗅觉系统发育过程中的基因表达谱，或通过定量RT-PCR在单个基因水平上进行鉴定。样品还可用于免疫组织化学分析。 原位 杂交以鉴定 体内 组织特异性基因表达模式。该方案的另一个优势在于，所分离的样品可进一步采用标准方法进行解离，并通过流式细胞分选（FAC）获得纯化的细胞群体（或单细胞），用于细胞类型特异性的分子分析，如定量RT-PCR或RNA测序。

尽管本方案展示了从蛹期（0小时/预蛹、8小时和40小时蛹后）及成虫阶段解剖触角盘.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X 磷酸盐缓冲液	Gibco	70011-044	用无RNase水稀释至1X
CO2 气罐	Air Gas	CD R200
两把尖头镊子（Dumont #55）	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA提取溶液
解剖显微镜
装有冰的小桶
P20和P200微量移液器及吸头
1.7 mL 微量离心管			为获得最佳效果，请购买无核酸酶产品
0.2 mL PCR管
多聚甲醛粉末	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	用1X PBS稀释至0.2% v/v
2" 培养皿
55 mm 滤纸	Whatman	1001-055	用水润湿后放入培养皿中以保持蛹体湿润
25°C 培养箱
去离子H2O			请购买无核酸酶水或使用DEPC处理
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	Dow Corning		用于从Terizaki板盖制作解剖垫
带盖MicroWell迷你托盘	Nunc	438733	盖子可用于制作硅胶解剖垫
兔抗GFP抗体	MBL international corpor	PM005	一抗
小鼠抗大鼠CD2抗体	AbD seroTec	MCA154RHDL	一抗
ADL195（抗lamin，小鼠）	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	一抗
Alexa Fluor® 488 山羊抗兔IgG（H+L）	invitrogen	A11008	二抗
Cy3 山羊抗小鼠IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	二抗
Triton X-100，蛋白级去污剂，10%溶液，无菌过滤	CALBIOCHEM	648463	去污剂
实验室旋转仪	Thermo scientific		旋转仪
无核酸酶水	Growcells.com	NUPW-0125	水
轻型组织擦拭纸	VWR	82003-822	用于清洁解剖器械
Superscript II	invitrogen	18064014	逆转录酶
QIAshredder（50）	RNA提取	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 引物	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute纯化试剂盒（50）	RNA提取	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER（5 mL）（500次反应）	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - 96孔多孔板	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext高保真2X PCR预混液	qPCR	NEB	M0541S