在此，我们介绍一种用于对发育中的嗅觉组织进行分期和解剖的实验方案 果蝇 物种。解剖所得组织后续可用于分子分析，例如定量逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）或RNA测序（RNAseq），以及 体内 免疫组织化学等分析 原位 杂交。
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本文内容
摘要
摘要
嗅觉系统 果蝇 在发育神经生物学、系统神经科学以及神经生理学、行为学和行为进化研究中被广泛使用。 果蝇 嗅觉组织包含能够检测挥发性化学信号的嗅觉感受神经元（ORNs），以及水感受和温度感受神经元。本方案中，我们描述了成体发育中外周嗅觉组织的解剖方法 黑腹果蝇 物种。我们首先描述如何进行分期和确定年龄 果蝇 幼虫，随后解剖早期蛹阶段的触角盘，再解剖中期蛹阶段及成虫的触角。我们还展示了如何将样本用于分子生物学技术，例如用于qRT-PCR、RNAseq或免疫组织化学的RNA提取。这些方法也可应用于其他 果蝇 在确定各物种特定的蛹期发育时间后，计算相应阶段以进行准确的年龄判定。
引言
嗅觉系统 果蝇 在发育神经生物学、系统神经科学、神经生理学、行为研究以及行为进化领域中被广泛应用1,2,3,4. 果蝇 嗅觉组织中含有嗅觉感受神经元（ORNs），可检测挥发性化学信号，此外还含有水感受和温度感受神经元1,5,6本文的总体目标是展示如何对发育中的蛹期和成体嗅觉组织进行分期和解剖 果蝇 物种。该技术的原理是获取不同蛹期的样本，用于外周嗅觉系统的分子与发育分析，例如RNA测序和定量RT-PCR，此外还包括 体内 组织标记技术。该技术在研究成年嗅觉系统发育过程中转录谱动态变化方面尤为有用，尤其适用于非黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 物种，这些物种并不具备用于细胞类型特异性标记和分析的全部转基因试剂。在本文中，我们演示了如何从蛹期和成虫期样本中解剖分离出触角盘和触角 果蝇 物种。首先，我们展示如何识别 果蝇 0 小时蛹壳形成（APF，白色蛹或前蛹）用于发育阶段确定及物种特异性年龄判定。接下来，我们展示如何解剖触角原基及第三触角节；具体而言，如何将其与眼原基及第二触角节分离，以获得RNA测序或RT-PCR所需的组织纯度。各步骤在 D. melanogaster 本方案中所描述的时间点大致对应于成虫盘前体（蛹前期）、自成虫盘中选择前体细胞（羽化后8小时）、嗅觉神经元终末分化起始（羽化后40小时）以及成虫触角。最后，我们提供了利用该方法分离的成虫触角进行定量RT-PCR的示例，以及 体内 免疫组织化学。该方法可用于制备RNA/DNA分析以及对不同发育阶段的外周嗅觉组织进行免疫组织化学分析的样本 果蝇 物种
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方案
以下方案符合杜克大学研究伦理委员会制定的伦理指南。
1. 组织制备与发育阶段的确定 黑腹果蝇 蛹
- 首先确定解剖所需的果蝇数量。进行 RT-PCR 和 RNA 测序时，需收集蛹前期、8 小时蛹后（APF）、40 小时 APF 及成虫阶段个体的 100 至 200 个触角盘和触角。进行免疫组织化学实验时，解剖 10 至 20 只个体即可。
- 使用含 70% 乙醇的擦拭纸清洁所有材料，包括解剖垫和镊子。若解剖材料将用于 RNA 提取，则所有物品均需用 RNase 中和剂清洁，并使用无核酸酶水或焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水配制所有溶液。
注意：本方案使用硅胶解剖垫而非玻璃解剖垫。硅胶垫对超细镊子更友好，有助于实现快速且高质量的解剖。 - 收集 0 小时 APF/蛹前期阶段的蛹。
- 为确保最精确的发育阶段判定，以 30 分钟至 1 小时间隔监测幼虫。
注意：在适度拥挤的培养瓶中，游走期三龄幼虫可能在数小时内化蛹。 - 一旦幼虫停止活动并被极浅色（近乎白色）的蛹壳包裹，立即将其转移至含湿润滤纸的小型 2 英寸培养皿中。
- 继续操作 1 至 2 小时，期间定期观察、识别并转移蛹前期个体。
注意：也可将培养瓶中所有蛹清除，让幼虫继续发育 2 小时。此后收集的所有蛹其发育时间均处于 0 至 2 小时 APF 范围内。
- 为确保最精确的发育阶段判定，以 30 分钟至 1 小时间隔监测幼虫。
- 立即进入步骤 3.1，解剖 0 小时 APF 阶段的蛹前期触角盘。若需延长蛹前期个体的培养时间，可将其收集至培养皿中，盖上皿盖并在边缘包裹石蜡膜以防止干燥，随后将培养皿置于 25 °C 环境中。
注意：此时蛹可继续培养至羽化。 - 对于在 2 小时时间窗内收集的蛹，应将蛹前期个体的培养时间比目标时间少 2 小时，以确保蛹不会过度发育。
- 由于组织非常细小且脆弱，应使用超细镊子（Dumont 55）进行操作。
2. 其他蛹期组织制备与发育分期 果蝇 物种
- 为确定其他 Drosophila 物种蛹期发育的持续时间，将样品置于最适温度下，记录观察到前蛹的时间，将其转移至新的培养管中，并记录从前蛹到成虫的天数。
- 记录非 melanogaster 物种与 melanogaster 物种蛹期发育时间的比值。将该发育时间比值乘以用于 melanogaster 分期的小时数，即可得到非 melanogaster 物种的年龄对应小时数。
3. D. melanogaster 蛹期触角成虫盘的解剖
注意：所有衰老时间及解剖方案均针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行描述。对于其他所有物种，需根据物种特异的发育时间点对衰老方案进行相应调整，具体如上所述。
- 进行蛹期触角盘解剖时，使用解剖刀收集50–100只0–2小时或6–8小时龄的蛹，并将其放置在解剖垫上。
- 使用200 µL移液器将150 µL RNA提取液加入无RNase的1.5 mL离心管中，并将试管置于冰上。
- 在150–200 µL的1× PBS（磷酸盐缓冲盐水，无核酸酶）中解剖蛹。在解剖垫上放置多个PBS液滴（每滴150–200 µL）。
- 在解剖垫上，将0–2小时或6–8小时龄的蛹（每滴一蛹）放入其中一个1× PBS液滴中进行解剖。用一只手使用镊子固定蛹体。
- 对于0–2小时龄的蛹，用另一只手的镊子夹住前部最前端（口钩部位），将其拉出，以暴露与前部蛹壳相连的大脑及成虫盘组织。
- 对于8小时蛹后（APF）的蛹，首先轻轻剥离蛹体最前端约四分之一处的蛹壳，暴露出包裹在体膜囊内的头部。
注意：此阶段的蛹体外观类似于正在退化的幼虫。 - 在颈部关节处切除头部。
注意：此操作可确保触角盘不会丢失，因为此时触角盘主要与大脑的视叶相连。 - 使用镊子或20 µL移液器将带有大脑和成虫盘的组织转移到另一个1× PBS液滴中。
- 识别与大脑视叶相连的眼-触角盘。使用镊子将眼-触角盘从大脑和蛹壳上分离。用镊子或20 µL移液器将其转移至新的1× PBS液滴中。
注意：前蛹期的眼-触角盘为扁平状组织。然而，至8小时龄蛹期时，眼盘已发生旋转并包裹住位于中央大脑前方的触角盘。 - 使用镊子在眼盘与触角盘的连接处剪开组织。用20 µL移液器轻柔地将解剖后的组织转移至RNA提取液试剂中。尽量减少液体转移量，移液时使用尽可能小的体积。
- 重复上述步骤，直至完成所有蛹的解剖。
4. 解剖 D. melanogaster 中期蛹及成体触角
注意：在羽化后40小时（APF），大部分变态过程已经完成，成体结构开始显现，但仍呈白色且无明显特征。在此发育阶段，成体触角已形成最终形态，但仍为透明状态，除少数外，大多数嗅觉受体尚未开始表达。
- 对于蛹期触角解剖，按照步骤1所述收集50–100只前蛹，并在25 °C下培养40小时。
- 使用200 µL移液器将150 µL RNA提取液移入无RNase的1.5 mL微量离心管中，并将试管置于冰上。
- 在解剖板上，将待解剖的蛹置于一滴1×PBS中。用一只手的镊子固定蛹体，另一只手用镊子轻轻剥离蛹体最前端四分之一处的蛹壳，露出位于包裹身体的膜囊内的头部。
- 使用镊子小心夹住蛹体，用另一把镊子在颈部关节处将头部与身体其余部分分离，剪下头部。用镊子轻轻将头部转移至另一滴1×PBS中。用移液器反复吹打，以清洗出头部内容物（脑组织）。 等等。) 以获得一层清晰的膜，该膜用于包裹发育中的结构 果蝇 头部
注意：在羽化后40–50小时，触角连接于膜的最前部区域。当通过移液清除头部内容物后，触角将变得明显，便于解剖。 - 使用镊子将蛹的触角从膜上分离。分离2nd 天线的第三段rd 使用镊子在节段关节处进行切割，仅保留第3节段rd 该节段将容纳嗅觉感受神经元。
- 使用20 µL移液器将解剖得到的组织轻柔转移至RNA提取试剂溶液中。尽量减少液体转移量，移取尽可能少的液体。重复此步骤，直至完成所有蛹的解剖。
- 成年果蝇触角解剖时，收集约50只成虫，并在羽化后饲养一周。
注意：嗅觉受体基因及其他基因的表达在羽化后一周达到高峰。成虫需饲养一周，以确保低丰度转录本的生物学相关基因表达水平上升至可检测阈值以上。 - 进行RNA提取时，将果蝇置于CO₂麻醉下，在其存活状态下解剖2 垫。处理CO2 加入RNase抑制剂。用于共聚焦成像时，将果蝇在1x PBS或含0.2% Triton的PBS中置于解剖垫上进行解剖。
- 首先，将成虫置于CO₂中使其麻醉2 解剖显微镜下的站台垫。在 CO2 使用一把镊子固定身体，另一把镊子从第二节轻轻拉出或夹出第三节触角。
- 用镊子将触角直接放入RNA提取液中，转移触角。重复此步骤，直至所有成虫均完成解剖。
注意：确保触角完全浸没在RNA提取溶液中。触角可能粘附在管壁上，这将导致RNA降解加剧，从而降低RNA的质量和产量。 - 直接进行RNA提取，或将离心管置于-80 °C下长期保存。
5. 从解剖组织中分离RNA
- 从 -80 °C 保存环境中取出所有样品，并在冰上解冻。
- 将每个样品短暂离心（5 - 6 秒，约 6,000 × g），使样品聚集于离心管底部。
- 使用已灭菌的塑料研磨棒和电动马达在冰上对每个样品研磨 10 秒。
- 重复步骤 5.2 和 5.3 共 4 次。
- 使用市售试剂盒并按照生产商的说明书进行 RNA 提取，以获得最佳得率。
- 使用市售试剂和针对目的基因的特异性引物，按照生产商的说明书进行 qRT-PCR 检测。
- 所有 PCR 反应均按以下条件进行：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，60 °C 延伸 30 秒）。
注：DIP 和 dpr 基因的引物对列于 表 1，嗅觉受体基因的引物见 Hueston CE et al.8。
- 所有 PCR 反应均按以下条件进行：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，60 °C 延伸 30 秒）。
6. 蛹期触角盘和触角的固定用于免疫组织化学
注意：将组织按每批10至20个个体进行固定，以确保所有组织固定时间一致。在将样本转移至固定液之前，应尽量缩短其在PBT（含去污剂的PBS）中的停留时间，以最大程度保持组织完整性。
- 将解剖得到的触角盘或蛹期触角收集到含有 200 µL 0.2% PBT 的 200-µL PCR 管中，置于冰上以维持组织完整性，并防止样品粘附在 200-µL PCR 管管壁上，否则会导致固定不完全。
注意：蛹期触角和触角盘因较为透明而难以观察。建议在所有洗涤步骤中使用解剖显微镜，以避免组织丢失。或者，也可使用 96 孔 Terasaki 板进行固定和染色，以便更好地追踪组织位置。 - 将解剖得到的触角盘及蛹期触角样品在约 200 µL 的 4% PFA（多聚甲醛）中于室温固定 30 分钟。在此步骤及后续步骤中，将装有样品的管子置于摇床上，以确保样品在溶液中充分混匀。随后进入步骤 6.7。
- 对于成体触角，首先解剖整个头部，并将其在约 200 µL 的 4% PFA（多聚甲醛）中于室温固定 1 小时。
- 用 200 µL 的 0.2% PBT 洗涤 3 次，每次 10 分钟。孵育期间保持样品在摇床上。
- 回到解剖显微镜下，对固定后的头部进行精细解剖，分离出第二触角节。用镊子固定头部，轻柔地拉出或夹出第三触角节。
- 将解剖得到的第三触角节转移至约 200 µL 的 4% PFA（多聚甲醛）中，在室温下固定 30 分钟。
- 用 200 µL 的 0.2% PBT 洗涤 3 次，每次 10 分钟。孵育期间保持样品在摇床上。
- 将样品储存于 4 °C，或直接进行整体免疫组织化学染色。
注意：当使用不同抗体时，染色效率可能会有所变化。本方法适用于丰度较低的蛋白标签或较弱的抗体。但在某些情况下，可能需要对实验方案进行优化（包括固定剂的种类或用量，或固定时间）。
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结果
分离的发育中嗅觉组织可用于RNA提取，随后进行RT-PCR以检测基因表达，也可用于免疫组织化学实验，以确定目标基因的表达模式及其亚细胞定位。本节展示了上述任一实验方案的代表性结果。图1为野生型成虫触角中细胞表面受体和嗅觉受体基因转录的代表性定量RT-PCR结果。图2显示了使用抗GFP抗体（1:1000）和抗lamin抗体（1:100）对Rn-EGFP转基因果蝇在6–8小时和12小时蛹期（APF）触角盘进行染色的结果（图2A和2B）。Rn-EGFP在蛹早期阶段标记触角盘内的特定区域。我们还展示了Or67d-GAL4 UAS-CD8GFP转基因果蝇在40小时APF蛹期触角的抗GFP抗体染色，以及成虫触角中嗅觉神经元（ORNs）的抗elav抗体（1:100）染色结果（图2
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讨论
该方案为致力于鉴定发育过程中发挥作用的遗传与转录程序的实验室提供了有价值的参考资源 果蝇 嗅觉组织，以及这些项目在不同情况下的比较分析 黑腹果蝇 物种。如果需要不同发育阶段的系统级转录谱作为后续研究的前期基础，该方法尤为有用。本文所述方案展示了如何对发育中的嗅觉组织进行分期并分离获取 黑腹果蝇 获取从嗅觉系统发育的四个关键阶段（从预先构图到终末分化）的样本，用于分子和免疫组织学研究解剖的果蝇 不同蛹期的触角盘和触角可用于通过RNA-seq在系统水平上鉴定嗅觉系统发育过程中的基因表达谱，或通过定量RT-PCR在单个基因水平上进行鉴定。样品还可用于免疫组织化学分析。 原位 杂交以鉴定 体内 组织特异性基因表达模式。该方案的另一个优势在于，所分离的样品可进一步采用标准方法进行解离，并通过流式细胞分选（FAC）获得纯化的细胞群体（或单细胞），用于细胞类型特异性的分子分析，如定量RT-PCR或RNA测序。
尽管本方案展示了从蛹期（0小时/预蛹、8小时和40小时蛹后）及成虫阶段解剖触角盘...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国家科学基金会向 Pelin C. Volkan 提供的资助（项目编号：DEB-1457690）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10X 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 70011-044 | 用无RNase水稀释至1X |
| CO2 气罐 | Air Gas | CD R200 | |
| 两把尖头镊子（Dumont #55） | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA提取溶液 |
| 解剖显微镜 | |||
| 装有冰的小桶 | |||
| P20和P200微量移液器及吸头 | |||
| 1.7 mL 微量离心管 | 为获得最佳效果，请购买无核酸酶产品 | ||
| 0.2 mL PCR管 | |||
| 多聚甲醛粉末 | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | 用1X PBS稀释至0.2% v/v |
| 2" 培养皿 | |||
| 55 mm 滤纸 | Whatman | 1001-055 | 用水润湿后放入培养皿中以保持蛹体湿润 |
| 25°C 培养箱 | |||
| 去离子H2O | 请购买无核酸酶水或使用DEPC处理 | ||
| Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | 用于从Terizaki板盖制作解剖垫 | |
| 带盖MicroWell迷你托盘 | Nunc | 438733 | 盖子可用于制作硅胶解剖垫 |
| 兔抗GFP抗体 | MBL international corpor | PM005 | 一抗 |
| 小鼠抗大鼠CD2抗体 | AbD seroTec | MCA154RHDL | 一抗 |
| ADL195（抗lamin，小鼠） | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | 一抗 |
| Alexa Fluor® 488 山羊抗兔IgG（H+L） | invitrogen | A11008 | 二抗 |
| Cy3 山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | 二抗 |
| Triton X-100，蛋白级去污剂，10%溶液，无菌过滤 | CALBIOCHEM | 648463 | 去污剂 |
| 实验室旋转仪 | Thermo scientific | 旋转仪 | |
| 无核酸酶水 | Growcells.com | NUPW-0125 | 水 |
| 轻型组织擦拭纸 | VWR | 82003-822 | 用于清洁解剖器械 |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | 逆转录酶 |
| QIAshredder（50） | RNA提取 | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 引物 | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute纯化试剂盒（50） | RNA提取 | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER（5 mL）（500次反应） | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 - 96孔多孔板 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext高保真2X PCR预混液 | qPCR | NEB | M0541S |
参考文献
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重印与许可
