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方法文章

利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

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DOI：

10.3791/57719

⸱

2018年5月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

本文内容

摘要

基于荧光蛋白的方法在监测细菌向宿主细胞分泌效应蛋白时面临挑战，这主要是由于荧光蛋白与III型分泌系统之间存在不兼容性。本文采用一种优化的分裂型超折叠GFP系统，用于可视化细菌向宿主植物细胞中分泌的效应蛋白。

摘要

细菌是引发多种植物病害的最重要致病因子之一，其通过向寄主植物细胞分泌一系列效应蛋白，以破坏植物的免疫系统。在侵染过程中，胞质效应蛋白通过III型分泌系统（T3SS）被递送至寄主细胞质中。进入植物细胞后，这些效应蛋白会靶向特定的亚细胞区域，以调控宿主细胞的生理过程，从而促进病原菌的存活与增殖。尽管已有研究利用荧光蛋白来分析效应蛋白在宿主细胞内的亚细胞定位，以揭示其在致病性中的功能，但由于III型分泌系统与荧光蛋白之间存在兼容性问题，直接研究由细菌注入的效应蛋白的动态行为仍具挑战性。

本文介绍了我们近期优化的分裂型超折叠绿色荧光蛋白系统（sfGFP）方法OPT) 以可视化细菌T3SS在宿主细胞内递送效应蛋白的定位。sfGFP11（11th 通过III型分泌系统（T3SS）分泌的、带有sfGFP β-链标签的效应蛋白可与靶向特定细胞器的sfGFP1-10组装OPT (1-10th sfGFP 的 β-折叠结构，从而在该位点产生荧光发射。本方案提供了一种利用效应蛋白可视化重构 sfGFP 荧光信号的实验方法 Pseudomonas syringae 在特定细胞器中 拟南芥 和 Nicotiana benthamiana 植物

引言

植物是固着生物，在其生命周期中会遭遇多种侵入性病原体，包括细菌、真菌、病毒、昆虫和线虫。在植物病原体中，革兰氏阴性细菌病原体（如Pseudomonas spp. 和 Ralstonia spp.）可通过伤口或气孔、水孔等自然开口侵入寄主植物1。为了成功定殖寄主植物，细菌病原体进化出多种毒力因子2。当细菌侵入寄主植物时，会将一系列毒力蛋白——称为效应子——直接注入植物细胞内，以增强其致病性。这些效应子可抑制或调控植物的先天免疫系统，并操控寄主细胞的生理过程，从而促进细菌的存活3。

致病菌主要通过III型分泌系统（T3SS）将效应蛋白直接递送至宿主细胞内4。T3SS类似于一种分子注射器，其针状通道从跨越细菌内膜和外膜的支架蛋白结构一直连接至宿主细胞的注射位点5。这种由T3SS介导的效应蛋白（T3E）分泌机制在多种植物和人类革兰氏阴性病原细菌中高度保守。一个典型的植物病原菌例子是丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的P. syringae pv. Tomato DC3000 hrcC突变株，该突变株通常具有缺陷的T3SS，在植物体内的生长受到限制，这很可能是因为该突变株无法通过注射效应蛋白来完全抑制植物免疫系统6。效应蛋白一旦被转运至宿主细胞内，便会靶向多种对宿主细胞系统至关重要的宿主蛋白，包括植物防御反应、基因转录、细胞死亡、蛋白酶体、囊泡运输以及激素信号通路相关的蛋白7,8,9,10。因此，追踪效应蛋白在宿主细胞内的亚细胞定位是研究其在调控植物免疫过程中功能的一个重要方向。

大多数关于T3Es的定位研究已采用 农杆菌-通过介导在寄主植物中过表达大型荧光蛋白9然而，异源表达方法在将基因导入其他物种时，已被发现存在定位错误或偶尔无功能的情况11,12,13此外，多项研究表明，细菌效应子会经历修饰，以实现在宿主细胞内的正确定位14,15,16,17因此，瞬时表达的植物细胞质效应因子在功能或数量上可能与病原菌感染时通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）递送的效应因子不完全相同。18此外，将大型荧光标签与效应蛋白融合可能干扰效应蛋白的正常递送及可视化18,19因此，这些检测T3E功能的方法可能无法完全反映T3SS分泌效应蛋白的天然定位。

绿色荧光蛋白（GFP）由一个包含11条β链的β桶状结构组成，其内部包裹着一条含有发色团的中央链20. Waldo 等 报道了一种新型的分裂GFP系统，该系统包含一个小片段（GFP β链11；GFP11）和一个大的互补片段（GFP β链1-10；GFP1-10）21片段本身不产生荧光，但当两个片段彼此靠近并发生自缔合时则产生荧光。为了优化蛋白质折叠效率，采用了GFP的稳定折叠变体， 即，sfGFP 和 sfGFPOPT随后开发了用于分裂GFP系统的工具20,21,22最近，sfGFP1-10 的单氨基酸突变体变体OPTsfYFP1-10OPT 和 sfCFP1-10OPT- 分别与sfGFP11片段互补重组后可恢复功能，并分别显示黄色和青色荧光的蛋白被构建出来23此外，mCherry 的一种衍生物 sfCherry 也可像 sfGFP 一样，被分割成 sfCherry1-10 和 sfCherry11 两个片段。23.

该系统已改进用于在感染过程中标记并追踪效应蛋白在HeLa细胞中的动态，所用效应蛋白来自 沙门氏菌24. 然而，该系统此前并未针对植物宿主-细菌病原体体系进行优化。近期，我们基于改进的sfGFP1-10对分裂GFP系统进行了优化OPT 监测从细菌分泌的T3Es的亚细胞定位 P. syringae 进入植物细胞25为了促进T3Es在植物细胞不同亚细胞区室中的定位研究，构建了一套转基因 拟南芥 植株经改造以表达 sfGFP1-10OPT 在不同的亚细胞区室中25此外，携带多种细胞器靶向sfGFP1-10的质粒OPT 对于 农杆菌介导的瞬时过表达以及用于基于T3SS效应子递送的sfGFP11标签载体也已构建。各种转基因植株的种子 拟南芥 细胞系及用于表达目标T3效应蛋白（T3Es）的质粒可从文中提及的来源获得 材料表26,27.

在以下实验方案中，我们描述了一种利用分裂型sfGFP系统监测细菌向宿主细胞递送效应子动态过程的优化体系。通过携带重组sfGFP11质粒的转基因Pseudomonas感染表达sfGFP1-10OPT的植物，可使Pseudomonas将sfGFP11标记的效应子递送至宿主细胞内。随后，这些蛋白重新组装并转运至特定效应子靶向的亚细胞区室。实验中使用了Pseudomonas syringae pv. tomato CUCPB5500菌株，该菌株缺失了18个效应子，因其在A. thaliana和N. benthamiana中均表现出极低或无细胞死亡现象28。然而，本文所述的所有材料与步骤均可根据需要替换或修改，以适用于其他生物学问题的研究，或在特定实验室条件下对该分裂sfGFP系统进行优化。

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方案

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 植物材料的准备（4周）

  1. 本氏烟草（N. benthamiana）植株的准备
    1. 在每个花盆的土壤表面播种2粒本氏烟草（N. benthamiana）种子，用塑料罩盖住育苗盘，并将种子置于25 °C、60%湿度的培养室中，采用16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下进行萌发。
    2. 两周后，从每盆中挑选并移除较小的幼苗，继续在与步骤1.1.1相同的生长条件下培养植株。每隔两天向每个育苗盘中添加1 L水。
      注意：不同实验室的植物生长条件可能有所不同，因此请遵循常规浇水方案，以确保植株健康生长。
    3. 一周后，将植株转移至新的育苗盘中，并留出足够的空间以利于后续生长。按照步骤1.1.1所述条件继续培养，直至植株生长至4周龄，准备进行农杆菌浸润。
      注意：植物生长情况可能因实验室条件差异而有所不同。通常情况下，4周龄的本氏烟草（N. benthamiana）植株约具有六片叶子。
  2. 拟南芥（A. thaliana）转基因植株的准备
    1. 参考材料表订购转基因拟南芥（Arabidopsis）种子。
    2. 将约50 - 100粒转基因拟南芥（Arabidopsis）种子浸泡于1 mL蒸馏水中，置于4 °C黑暗环境中保存3天，以同步萌发起始时间。
    3. 在穴盘的土壤表面播种约2 - 3粒种子，并用塑料罩盖住育苗盘。将种子置于23 °C、60%湿度、10小时光照/14小时黑暗的光周期条件下进行萌发。
      注意：所用种子应为纯合子。然而，我们建议重新确认该批次种子中转基因的存在。在此情况下，需对种子进行灭菌处理：先用70%乙醇清洗2分钟，再用含0.05%吐温X-100的50%次氯酸钠溶液（约2%次氯酸盐）处理5分钟，随后用无菌双蒸水（ddH2O）清洗5 - 6次。灭菌后，在4 °C下层积3天，然后接种于含有25 µg/L潮霉素B的植物萌发培养基上，以筛选转基因植株。
    4. 一周后，每个穴孔仅保留一株植株，并继续在与步骤1.2.3相同的生长条件下培养。
      注意：4周龄植株用于丁香假单胞菌（P. syringae）侵染实验。每隔一天浇水一次，以维持植株健康状态。

2. 准备 假单胞菌 培养（约1周）

  1. 构建用于Pseudomonas转化的质粒
    1. 参考材料表，订购基于T3SS效应子递送系统的所需载体25。
    2. 使用位点特异性重组克隆技术将目标效应子基因插入效应子递送载体中25。
      注意：在监测全长效应子蛋白亚细胞定位时，应将全长基因插入pBK-GW-1-2或pBG-GW-1-2载体中。也可选择含有2x sfGFP11的pBK-GW-1-4或pBG-GW-1-4载体以增强荧光信号。若为缺乏信号肽的效应子片段，则使用pBK-GW-2-2或pBK-GW-2-4载体。有关效应子递送载体的详细信息，请参见Park et al.25。
  2. 通过标准电穿孔法将携带与sfGFP11标签融合的效应子的质粒转化至P. syringae pv. Tomato（Pst）CUCPB5500菌株中29。
    注意：如有需要，也可使用其他Pseudomonas菌株。sfGFP11标签系统适用于多种载体30，且效应子基因的表达由AvrRpm1启动子调控，该系统在Pseudomonas fluorescens（EthAn）等菌株中同样有效31。
  3. 将转化后的细菌细胞轻柔涂布于含有100 µg/mL利福平和25 µg/mL卡那霉素或25 µg/mL庆大霉素的King’s B琼脂平板表面，在28 °C下培养2天。
  4. 挑取单菌落接种至含有适用于所用载体的抗生素的King’s B液体培养基中，于28 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
  5. 制备甘油菌种。加入经高压灭菌的甘油至终浓度为50%，于-80 °C保存。

3. 在N. benthamiana中瞬时表达细胞器靶向的sfGFP1-10OPT（4天）

  1. 制备 农杆菌 培养
    1. 订购所需的细胞器靶向 sfGFP1-10 载体OPT 质粒（参见 材料表).
    2. 将质粒转化至 Agrobacterium tumefaciens GV3101 菌株细胞32在含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的LB（Luria-Bertani）琼脂培养基中，于28 °C培养2天。
    3. 从LB琼脂平板上的单个菌落中接种细胞至5 mL液体LB培养基中，培养基中添加50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平。在28 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
    4. 通过离心在 3,000 x g 条件下收集细胞，离心时间为 10 分钟。倒去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 新鲜配制的浸润缓冲液中。
    5. 测量数量 农杆菌 通过在600 nm波长处测定吸光度（OD值）（Abs 600 nm）来调整OD600 用浸润缓冲液将细菌浓度调整至0.5。
      注意：1 mL 悬液足以在两个位点进行浸润。
    6. 将培养物置于室温下，用温和摇床振荡1 - 5小时，然后进行浸润。
    7. 用10 µL枪头在待浸润的叶片中心刺一个小孔，然后使用1 mL无针头注射器进行浸润 农杆菌 悬浮液。将步骤3.1.5制备的悬浮液约500 µL，通过注射器小心缓慢地注入叶片近轴面。每组实验至少在三株不同的植株上重复 infiltration 操作。
      注意：出于健康和安全考虑，进行浸润操作时应佩戴眼部防护装备。
    8. 擦去叶片上残留的细菌悬浮液，并标记浸润区域的边界。
    9. 将接种后的植株置于与步骤1.1.1相同的生长条件下培养2天。

4. 接种 假单胞菌 （4 天）

  1. 将步骤2.5中含适当抗生素的甘油菌种中的转化后假单胞菌（Pseudomonas）菌株在King’s B琼脂培养基上划线，于28 °C培养2天。
    注意：Pseudomonas菌株的生长状态至关重要。若菌落生长不良，需重新划线，或在继续实验前将菌株在King’s液体培养基中扩增培养。
  2. 用接种环取一环Pseudomonas菌体，接种至甘露醇-谷氨酸（MG）液体培养基中，于28 °C、200 rpm振荡培养过夜。
  3. 以3,000 × g离心10分钟收集菌体，弃去上清液，将菌体沉淀重悬于10 mM MgCl2溶液中，并将OD600调整至0.02（1 × 107 cfu/mL）用于N. benthamiana叶片，或调整至0.002（1 × 106 cfu/mL）用于Arabidopsis叶片。
  4. 对于N. benthamiana，将Pseudomonas菌悬液浸润至此前2天已接种携带sfGFP1-10OPT质粒的农杆菌（Agrobacterium）的叶片区域（如步骤3.1.7所述）。对于表达sfGFP1-10OPT的转基因Arabidopsis植株，将Pseudomonas菌悬液浸润至两片4周龄、短日照条件下生长的叶片中。
    注意：实验需至少准备三株植物以满足生物学重复要求。

5. 通过共聚焦显微镜观察 sfGFP 信号（1 天）

  1. 从叶片上切下叶圆片 假单胞菌接种叶片。在渗透后的特定时间点 假单胞菌，图像两个2-cm2 使用激光扫描共聚焦系统，配备40倍/1.2 NA C-Apochromat水浸物镜或63倍/0.8 NA C-Apochromat油浸物镜，从单株植物获取叶片圆片。为避免因损伤导致的死亡细胞干扰，应观察远离浸润孔的细胞。
  2. 从488 nm氩激光器的低功率设置开始观察。逐步增加激光功率以检测sfGFP。
    注意：我们通常使用2 - 15%的激光强度来检测荧光信号。然而，激光功率和检测参数应根据用户所用显微镜系统进行调整。此处，发射滤光片设置为520 - 550 nm。死细胞在488 nm激光激发下常产生自发荧光。因此，作为阴性对照，应将未携带sfGFP11标签的相同效应子渗入植物，并在相同的观察条件下进行观察。此外，过高的激光激发会诱导叶绿素产生自发荧光。因此，应利用对照植物细胞调整激光强度，以避免背景干扰 以免诱导叶绿素自发荧光。
    1. 为对细胞壁进行复染，在观察前5–10分钟将20 mM碘化丙啶（PI）渗入叶片圆片中。
    2. 对于细胞核染色，将叶片圆片浸入0.1%多聚甲醛中5分钟，随后用水洗涤。然后在显微镜观察前5至10分钟，将10 mM PI渗透入叶片圆片中。重复实验至少三次。
      注意：此步骤并非关键步骤，但有助于确定效应分子在质膜或细胞核中的定位。如果所研究的效应分子在特定细胞器中显示其定位，则应使用相应细胞器的标记物来确认该效应分子的定位。

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结果

GFP 的 β-桶状结构由十一条 β 链组成，可被分为两个片段，即 1 - 10th 链（GFP1-10）OPT）以及第11th （GFP11）链。尽管这两个片段自身均不产生荧光，但当它们彼此靠近时，可自发组装形成sfGFP并发出荧光。图1A）。在此系统中，sfGFP1-10OPT-表达 拟南芥 或 N. benthamiana 植物接种 假单胞菌 携带 sfGFP11 标签效应蛋白。通过递送携带 sfGFP11 标签的效应蛋白 假单胞菌 到宿主细胞胞质中的 sfGFP1-10 被重建OPT 在细胞质中表达，随后共同转位至靶区室（图1B). 图2 代表了从植物材料的制备到整个实验流程的总体步骤 Pst

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讨论

本文所述方案用于监测细菌III型分泌系统（T3SS）在感染过程中将效应蛋白注入宿主植物细胞后其精确定位的情况。此前，分裂型GFP系统已被用作研究哺乳动物蛋白亚细胞定位的工具23,36，并用于研究沙门氏菌（Salmonella）T3效应蛋白的定位以及农杆菌（Agrobacterium）VirE2蛋白通过IV型分泌系统（T4SS）递送至植物细胞的过程37。为了在植物细胞中应用该系统，先前的研究使用了组成型表达细胞质GFP1-10的转基因玉米植株，以及表达GFP11标记效应蛋白的转基因真菌玉米黑粉菌（Ustilago maydis）。然而，玉米-U. maydis系统未能成功，原因是转运效应蛋白的表达水平较低，且较高的背景自荧光干扰了重组GFP信号的检测38。为解决这一问题，我们采用了sfGFP1-10的变体sfGFP1-10OPT，该变体...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过科学、信息通信技术与未来规划部资助的基础科学研究中心项目（NRF-2018R1A2A1A05019892）资助给 DC，以及由农村振兴厅下一代生物绿色21计划的植物分子育种中心（PMBC）资助项目（PJ013201）资助给 EP。 我们感谢国家环境管理仪器中心影像中心提供共聚焦显微镜用于拍摄。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>拟南芥转基因品系Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。植物细胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
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ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
<强>靶向细胞器的 sfGFP1-10OPT 质粒Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。植物细胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
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NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
<强>用于基于T3SS效应子递送系统的sfGFP11标记Gateway兼容载体Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。植物细胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；卡那霉素抗性（25 ug/ml）
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；卡那霉素抗性（25 ug/ml）
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；卡那霉素抗性（25 ug/ml）
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；卡那霉素抗性（25 ug/ml）
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 ug/ml）
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 ug/ml）
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 ug/ml）
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 ug/ml）
<强>细菌菌株
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz 和 Jeff Schell，《TL-DNA 基因5的启动子调控由一种新型农杆菌双元载体携带的嵌合基因的组织特异性表达》。Mol Gen Genet. 204, 383-396 (1986)；对庆大霉素（50 μg/ml）和利福平（50 μg/ml）具有抗性
Pseudomonas syringae pv. 番茄 CUCPB5500Kvitko, B. H. 等。铜绿假单胞菌番茄致病变种 DC3000 Ⅲ型分泌效应基因库中的缺失揭示了效应蛋白之间的功能重叠。PLoS Pathog. 5 (4) (2009)；对利福平耐药（100 ug/ml）
<强>培养基成分
<强>植物萌发培养基添加 2.165g/L Murashige & Skoog 粉末，向水中加入 10 g/L 蔗糖。调节 pH 至 5.8，并添加 2.2 g/L Phytagel。高压灭菌。
穆拉希吉 &含维生素的MS培养基Duchefa BiochemieM02224°C 保存 °C.
蔗糖Duchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
<强>LB培养基加入10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl至水中。如配制固体培养基，另加15 g/L微琼脂。高压灭菌。  让溶液冷却至55 °C，并根据需要添加抗生素。
胰蛋白胨BD生物科学211705
酵母提取物BD生物科学212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
微琼脂Duchefa BiochemieM1002
<强>King's B 培养基10 g/L 蛋白酶肽胨#2，1.5 g/L 无水 K2HPO4，向水中加入15 g/L琼脂。高压灭菌后冷却至55℃ °C，并加入无菌的15 ml/L甘油和5 ml/L MgSO₄4 向培养基中添加抗生素（如需要）。
蛋白胨BD生物科学212120
无水 K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
甘油Duchefa BiochemieG1345
MgSO₄4Sigma-AldrichM7506
Bacto 琼脂BD生物科学214010
<强>甘露醇-谷氨酸（MG）液体培养基 加入 10 g/L 甘露醇、2 g/L L-谷氨酸、0.5 g/L KH2PO4，0.2 g/L 的 NaCl 和 0.2 g/L 的 MgSO₄4 加水。调节pH至7
甘露醇Duchefa BiochemieM0803
L-谷氨酸Duchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
浸润缓冲液10 mM MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸），10 mM MgCl₂，150 µM 乙酰丁香酮。pH 5.6；使用前新鲜配制缓冲液。
MESDuchefa BiochemieM1503配制100 mM（pH 5.6）水溶液母液，过滤除菌。
MgCl2Sigma-AldrichM8266在水中配制100 mM储存液。高压灭菌。
乙酰丁香酮Sigma-AldrichD134406在DMSO中配制150 mM的储存液。
共聚焦显微镜设备/材料
710 激光扫描共聚焦系统卡尔·蔡司
Axio observer Z1 倒置显微镜卡尔·蔡司
碘化丙啶赛默飞世尔科技P1304MP

参考文献

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GFP III Pseudomonas syringae sfGFP11
利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白
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