一种用于评估轻度脊髓损伤小鼠模型中内源性神经干细胞激活的神经球形成实验

摘要

本文展示了在成年小鼠中建立的一种保留中央管微环境（该微环境容纳内源性神经干细胞（NSCs））的最小化脊髓损伤模型的操作方法。我们介绍了如何利用神经球形成实验来定量分析损伤后确定性神经干细胞和原始神经干细胞的激活与迁移情况。

摘要

成年哺乳动物脊髓中的神经干细胞（NSCs）是一类相对处于有丝分裂静息状态的室管膜周围细胞，可对其进行研究 体外 使用神经球实验。该集落形成实验是研究神经干细胞（NSCs）在体外对外源性因素反应的有力工具；然而，它也可用于研究外源性因素对 体内 在充分理解该检测方法的优势与局限性的基础上进行操作。一个具有临床意义的操作是研究损伤对内源性神经干细胞（NSC）激活的影响。目前的脊髓损伤模型在研究这一问题时存在挑战，因为常见的挫伤、压迫和横断模型造成的损伤程度较重，会导致位于损伤部位的NSC生态位被破坏，而该区域正是干细胞所处的位置。本文介绍一种微小损伤模型，可在成年小鼠胸段下部（T7/8）脊髓的背外侧浅表区域造成局部损伤。该损伤模型保留了损伤节段的中央管结构，从而允许在损伤后的不同时间点对位于损伤节段的NSCs进行分析。本文展示了如何利用神经球形成实验（neurosphere assay）来研究脊髓脑室周围区域中两种不同的、谱系相关的NSC群体——原始神经干细胞（pNSCs）和定型神经干细胞（dNSCs）——的激活情况。我们阐述了如何从损伤节段的脑室周围区域以及白质损伤部位分离并培养这些NSCs。术后脊髓解剖结果显示，与对照组相比，损伤组脑室周围区域中pNSC和dNSC来源的神经球数量增加，表明这些细胞因损伤而被激活。此外，损伤后可在损伤部位分离出dNSC来源的神经球，证明NSCs能够从其脑室周围生态位迁移至损伤部位。

引言

中枢神经系统包含一群能够自我更新的多能干细胞，这类细胞具有分化为所有不同类型成熟神经细胞的潜能^1,2,3,4这些神经干细胞（NSCs）存在于脑和脊髓中的特化微环境中，并可在损伤后被激活 损伤后增殖、迁移并分化为成熟的神经细胞。在皮质损伤模型中，已证实神经干细胞（NSCs）及其子代细胞能够迁移至损伤部位。^5,6在脑内，神经干细胞（NSCs）已被证实可从侧脑室迁移至损伤部位，并分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成⁷然而，在脊髓中，关于这些内源性神经干细胞是否能够被利用以促进脊髓损伤后的恢复，相关研究仍十分有限。事实上，目前尚存争议：脊髓中干细胞池的激活是否需要对中央管周围室管膜下区这一微环境造成直接的物理性损伤。⁸ 或者脊髓实质受损（干细胞微环境保持完整）的程度是否足以激活内源性神经干细胞⁹.

已采用多种脊髓损伤（SCI）模型来研究急性和慢性损伤的病理生理学机制。这些模型还被用于通过神经保护、免疫调节以及开发细胞移植/替代策略来测试潜在的SCI治疗方法^10,11,13。目前常用的模型包括压迫性和/或挫伤性损伤，可导致大范围的功能障碍以及脊髓内广泛的病灶和空洞形成^14,15。继发性胶质瘢痕可跨越多个脊髓节段，并涉及脊髓横断面的大部分宽度/周长¹⁶。因此，尽管这些模型具有临床相关性，但在研究损伤后内源性神经干细胞（NSCs）反应方面带来了显著挑战。此外，存在一些可调节的化学性损伤模型，能够诱导较轻程度的损伤，从而保留中央管结构¹⁷。然而，这类损伤模型主要关注与SCI相关的脱髓鞘过程，对于创伤性SCI所伴随的物理性和/或机械性损伤而言，并不具备临床代表性。

为解决现有损伤模型的局限性，我们改进了一种针道最小化脊髓损伤（SCI）模型，该模型最初是在大鼠中建立的⁹，用于成年小鼠模型的应用。我们改进的损伤模型可在小鼠脊髓背外侧区域产生一致的病灶，同时在损伤节段保留中央管。该模型的优势在于能够研究损伤后神经干细胞（NSCs）的动力学行为及其向损伤部位径向迁移的潜力。使用小鼠模型还可利用转基因小鼠，实现对损伤后内源性NSCs及其子代细胞的谱系示踪。NSCs的特性还可通过改良形式的 体外 本方案中介绍的神经球实验。

神经球实验是一种 体外 在有丝分裂原存在的条件下，可通过集落形成实验分离神经干细胞（NSCs）。在克隆密度接种时，单个神经干细胞增殖形成悬浮的球形细胞集落，该集落由少量神经干细胞亚群和大量前体细胞组成。^18,19在本实验方案中，我们展示了在基础条件下以及轻度脊髓损伤模型后，从脊髓室管膜下区分离出两种不同但具有谱系关联的神经干细胞（NSCs）。确定性神经干细胞（dNSCs）表达巢蛋白（nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP），并在表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和肝素（三者合称EFH）存在的条件下进行培养。²⁰这些dNSCs在未受刺激的脊髓中极为稀少，仅能形成极少数神经球。 体外然而，我们发现，在轻微脊髓损伤后，室管膜下区分离出的神经球数量增加，表明dNSCs被激活²¹原始神经干细胞（pNSCs）位于神经干细胞谱系中dNSCs的上游。pNSCs极为稀有，低水平表达多能性标志物Oct4，并对白血病抑制因子（LiF）具有响应性²²成年小鼠脊髓来源的pNSCs由于原代培养物中存在髓鞘碱蛋白（MBP），无法形成神经球；然而，可在MBP缺陷型小鼠中分离得到pNSC神经球，且其数量在损伤后增加，与dNSCs类似²¹最后，我们证明了在轻微脊髓损伤（SCI）后的早期阶段，可以从损伤部位分离出源自dNSC的神经球。这些结果表明，我们的损伤模型和检测方法能够评估脑室周围神经干细胞（NSCs）的激活特性，例如其在损伤刺激下的增殖和迁移能力。

方案

本方案已获多伦多大学动物护理委员会批准，并符合 "实验动物护理与使用指南" (2^nd 版本，加拿大动物护理委员会，2017。

1. 脊髓损伤的微创手术

注意：手术前，请确保所有手术器械和材料均已通过适当方法灭菌（图1A）。

1. 通过卷起4至5块纱布方块，并用胶带在中间将它们固定在一起，制成一个固定的纱布卷，作为胸部支撑弓。
2. 将小鼠放入诱导室，使用5%异氟烷开始麻醉。在开始操作前及整个手术过程中，需确认小鼠无足趾夹捏反射。由于手术可能需要30分钟以上才能完成，应优化异氟烷暴露剂量（先以5%浓度麻醉5分钟，其余时间调整为2–3%）。
3. 将小鼠转移至连接麻醉机的鼻罩，以2–3%异氟烷维持剂量进行麻醉。使用毛发剪从动物背部中段向上至颈部/耳部区域去除背侧毛发，以暴露用于手术的较大矩形皮肤区域。
4. 将小鼠转移至立体定位仪，将其鼻子放入附带的鼻锥中，并用耳杆固定颅骨。安装耳杆时维持异氟烷浓度为5%，待小鼠在立体定位仪中固定后，将其浓度降至2–3%。
5. 术前经腹腔注射镇痛药物——美洛昔康（2.0 mg/kg）。在麻醉期间，于小鼠睁开的眼部充分涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。
6. 将胸椎支撑弓置于小鼠腹部下方，同时轻轻牵拉尾根部以伸直小鼠身体和脊柱。使用实验室标签胶带将尾部及所有伸展的四肢固定成星形位置。固定稳妥后，将胸椎支撑弓从腹部向头侧方向推进至胸部上段，以支撑起胸椎。图1B).
7. 用70%乙醇对步骤1.3中已剪毛的皮肤区域进行消毒，随后使用聚维酮碘，重复两次，以制备无菌手术区域。覆盖无菌手术巾，以维持较大的无菌区域。
8. 使用#10手术刀片，从动物双侧肩胛骨中点至胸椎弯曲处，沿其纵轴平行方向做一垂直切口。牵拉皮肤以暴露软组织及脊柱轮廓。图1C).
9. 确定肩胛上脂肪垫的下界（此边界标志第4/5胸椎水平）。使用同一把#10刀片，沿第5至第8/9胸椎骨两侧用力而谨慎地切开，以分离背部肌肉腱与脊柱的连接。
10. 将拉钩的齿插入脊柱两侧的切口位置。通过扩张拉钩来调节暴露范围，充分抬高脊柱，同时避免对被牵开的肌肉层施加过大张力。图1D).
11. 在手术显微镜下，仔细清除覆盖脊柱的残留肌肉及其他软组织，以暴露椎骨图1E). 用有齿镊夹住椎骨的棘突并轻微上下移动，以确定将要切除的椎骨。
    注意：这应能识别椎间关节，并暴露目标椎骨下方的小孔（椎间孔）。
12. 将弯头钝头剪刀的一端插入暴露的椎间孔一侧，位于将被切除的椎板下方，沿椎体尾侧方向，双侧剪断相连的椎间关节。
13. 抬起椎板并切断其上部附着处，以分离并移除骨骼。
    注意：这将暴露出包含脊髓的完整硬脊膜囊图1F可能会出现大量出血，可通过将预先裁剪好的1 cm × 1 cm纱布放置于出血部位和/或用无菌PBS冲洗来控制。
14. 以背侧中线静脉为解剖标志，将30 G针头（针尖斜面朝上）的45°弯曲针杆插入脊髓背外侧表面（深度约1 mm），进针位置位于中线两侧约0.5 mm处。
15. 将针头从尾侧向头侧移动约 2 mm（与中线平行），使针尖斜面的整个长度都插入脊髓内。沿进针路径原路退出针头图1G).
    注意：此步骤中不应有出血，但可能会观察到脊髓组织肿胀。
16. 用6-0可吸收缝线在中线处将损伤两侧的背部肌肉缝合，以关闭伤口。随后使用4-0无菌丝线缝合覆盖的皮肤。
17. 使用棉签末端将抗生素软膏涂抹于浅层缝合皮肤表面，以预防术后感染。皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡作为术后镇痛，并给予液体支持（1 mL乳酸林格氏液）。
18. 关闭异氟烷挥发罐和氧气，将小鼠从立体定位仪中取出，放入无垫料的清洁笼具中。
19. 将小鼠放置在距离热灯约30 cm的笼子中，以恢复麻醉，并在苏醒后监测其行为。小鼠应在5–10分钟内苏醒，苏醒后应具备后肢功能，但可能出现轻瘫和/或尾部无力。
20. 在接下来的几天内监测小鼠行为，并提供适当的术后护理和镇痛剂（即，泥状食物，皮下注射乳酸林格氏液，皮下注射布托啡诺 0.1 mg/kg，每日两次，持续 2–3 天，并根据动物设施的本地规定及个体情况实施适当的体重监测，因为恢复情况可能因个体而异。

2. 神经球实验解剖

注意：整个过程中需遵循正确的无菌组织培养操作规程。

1. 酶解液的配制
   1. 将 32 mL 的 Earle's 平衡盐溶液（EBSS）加入含有白蛋白卵黏蛋白抑制剂的玻璃瓶中，轻轻涡旋至完全溶解。
   2. 向已分装好的木瓜蛋白酶玻璃小瓶中加入 5 mL EBSS，并置于 37 °C 水浴中溶解。溶液将变为澄清（溶液 1）。
   3. 取 500 µL EBSS 加入已分装的 DNase I 玻璃小瓶中，配制成浓度为 1 mg/mL 的溶液（溶液 2）。通过来回倾斜小瓶的方式轻轻混匀，然后取 250 µL 该混合液加入溶液 1 中。
      注意：所配制的所有溶液（溶液 1 和溶液 2）足以处理两份组织样本。若需处理更多组织，请相应增加溶液配制量。
2. 组织准备与解剖
   1. 将浸有异氟烷的实验纸巾放入小鼠笼内，静置 2–3 分钟，使蒸气充分麻醉小鼠。确认小鼠失去意识后，将其从笼中取出，并验证趾夹反射消失。
   2. 使用钝头金属物体（例如，金属笼片）进行颈椎脱位，以实施安乐死。用 70% 乙醇从颈部至背部中段充分喷洒已安乐死的小鼠。
   3. 在颅底处用剪刀剪下头部并丢弃至生物危害袋中。沿背部全长做正中切口，切开皮肤以暴露肌肉和椎骨轮廓（图 2A）。
   4. 提起每侧肩胛骨的内侧部分（即，肩胛骨——可通过其上方的脂肪垫识别），用剪刀剪除肩胛骨与椎骨之间的软组织。彻底分离以暴露下方的脊柱。
   5. 沿脊柱的自然曲度，将同一把剪刀插入上胸段开口处，剪除附着的肋骨、肌肉和内脏器官，以分离出脊柱（图 2B）。
   6. 将剪刀插入尾侧椎骨的椎间孔/开口，剪断椎板两侧的椎间关节（背侧表面）。操作时需特别注意，避免损伤完整的脊髓。
   7. 在将脊髓组织转移至含常规人工脑脊液的培养皿前，小心剪断从脊髓向外延伸的脊神经。将样本置于冰上保存（图 2C）。
   8. 在解剖显微镜下，将脊髓组织切成包含损伤部位前后各约 2 mm 的节段。使用两对镊子，沿背侧和腹侧裂隙纵向轻轻将脊髓分为两半（图 2C'）。
   9. 使用显微剪刀切除损伤的背外侧白质，并将组织块放入一个 15 mL 圆锥形离心管中。
   10. 用一对镊子固定半侧脊髓，用另一对精细镊子沿脊髓头尾方向剥离并去除白质，以分离所需的室管膜周围区域。对另一半脊髓重复此操作。
   11. 将室管膜周围组织块放入另一个 15 mL 圆锥形离心管中。使用显微剪刀在离心管壁上轻轻剪碎组织。
       注意：组织解离步骤的修改参考自木瓜蛋白酶解离系统操作指南²³ 及先前描述的组织制备流程²⁴。
   12. 向组织样本中加入 2.5 mL 新配制的溶液 1（步骤 2.1.3），置于 37 °C 摇床上孵育 30 分钟。
   13. 用 1,000 µL 移液枪头在溶液中轻柔吹打组织。将浑浊的细胞悬液在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
   14. 配制溶液 3：取 2.7 mL Earle's 平衡盐溶液、300 µL 卵黏蛋白抑制剂溶液（步骤 2.1.1）和 150 µL DNase I 溶液（步骤 2.1.3）混合。
   15. 弃去步骤（2.2.13）中的上清液，将沉淀重悬于前一步骤（2.2.14）配制的 1.5 mL 溶液 3 中。
   16. 将此新的细胞悬液（步骤 2.2.15）小心铺加到新 15 mL 圆锥形离心管中 5 mL 卵黏蛋白抑制剂溶液（步骤 2.1.1）的上层，形成不连续密度梯度。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
   17. 弃去上清液，将沉淀重悬于 2 mL 神经基础培养基中。在室温下以 300 x g 离心 3 分钟。
   18. 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 神经基础培养基中。用 20 µm 细胞滤网过滤悬液，随后加入 4 mL 培养基，最终体积为 5 mL。
3. 接种
   1. 通过向神经基础培养基中添加表皮生长因子（20 ng/mL）、成纤维细胞生长因子（20 ng/mL）和肝素（2 µg/mL）[用于确定性神经干细胞] 或白血病抑制因子（10 ng/mL）[用于原始神经干细胞]，配制适用于神经球生长的培养基。将 10 mL 上述任一种培养基加入 25 mL 组织培养瓶中。
   2. 使用血细胞计数板和台盼蓝染料计算步骤（2.2.18）中细胞悬液的细胞数量²⁵。计算完成后，将细胞以克隆密度（10 个细胞/µL）接种至步骤（2.3.1）准备的组织培养瓶中，并将培养瓶放入培养箱中孵育 24 小时（37 °C，95% 湿度，5% CO₂）。
      注意：细胞计数方法示例如下：取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝染料混合。取 10 µL 混合液加入血细胞计数板。在 10X 光学显微镜下计数活细胞数量，统计 4 个 4×4 方格中的细胞总数。使用公式：100,000/[(X 个细胞/4) × 2 × 10 × 1,000]，计算每 25 mL 组织培养瓶中应接种的细胞悬液体积，以确保达到克隆密度（10 个细胞/µL）。
   3. 24 小时后，轻轻摇动培养瓶，将内容物倒入 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
   4. 弃去上清液，将细胞重悬于 1–2 mL 新鲜神经基础培养基中。
   5. 重复步骤 2.3.2，计算细胞悬液中的细胞数量，并以克隆密度将细胞接种至 24 孔组织培养板中，每孔含 500 µL 相应的促有丝分裂因子补充培养基（EFH 用于确定性 NSC 生长，LIF 用于原始 NSC 生长）。
      注意：使用修正公式（5,000/[(X 个细胞/4) × 2 × 10 × 1,000]）计算每孔（含 500 µL 培养基）应接种的细胞悬液体积。
   6. 将含细胞的培养板放入培养箱（37 °C，95% 湿度，5% CO₂）中培养 7 天。
4. 计数
   1. 培养 7 天后，取出培养板并在光学显微镜下观察。通过计数直径 >80 µm 的球形克隆来定量 dNSC 培养中的神经球，或计数直径 >50 µm 的球形克隆来定量 pNSC 培养中的神经球。
      注意：如需要，神经球可进一步传代²⁶ 或诱导分化。若不再需要细胞，可向孔中加入加速型过氧化氢（约 1 mL）处理 20 分钟，直至培养基颜色变为黄色，然后丢弃。

结果

术后，小鼠可能出现轻微的运动功能障碍，包括尾巴及可能的后肢轻瘫，持续时间最长可达24小时。此后，小鼠不应出现后肢瘫痪和/或轻瘫，步态应仅有轻微改变。

图3展示了脊髓轻微损伤后5天神经球实验的代表性结果。损伤后，来源于dNSC的神经球（在EFH培养基中培养）的绝对数量多于来源于pNSC的神经球（在LIF培养基中培养）的数量（分别为图3A和3B）。高倍镜下观察确定性神经球（图3C）和原始神经球（图3D）的图像显示了这两类克隆在形态上的差异：确定性神经球直径较大（≥80 µm），通常具有较大的深色中心；而原始神经球体积较小（≥50 µm），细胞排列更为紧密。来自损伤脊髓不同区域产生的神经球...

讨论

在手术过程中，研究人员需特别关注若干关键步骤，以获得最佳结果并尽量减少动物间的个体差异。手术期间需谨慎使用吸入式麻醉剂（异氟烷），因为已有研究表明，长时间暴露于该麻醉剂会产生神经保护作用²⁷。因此，在研究脊髓损伤后的再生能力时，应尽可能快速高效地完成手术，以避免混杂因素的干扰。保持每只小鼠接受的异氟烷暴露时间一致，可降低实验变异性。整个手术过程中应持续监测小鼠的呼吸频率，避免呼吸过慢（每2–3秒少于1次）或严重费力（i.e.，喘息）。可根据接受较低剂量麻醉的小鼠情况，将麻醉维持剂量从2–3%适当下调，以防止因长时间麻醉导致死亡。

手术过程中，在脊柱两侧进行肌肉切口时需格外小心。确保切口足够深，并将刀片向内侧倾斜，使刀片边缘在肌肉切开时紧贴椎骨表面。若刀片向外倾斜，可能导致血管损伤而引起过度出血。研究人员在进行椎板切除时也应特别注意，避免剪刀过度深入，否则会损伤脊髓，造成不必要的组织损伤和功能缺陷。本实验的适当对照组应为仅进行"椎板切除"的组别（无损伤），以便比较神经干细胞（NSC）的激活是由针道损伤引...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿基米德拉钩	Fine Science Tools	17005-04
Moria Vannas-Wolff弹簧剪（弯型）	Fine Science Tools	15370-50	订购时定制为钝头尖端
Graefe镊子（直型，1×2齿）	Fine Science Tools	11053-10
超细Graefe镊子（弯型，带齿）	Fine Science Tools	11152-10	或任何其他适用于缝合的镊子
Hartman止血钳（直型）	Fine Science Tools	13002-10	或任何其他适用于缝合的器械
手术刀柄 #3	Fine Science Tools	10003-12	或任何其他适用型号
毛发修剪器	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	或任何其他适用型号
立体定位仪	Stoeling	51500	或任何其他适用型号
布托啡诺			或动物护理机构批准的任何其他适当药物
美洛昔康			或动物护理机构批准的任何其他适当药物
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	或任何其他适用产品
异氟烷	Baxter International Inc	DIN 02225875	或任何其他适用于麻醉的药物
棉签	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
棉质纱布	Fisher Scientific	13-761-52
30G针头	Becton Dickinson	305106	用于损伤造模
25G针头	Becton Dickinson	305122	用于药物注射
1 mL注射器	Becton Dickinson	3090659	用于药物注射
3 mL注射器	Becton Dickinson	309657	用于液体注射
4-0缝线	uoftmedstore.com	2297-VS881	用于皮肤缝合
6-0缝线	uoftmedstore.com	VS889	用于肌肉缝合
Polysporin软膏	amazon.ca	102051
异氟烷挥发器	VetEquip	901806
15 mL锥形管	ThermoFisher		任何适用型号
培养皿	ThermoFisher		任何适用型号
台盼蓝	ThermoFisher		任意
血细胞计数板	ThermoFisher		任何适用型号
离心机	ThermoFisher		任何适用型号
标准解剖工具	Fine Science Tools
解剖显微镜	Zeiss	Stemi 2000
计数显微镜	Olympus	CKX41
神经基础培养基A	Invitrogen	10888-022
B27	Invitrogen	17404-044
青霉素-链霉素	Gibco	15070
L-谷氨酰胺	Gibco	25030
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	12700075
30%葡萄糖	Sigma	G6152	1 M，9.01 g溶于100 mL dH2O
1 M葡萄糖
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761	155 mM，1.30 g溶于100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g溶于100 mL dH2O
脱铁转铁蛋白	R&D Systems	3188-AT
腐胺	Sigma	P7505
胰岛素	Sigma	I5500
硒	Sigma	S9133
孕酮	Sigma	P6149
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	PDS	每瓶木瓜蛋白酶可用于2个样本
表皮生长因子	Invitrogen	PMG8041	粉末用1 mL激素混合液重悬，分装为20 μL/管，冻存
成纤维细胞生长因子	Invitrogen	PHG0226	粉末用0.5 mL激素混合液重悬，分装为20 μL/管，冻存
肝素	Sigma	H3149
白血病抑制因子	本实验室制备
台盼蓝
血细胞计数板
24孔板	NUNC
2 M NaCl	Sigma	S5886	11.69 g溶于100 mL dH2O
1 M KCl	Sigma	P5405	7.46 g溶于100 mL dH2O
1 M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g溶于100 mL dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g溶于100 mL dH2O