从猎蝽及其他异翅亚目昆虫中采集毒液毒素

摘要

尽管半翅目异翅亚目（Heteroptera，属于昆虫纲半翅目）中的许多昆虫具有毒性，但它们毒液的成分及其毒素功能在很大程度上仍不清楚。本实验方案描述了利用电刺激、扰动刺激以及毒腺解剖等方法采集异翅亚目昆虫毒液，以供进一步表征研究。

摘要

异翅亚目昆虫，如猎蝽（Reduviidae）和大水蝽（Belostomatidae），源自一个共同的捕食性且具毒性的祖先，现存大多数异翅亚目昆虫仍保留这种营养策略。部分异翅亚目昆虫已转为取食脊椎动物血液（例如锥蝽亚科的接吻虫，Triatominae；以及臭虫科的床虱，Cimicidae），而另一些则重新回归植食性（大多数盾蝽总科昆虫，Pentatomomorpha）。然而，与蜘蛛、蝎子和蛇类的毒液相比，除接吻虫在吸血过程中利用唾液辅助取食外，人们对异翅亚目昆虫毒液的了解仍然十分有限。

对异翅亚目昆虫毒液毒素进行表征的一个障碍在于其毒腺/下唇腺的结构与功能，这些腺体不仅形态复杂，还承担多种生物学功能（防御、捕食和胞外消化）。本文中，我们介绍了三种已成功用于采集异翅亚目昆虫毒液的方法。首先，我们提出电刺激是一种便捷的毒液采集方式，所获得的毒液在注入猎物体内时常具有致死性，且可避免腺体组织的污染。其次，我们发现对动物进行轻度骚扰足以促使某些类群的异翅亚目昆虫从吻部排出毒液，甚至喷射毒液。第三，我们描述了通过解剖麻醉后的昆虫以获取毒腺来收集毒液毒素的方法。该方法是对其他方法的补充，可用于那些电刺激和骚扰方法无效的分类群的毒素采集。这些实验方案将有助于研究人员从异翅亚目昆虫中获取毒素，用于结构与功能的表征研究，并探索其在医学和农业中的潜在应用。

引言

异翅亚目昆虫的毒液是具有强生物活性的物质¹。例如，以血液为食的异翅亚目昆虫（如锥蝽（Triatominae）和臭虫（Cimicidae））所分泌的毒液或唾液可通过干扰止血过程来促进取食²。这些毒液中的毒素可作用于多个生理通路，包括凝血、血小板聚集和血管收缩，同时也影响疼痛和瘙痒相关通路。大多数其他异翅亚目物种的毒液则适应于捕食而非吸血。当注入无脊椎动物体内时，其毒液可导致麻痹、死亡和组织液化^3,4。当注入脊椎动物体内时，其毒液也可能产生严重效应。例如，刺蝽Holotrichius innesi的毒液注入脊椎动物后可引起疼痛、肌肉麻痹和出血；被该昆虫毒害的小鼠会因呼吸麻痹而迅速死亡⁵。

转录组学和蛋白质组学研究已揭示了部分异翅亚目昆虫毒液的蛋白质组成。捕食性物种的毒液富含蛋白酶、其他酶类以及结构和功能未知的多肽和蛋白质^6,7,8。锥蝽毒液富含 triabin 蛋白家族成员，该家族成员对凝血、血小板聚集和血管收缩具有显著影响^2,9。然而，大多数毒液生物活性背后的毒素成分尚不清楚。例如，已报道锥蝽 Triatoma infestans 的毒液具有镇痛作用并可抑制钠离子通道¹⁰，但其有效成分仍有待阐明。同样，猎蝽毒液中引起麻痹或疼痛的具体成分亦不清楚。要鉴定介导特定毒液生物活性的毒素，并对新型毒液毒素的结构与功能进行表征，前提是能够获取毒液。

已通过电刺激^{5,6,7,8,11,12,13}、诱发防御反应^4,8、机械挤压胸部^12,14,15,16、解剖分离毒腺^{8,17,18,19,20,21,22}，以及应用毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂²³等方法从异翅亚目昆虫中获取毒液。由于异翅亚目昆虫毒腺具有特殊的形态结构，评估任一采集方法的潜在优缺点均较为复杂。其毒腺由一个主腺体和两个独立腔室——前主腺（AMG）与后主腺（PMG）——以及一个附属腺（AG）组成。这些不同的腺体区室可产生不同的蛋白质分泌物，可能分别特化于捕食、防御和胞外消化等不同生物学功能^8,17。在猎蝽科的Peiratinae亚科和Ectrichodiinae亚科昆虫中，AMG被认为与捕食相关，而PMG则与胞外消化相关¹⁷。然而，在猎蝽科Harpactorinae亚科的Pristhesancus plagipennis中，PMG特化用于捕食和消化，而AMG则被推测分泌防御性毒液⁸。附属腺（AG）在猎蝽中被认为分泌功能较弱⁸，而在大田鳖中则被描述为主要的蛋白酶储存部位²³。显然，仍需进一步研究以明确各类异翅亚目昆虫不同腺体区室的功能，并确定大多数毒液毒素的具体作用。本报告中，我们描述了为实现上述目标而从异翅亚目昆虫中采集毒液毒素的实验方案。

方案

本方案符合昆士兰大学所制定的政策 教学与科研中动物的负责任照护与使用 （PPL 4.20.11）以及国家卫生与医学研究理事会的 澳大利亚科学实验动物护理与使用规范 (8^th 2013年版

注意：处理猎蝽时需小心，避免被其毒液伤害。处理具有防御性喷射毒液能力的物种时，应注意保护眼睛。在整个操作过程中需注意避免损伤实验动物，包括监测橡胶带等固定装置的压力，确保吻部未受损伤。

注意：在目标1-3中采集毒液前，可选择通过将动物暴露于CO₂中0.5-2分钟，或将其冷却至4-10 °C进行麻醉，以方便安全转移和固定。麻醉并非必需步骤，但可能有助于更安全地固定敏捷或强壮的个体。然而，动物必须保持清醒状态，以便进行毒液采集。在决定是否添加蛋白酶抑制剂时，需考虑后续应用的需求。

1. 通过电刺激采集毒液毒素

1. 获取活体样本以采集毒素。
2. 使用预先制备的塑料镊子，其两端分别装有正负电极。将通电镊子连接至电刺激器或可调节电压的恒压电源。
   1. 对于小型（约 10 mm）和大型（约 25 mm）的猎蝽，分别使用 15 V 和 25 V 的峰值电压。
   2. 对于较大的异翅亚目昆虫（如大田鳖），可使用高达 40 V 的电压。
3. 用橡皮筋固定在胸部，将活虫固定于平台之上以进行约束。
4. 将口器末端置于合适的收集尖端中。对于猎蝽，使用 P200 移液器吸头；对于大田鳖，剪去 P200 吸头的末端以增大开口尺寸。
   1. 用一对洁净的闭合镊子轻轻抬起口器，并将收集吸头的开口端套在口器末端。
   2. 如有需要，可在将口器置入收集吸头前，先吸入约 5 µL 超纯水。此举可减少毒液残留在吸头内部的损失，但所采集的毒液会被稀释。
5. 施加电刺激。将刺激电极浸入导电凝胶中（例如 2.5 M NaCl/50% 甘油）。将电极置于胸部；对于大田鳖科昆虫，将两个电极置于头部背侧后部表面。
6. 储存毒液以防止自降解。毒液排出后，应迅速转移至 -20 °C 或 -60 °C 的离心管中，或含有蛋白酶抑制剂混合物的离心管中。
7. 重复步骤 1.5 和 1.6，直至获得足够的毒液，或不再有新的毒液排出为止。

2. 通过刺激采集毒液毒素

1. 按照第1.1节和第1.3–1.4节所述，准备动物以采集毒液，并将吻部尖端置于收集室中。
2. 若毒液自发排出，则进入步骤2.3；否则，用镊子轻轻触碰动物的腿部、腹部和触角进行刺激，直至产生毒液。
3. 迅速将毒液转移至置于-20 °C或-60 °C的离心管中，或根据需要转移至含有蛋白酶抑制剂混合物的离心管中。

3. 通过刺激毒液获取毒液毒素 "吐液" 物种

1. 在将昆虫从饲养容器中取出之前，应将其麻醉或部分麻醉，以防止其提前喷射毒液。
2. 诱发毒液喷射行为。使用标准90 × 16 mm培养皿的深盖进行限制并重新定位昆虫。将皿盖置于昆虫后方稍远处，距离其上方1–4 cm，以防止其飞行。大多数昆虫会多次喷射毒液，通常连续快速喷射。确保所有毒液均收集在培养皿盖的内表面。
3. 用10 µL超纯水冲洗培养皿内表面以收集毒液，并迅速转移至置于-20 °C或-60 °C的离心管中，或转移至含有蛋白酶抑制剂混合物的离心管中。

4. 通过腺体解剖采集毒液毒素

1. 处死动物。使用高浓度麻醉剂或通过暴露于 CO₂ 超过 >5 分钟的方式处死动物。将纯 CO₂ 直接通入动物饲养容器的通气孔中。
2. 将昆虫固定于解剖托盘上。对猎蝽类昆虫，通过腹面进行解剖（4.3）。对大水蝽类昆虫，通过背面进行解剖（4.4）。
3. 腹面解剖
   1. 在腹部后端插入三枚大头针，以固定昆虫，注意避免刺穿毒腺。
   2. 使用微型手术刀在腹部腹面中线处做一小切口。用微型剪刀从中线切口向前延伸至头部，注意仅切割外骨骼，避免损伤内部结构。
   3. 为暴露内部结构，从中线切口向两侧做多个横向切口。然后将腹面外骨骼的每一侧瓣向后固定，以显露内部结构。
   4. 对于体型较大的猎蝽，分别在腹部中段、腹部前段、第一与第二对足之间，以及第一对足前方做四个横向切口。
4. 背面解剖
   1. 在基部附近移除翅膀。在腹部后端插入三枚大头针，以固定昆虫，注意避免刺穿毒腺。
   2. 使用微型剪刀和手术刀从头部至腹部做一条中线切口，注意仅切割外骨骼，避免损伤内部结构。
   3. 用力将昆虫的两半分开。沿昆虫体长方向在两侧放置数枚大头针，使内部体腔保持暴露状态。
   4. 使用镊子移除飞行肌。
5. 淹没解剖托盘。加入 PBS 至淹没昆虫，使内部结构浮起，便于观察。
6. 使用镊子和显微剪刀小心移除结缔组织、神经组织和气管。毒腺呈细长、半透明状结构，沿消化道两侧延伸。
   1. 根据其典型形态识别主腺体，包括前叶和后叶，以及在门部汇合的两条导管。
   2. 如需识别副腺体，可沿门部导管进行追踪。切断从门部发出的两条导管，以游离主腺体。
7. 采集所需腺体腔内容物。将腺体转移至含有 30 µL PBS 或含蛋白酶抑制剂混合物的 PBS 的微量离心管中，置于冰上。用洁净锋利的大头针刺破腺体。
   1. 涡旋振荡 10 秒，离心（1 分钟，5,000 × g，4 °C），以排空腺体腔内容物。用镊子移除腺体组织。
8. 澄清毒素提取物。离心（5 分钟，17,000 × g，4°C）以去除任何固体颗粒，保留上清液，弃去沉淀。储存于 -20°C 或 -60°C，以防止自溶性降解。

结果

一些异翅亚目物种，例如猎蝽亚科 P. plagipennis 以及猎蝽亚科 Platymeris rhadamanthus，可稳定获得大量（5-20 µL) 对电刺激产生的毒液量 (表1）。通常情况下，大多数刺蝽亚科、猎蝽亚科和矛蝽亚科的蝽类对此方法可产生毒液。在细足蝽亚科蝽类中，电刺激可诱导其分泌毒液 Oncocephalus sp. 但不是 Thodelmus sp. 采集的Holoptilinae和Emesinae亚科蝽类未获得显著量的毒液例如 足以通过质谱分析进行检测）以响应电刺激。电刺激也可用于从大田鳖科昆虫和捕食性蝽类中采集毒液。然而，对水蝎（Nepidae）进行电刺激仅诱导头部腺体内容物的释放，而非来自吻部的毒液。某些物种无法通过电刺激成功采集毒液，最可能的原因在于其毒腺结构的形态复杂性以及控制毒液释放的生理机制。⁸.

讨论

收集猎蝽毒液最关键的步骤是根据研究目的选择合适的方法。文中介绍的三种收集异翅亚目昆虫毒液的方法，各有其优缺点，具体选择需根据后续应用而定。

诱导臭虫从其吻部排出毒液（方案1-3）可避免毒液被腺体组织污染。此外，这些方法为非致死性，可在臭虫的生命周期内多次重复使用。根据多项研究，电刺激通常能获得最大量的毒液，并且所得毒液对猎物昆虫具有强效毒性^5,8。激发防御反应是另一种促使吻部释放毒液的方法，且该方法所获得的毒液蛋白质组成可能与电刺激所得毒液不同⁸。然而，电刺激和诱发防御反应并不适用于许多物种，且在缺乏对毒腺分泌物输出进行平行研究的情况下，尚不清楚当前采集的是哪一个腺腔（或哪些腺腔的组合）中的分泌物。

通过解剖采集毒液（方案4）在许多方面具有互补性。解剖法可直接获取储存的毒液，并能对毒腺的各个区室分别采集或混合收集。即，从而避免了采集到“错误”毒液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电刺激器	Grass Technologies	S48 Square Pulse Stimulator	用于实现脉冲式电刺激的电刺激设备
轻质镊子	Australian Entomological Supplies	E122B	用于操作活体有毒昆虫
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	4693124001	用于防止毒液发生自溶性降解
解剖器械	Australian Entomological Supplies	E152Micro	用于精细解剖操作
昆虫针	Australian Entomological Supplies	E162	用于精细解剖操作