从猎蝽及其他异翅亚目昆虫中采集毒液毒素

摘要

尽管半翅目异翅亚目（Heteroptera，属于昆虫纲半翅目）中的许多昆虫具有毒性，但它们毒液的成分及其毒素功能在很大程度上仍不清楚。本实验方案描述了利用电刺激、扰动刺激以及毒腺解剖等方法采集异翅亚目昆虫毒液，以供进一步表征研究。

摘要

异翅亚目昆虫，如猎蝽（Reduviidae）和大水蝽（Belostomatidae），源自一个共同的捕食性且具毒性的祖先，现存大多数异翅亚目昆虫仍保留这种营养策略。部分异翅亚目昆虫已转为取食脊椎动物血液（例如锥蝽亚科的接吻虫，Triatominae；以及臭虫科的床虱，Cimicidae），而另一些则重新回归植食性（大多数盾蝽总科昆虫，Pentatomomorpha）。然而，与蜘蛛、蝎子和蛇类的毒液相比，除接吻虫在吸血过程中利用唾液辅助取食外，人们对异翅亚目昆虫毒液的了解仍然十分有限。

对异翅亚目昆虫毒液毒素进行表征的一个障碍在于其毒腺/下唇腺的结构与功能，这些腺体不仅形态复杂，还承担多种生物学功能（防御、捕食和胞外消化）。本文中，我们介绍了三种已成功用于采集异翅亚目昆虫毒液的方法。首先，我们提出电刺激是一种便捷的毒液采集方式，所获得的毒液在注入猎物体内时常具有致死性，且可避免腺体组织的污染。其次，我们发现对动物进行轻度骚扰足以促使某些类群的异翅亚目昆虫从吻部排出毒液，甚至喷射毒液。第三，我们描述了通过解剖麻醉后的昆虫以获取毒腺来收集毒液毒素的方法。该方法是对其他方法的补充，可用于那些电刺激和骚扰方法无效的分类群的毒素采集。这些实验方案将有助于研究人员从异翅亚目昆虫中获取毒素，用于结构与功能的表征研究，并探索其在医学和农业中的潜在应用。

引言

异翅亚目昆虫的毒液是具有强生物活性的物质¹。例如，以血液为食的异翅亚目昆虫（如锥蝽（Triatominae）和臭虫（Cimicidae））所分泌的毒液或唾液可通过干扰止血过程来促进取食²。这些毒液中的毒素可作用于多个生理通路，包括凝血、血小板聚集和血管收缩，同时也影响疼痛和瘙痒相关通路。大多数其他异翅亚目物种的毒液则适应于捕食而非吸血。当注入无脊椎动物体内时，其毒液可导致麻痹、死亡和组织液化^3,4。当注入脊椎动物体内时，其毒液也可能产生严重效应。例如，刺蝽Holotrichius innesi的毒液注入脊椎动物后可引起疼痛、肌肉麻痹和出血；被该昆虫毒害的小鼠会因呼吸麻痹而迅速死亡⁵。

转录组学和蛋白质组学研究已揭示了部分异翅亚目昆虫毒液的蛋白质组成。捕食性物种的毒液富含蛋白酶、其他酶类以及结构和功能未知的多肽和蛋白质^6,7,8。锥蝽毒液富含 triabin 蛋白家族成员，该家族成员对凝血、血小板聚集和血管收缩具有显著....

方案

本方案符合昆士兰大学所制定的政策 教学与科研中动物的负责任照护与使用 （PPL 4.20.11）以及国家卫生与医学研究理事会的 澳大利亚科学实验动物护理与使用规范 (8^th 2013年版

注意：处理猎蝽时需小心，避免被其毒液伤害。处理具有防御性喷射毒液能力的物种时，应注意保护眼睛。在整个操作过程中需注意避免损伤实验动物，包括监测橡胶带等固定装置的压力，确保吻部未受损伤。

注意：在目标1-3中采集毒液前，可选择通过将动物暴露于CO₂中0.5-2分钟，或将其冷却至4-10 °C进行麻醉，以方便安全转移和固定。麻醉并非必需步骤，但可能有助于更安全地固定敏捷或强壮的个体。然而，动物必须保持清醒状态，以便进行毒液采集。在决定是否添加蛋白酶抑制剂时，需考虑后续应用的需求。

1. 通过电刺激采集毒液毒素

1. 获取活体样本以采集毒素。
2. 使用预先制备的塑料镊子，其两端分别装有正负电极。将通电镊子连接至电刺激器或可调节电压的恒压电源。
   1. 对于小型（约 10 mm）和大型（约 25 mm）的猎蝽，分别使用 15 V 和 25 V 的峰值电压。
   2. 对于较大的异翅亚目昆虫（如大田鳖），可使用高达 40 V 的电压。

结果

一些异翅亚目物种，例如猎蝽亚科 P. plagipennis 以及猎蝽亚科 Platymeris rhadamanthus，可稳定获得大量（5-20 µL) 对电刺激产生的毒液量 (表1）。通常情况下，大多数刺蝽亚科、猎蝽亚科和矛蝽亚科的蝽类对此方法可产生毒液。在细足蝽亚科蝽类中，电刺激可诱导其分泌毒液 Oncocephalus sp. 但不是 Thodelmus sp. 采集的Holoptilinae和Emesinae亚科蝽类未获得显著量的毒液例如 足以通过质谱分析进行检测）以响应电刺激。电刺激也可用于从大田鳖科昆虫和捕食性蝽类中采集毒液。然而，对水蝎（Nepidae）进行电刺激仅诱导头部腺体内容物的释放，而非来自吻部的毒液。某些物种无法通过电刺激成功采集毒液，最可能的原因在于其毒腺结构的形态复杂性以及控制毒液释放的生理机制。⁸.

讨论

收集猎蝽毒液最关键的步骤是根据研究目的选择合适的方法。文中介绍的三种收集异翅亚目昆虫毒液的方法，各有其优缺点，具体选择需根据后续应用而定。

诱导臭虫从其吻部排出毒液（方案1-3）可避免毒液被腺体组织污染。此外，这些方法为非致死性，可在臭虫的生命周期内多次重复使用。根据多项研究，电刺激通常能获得最大量的毒液，并且所得毒液对猎物昆虫具有强效毒性^5,8。激发防御反应是另一种促使吻部释放毒液的方法，且该方法所获得的毒液蛋白质组成可能与电刺激所得毒液不同⁸。然而，电刺激和诱发防御反应并不适用于许多物种，且在缺乏对毒腺分泌物输出进行平行研究的情况下，尚不清楚当前采集的是哪一个腺腔（或哪些腺腔的组合）中的分泌物。

通过解剖采集毒液（方案4）在许多方面具有互补性。解剖法可直接获取储存的毒液，并能对毒腺的各个区室分别采集或混合收集。即，从而避免了采集到“错误”毒液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电刺激器	Grass Technologies	S48 Square Pulse Stimulator	用于实现脉冲式电刺激的电刺激设备
轻质镊子	Australian Entomological Supplies	E122B	用于操作活体有毒昆虫
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	4693124001	用于防止毒液发生自溶性降解
解剖器械	Australian Entomological Supplies	E152Micro	用于精细解剖操作
昆虫针	Australian Entomological Supplies	E162	用于精细解剖操作