真核生物中转录错误的全基因组监测

摘要

本方案为研究人员提供了一种新工具，可用于监测多种模式生物中转录的保真度。

摘要

准确的转录对于遗传信息的忠实表达至关重要。然而令人惊讶的是，目前对控制转录保真度的机制仍知之甚少。为了填补这一科学空白，我们近期优化了环形测序（circle-sequencing）检测方法，以在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的转录组范围内检测转录错误。本实验方案将为研究人员提供一种强大的新工具，用于绘制真核细胞中转录错误的图谱，从而以前所未有的细节揭示调控转录保真度的分子机制。

引言

基因组提供了生命精确的生物学蓝图。为了正确实施这一蓝图，基因组的转录必须具有高度精确性。然而，转录过程不太可能完全无误。例如，RNA聚合酶长期以来已知具有较高的错误倾向。 体外^1,2，最近有研究表明它们会产生错误 体内 以及^3,5,6，尤其是在面临DNA损伤时^7,8,9,10综上所述，这些观察结果表明，转录错误在所有活细胞中持续发生，提示它们可能是突变蛋白的一个重要来源。

这一过程被称为转录突变，与经典突变在两个方面有所不同。首先，与基因突变不同，转录错误会影响有丝分裂细胞和终末分化后的细胞，因为其发生不依赖于DNA复制。因此，研究影响转录保真度的机制将有助于深入理解有丝分裂细胞和终末分化后细胞的突变负荷。有趣的是，最近研究表明转录错误可能促进蛋白质聚集

方案

1. 准备

1. RNase无处不在，因此需使用去污染试剂彻底喷洒并清洁工作区域（例如, RNase AWAY 和 70% 乙醇。对移液器、笔或试管架等物品进行喷洒处理，以去除潜在的 RNase 污染源。
2. 为进一步防止RNase污染样本，实验过程中应穿着实验服或长袖T恤。取用离心管时，尤其是从盒子或袋子中取出时，应避免手套与管内壁接触。
3. 在逆转录之前，应频繁更换手套。
   注意：为了获得最佳结果，在逆转录之前不要暂停实验。

2. 细胞与动物培养及样品采集

1. Saccharomyces cerevisiae 的培养与收集
   1. 若需从酵母中构建 C-seq 文库，首先将一单菌落 S. cerevisiae 接种于 3 mL 含酵母提取物、腺嘌呤、蛋白胨和葡萄糖（YAPD）的培养基中，在 30 °C 滚动培养箱中过夜培养。
   2. 次日早晨，将菌液以 0.1 的光密度（OD）重新接种至 50 mL YAPD 培养基中，继续培养至 OD 达到 0.5–0.7（约 7 × 10⁶ 个细胞/mL）。
   3. 将全部 50 mL 培养物（约 350 × 10⁶....

结果

与所有大规模并行测序方法一样，每次C-seq实验都会产生庞大且难以处理的数据集。对于初次使用者而言，处理这些数据集可能较为困难；因此，建议所有使用者在实验前联系有经验的生物信息学专家。通常情况下，在大多数大规模并行测序平台上，每次运行预计可产生约55–70千兆碱基（Gbases）的数据。在本方案中，通常每次运行会将12–30个样本进行多重测序，从而使每个样本获得约2–6 Gbases的数据量。在从该数据集中去除接头序列以及低质量碱基识别（< 20）后，约保留初始数据量的70%。

随后进一步分析这些碱基，以通过测定生成的重复序列长度来评估RNA片段化和环化的效率。大多数重复序列的长度在45–80个碱基之间（图4A），约50%的测序碱基属于这些重复序列（图4B）。由于大多数碱基存在于包含3个或更多重复序列的读段中，因此测序获得的唯一.......

讨论

本文介绍了一种优化的C-seq文库制备方案，用于检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中的转录错误。该方案相较于现有方法及其他替代技术具有多项优势。

在过去的15年中，已开发出多种依赖荧光素酶^7,8或Cre-Lox重组^3,4,15,21来检测转录错误的报告系统。这些报告系统对研究人员理解转录保真度具有重要价值，因为它们使得能够鉴定出直接调控转录保真性的基因、等位基因和分子机制。然而，这些系统仅能报告人工损伤模板或特.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RiboPure RNA 纯化试剂盒	ThermoFisher	AM1926	总 RNA 纯化
Genelute mRNA 纯化试剂盒	Sigma-Aldrich	MRN70-1KT	mRNA 纯化
无核酸酶水	Ambion	AM9937	洗脱和稀释
Ambion RNase III	ThermoFisher	AM2290	RNA 片段化
T4 RNA 连接酶 1（ssRNA 连接酶）	New England Biolabs	M0204S	RNA 环化
Ribolock	ThermoFisher	EO0381	RNase 抑制剂
SuperScript III 逆转录酶	ThermoFisher	18080044	滚环逆转录
10 mM dNTP 混合液	ThermoFisher	18427013	滚环逆转录
随机六聚体（50 ng/µL）	ThermoFisher	N8080127	滚环逆转录
NEB 第二链合成模块	New England Biolabs	E6111S	第二链合成
NEBNext Ultra DNA 文库制备试剂盒（适用于 Illumina）	New England Biolabs	E7370S	cDNA 文库构建
NEB Next index 引物	NEB	E7335S	多重 PCR 引物
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4061	RNA 和 DNA 样本纯化
DynaMag-2 磁力架	ThermoFisher	12321D	磁珠纯化
AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63881	磁珠纯化
Eppendorf 5424 微型离心机	FisherScientific	05-403-93	离心
INCU-Shaker 10 L	Benchmark Scientific	H1010	细胞培养
T100 梯度 PCR 仪	BIO RAD	1861096	中高温循环条件
PTC-200 梯度 PCR 仪	GMI	8252-30-0001	低温循环条件
RNase Away	Molecular Bioproducts	700S-11	消毒
50 mL 离心管	Corning	430290	无核酸酶
15 mL 离心管	Corning	430052	无核酸酶
Eppendorf 管	USA Scientific	1615-5500	无核酸酶
4200 Tapestation 系统	Agilent	G2991AA	用于 RNA 和单链 DNA 样本质量控制的核苷酸分析仪器
高灵敏度 RNA Screen Tape	Agilent	5067-5579	RNA 和单链 DNA 样本的质量控制
RNA ScreenTape 样本缓冲液	Agilent	5067-5577	RNA 和单链 DNA 样本的质量控制
RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5578	RNA 和单链 DNA 样本的质量控制
2100 Bioanalyzer 仪器	Agilent	G2939BA	双链 DNA 质量控制
高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent	5067-4626	双链 cDNA 样本的质量控制
水浴锅	VWR	462-0244	孵育
NanoDrop 2000/2000C 分光光度计	ThermoFisher	ND-2000C	RNA 浓度测定