真核生物中转录错误的全基因组监测

摘要

本方案为研究人员提供了一种新工具，可用于监测多种模式生物中转录的保真度。

摘要

准确的转录对于遗传信息的忠实表达至关重要。然而令人惊讶的是，目前对控制转录保真度的机制仍知之甚少。为了填补这一科学空白，我们近期优化了环形测序（circle-sequencing）检测方法，以在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的转录组范围内检测转录错误。本实验方案将为研究人员提供一种强大的新工具，用于绘制真核细胞中转录错误的图谱，从而以前所未有的细节揭示调控转录保真度的分子机制。

引言

基因组提供了生命精确的生物学蓝图。为了正确实施这一蓝图，基因组的转录必须具有高度精确性。然而，转录过程不太可能完全无误。例如，RNA聚合酶长期以来已知具有较高的错误倾向。 体外^1,2，最近有研究表明它们会产生错误 体内 以及^3,5,6，尤其是在面临DNA损伤时^7,8,9,10综上所述，这些观察结果表明，转录错误在所有活细胞中持续发生，提示它们可能是突变蛋白的一个重要来源。

这一过程被称为转录突变，与经典突变在两个方面有所不同。首先，与基因突变不同，转录错误会影响有丝分裂细胞和终末分化后的细胞，因为其发生不依赖于DNA复制。因此，研究影响转录保真度的机制将有助于深入理解有丝分裂细胞和终末分化后细胞的突变负荷。有趣的是，最近研究表明转录错误可能促进蛋白质聚集^11,12,13，并被假定在致癌过程¹⁰以及细菌对抗生素耐药性的产生中发挥一定作用¹⁴。

其次，与基因突变不同，转录错误在本质上是短暂的。这种短暂性带来了特别的挑战，因为它使得转录错误极难被检测。例如，尽管已有多个实验室开发出有价值的报告基因检测方法用于研究转录诱变，但这些检测方法仅能在有限的背景和模式生物中测量转录错误^4,15。为了克服这些局限，许多研究人员转向了RNA测序技术（RNA-seq），该技术理论上能够记录任何物种转录组中全部的转录错误。然而，这些研究极易受到文库构建过程中产生的人为假象的干扰，例如逆转录错误、PCR扩增错误以及测序过程本身固有的错误倾向。例如，逆转录酶大约每 ~20,000 个碱基引入一个错误，而RNA聚合酶（RNAPs）预计每 300,000 个碱基才发生一个错误^5,6。由于仅逆转录步骤的错误率就远高于细胞内RNA聚合酶的错误率，因此在传统的RNA-Seq数据中几乎无法区分真实的转录错误与文库制备过程中产生的人为假象（图1a）。

为了解决这一问题，我们开发了一种优化版本的环形测序（Circle-Sequencing，简称 Cirseq 或 C-seq）检测方法^5,16。该检测方法可使研究人员在整个转录组范围内检测RNA中的转录错误及其他稀有变异⁵。该方法被称为环形测序，是因为其中关键一步涉及RNA的环化。一旦RNA靶标完成环化，便会以滚环方式逆转录，生成包含同一RNA模板多个拷贝的线性cDNA分子。如果某一模板中存在错误，则该错误将出现在cDNA分子内每一个重复序列中。相比之下，逆转录、PCR扩增或测序过程中引入的错误通常是随机发生的，因此仅会出现在一至两个重复序列中。因此，通过对每个cDNA分子生成一致性序列，并区分出现在所有重复序列中的错误与随机错误，即可有效将文库构建过程中的技术假象与真实的转录错误区分开来（图1b）。

如果正确使用，C-seq 检测可用于准确检测任何物种转录组中 RNA 的碱基替换、插入和缺失的发生率（例如，参见 Traverse 和 Ochman¹⁷）。例如，我们已利用 C-seq 检测在单碱基分辨率下对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的转录错误率进行了全基因组水平的测量⁵（未发表观察结果）。该 C-seq 检测的优化版本最初用于准确测序 RNA 病毒群体，现已经过改进，以尽量减少文库构建过程中可能导致人为假象的剧烈条件。此外，通过使用多种市售试剂盒，该检测的通量显著提高，操作便捷性也得到改善。若正确使用，该检测可在每次重复实验中准确检测出数千个转录错误，从而大大超越以往的研究⁶。总体而言，该方法为研究转录诱变提供了强有力的工具，将使研究者能够深入理解调控多种生物转录保真度的分子机制。

方案

1. 准备

1. RNase无处不在，因此需使用去污染试剂彻底喷洒并清洁工作区域（例如, RNase AWAY 和 70% 乙醇。对移液器、笔或试管架等物品进行喷洒处理，以去除潜在的 RNase 污染源。
2. 为进一步防止RNase污染样本，实验过程中应穿着实验服或长袖T恤。取用离心管时，尤其是从盒子或袋子中取出时，应避免手套与管内壁接触。
3. 在逆转录之前，应频繁更换手套。
   注意：为了获得最佳结果，在逆转录之前不要暂停实验。

2. 细胞与动物培养及样品采集

1. Saccharomyces cerevisiae 的培养与收集
   1. 若需从酵母中构建 C-seq 文库，首先将一单菌落 S. cerevisiae 接种于 3 mL 含酵母提取物、腺嘌呤、蛋白胨和葡萄糖（YAPD）的培养基中，在 30 °C 滚动培养箱中过夜培养。
   2. 次日早晨，将菌液以 0.1 的光密度（OD）重新接种至 50 mL YAPD 培养基中，继续培养至 OD 达到 0.5–0.7（约 7 × 10⁶ 个细胞/mL）。
   3. 将全部 50 mL 培养物（约 350 × 10⁶ 个细胞）收集至一个 50 mL 锥形管中，在 2,100 × g 条件下离心 3 分钟。小心吸除 YAPD 培养基，并用 1× PBS 洗涤菌体沉淀一次。
   4. 随后，将沉淀重悬于 480 µL 裂解缓冲液、48 µL 10% SDS 和 480 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH 6.8）中。涡旋振荡样品至最大速度 5 秒，转移至含 750 µL 冰冷氧化锆珠（试剂盒提供）的 1.5 mL 螺口管中。继续进行本方案的第 3 步，以完成细胞裂解和总 RNA 提取。
      注：第 2.1.4 步所需的所有试剂均包含在推荐的酵母 RNA 提取试剂盒中。这些试剂对酵母、线虫和果蝇均适用，因此在完成酵母（第 2.1 步）、线虫（第 2.2 步）或果蝇（第 2.3 步）的收集后，可采用统一的方法构建 C-seq 文库（第 3–10 步）。
2. Caenorhabditis elegans 的培养与收集
   1. 若需从线虫中构建 C-seq 文库，将 30 条成虫接种至新鲜的、涂有 OP50 菌的琼脂平板上。
      注：5 个平板足以完成 1 个重复实验。
   2. 培养线虫 4 天，用 5 mL M9 培养基轻轻冲洗平板收集线虫，并将所有线虫汇集至一个 50 mL 锥形管中。
   3. 在 100 × g 条件下离心 2 分钟以形成沉淀。离心结束时以尽可能低的速度减速，避免扰动沉淀。
   4. 将线虫轻柔转移至 1.5 mL 离心管中，用 1.5 mL M9 培养基洗涤两次，每次在 100 × g 条件下离心 1 分钟，以去除细菌并获得干净的约 100 µL 线虫沉淀。
   5. 将线虫沉淀重悬于 480 µL 裂解缓冲液、48 µL 10% SDS 和 480 µL 苯酚:氯仿:异戊醇中。涡旋振荡样品至最大速度 5 秒，转移至含 750 µL 冰冷氧化锆珠的 1.5 mL 螺口管中。继续进行本方案的第 3 步，以完成线虫裂解和总 RNA 提取。
3. Drosophila melanogaster 的培养与收集
   1. 若需从果蝇中构建 C-seq 文库，将 20–25 只果蝇培养于含有葡萄糖或糖蜜培养基的培养瓶中。将果蝇分装至 3 个培养瓶中，每瓶约含 8 只果蝇。
   2. 收集果蝇时，将培养瓶置于冰桶中直至果蝇麻醉。随后用毛刷将果蝇转移至 1.5 mL 离心管中。切勿使用 CO₂ 处理收集果蝇。
   3. 让果蝇恢复至室温（RT），迅速向管中加入预先配制的混合液（500 µL 裂解缓冲液、50 µL 10% SDS 和 500 µL 苯酚:氯仿:异戊醇）。使用微型研磨杵研磨果蝇，约 15 次，并在杵底接触管底时施加牢固的扭转动作。
   4. 将果蝇与裂解液的混合物倒入含 750 µL 冰冷氧化锆珠的 1.5 mL 螺口管中，涡旋振荡至最大速度 5 秒。继续进行本方案的第 3 步，以完成果蝇裂解和总 RNA 提取。

3. 总RNA纯化

注意：至此，三种实验方案汇合，可采用单一的统一方法构建C-seq文库。

1. 拧紧管盖，并使用适配器或胶带将离心管固定在涡旋振荡器上。以最大速度涡旋振荡10分钟以裂解样品，随后在16,100 ×g条件下离心5分钟，使有机溶剂与水相分离。
2. 小心吸取400–500 µL水相，避免扰动白色浑浊的中间相，将其转移至含有1.9 mL结合缓冲液的15 mL锥形管中，通过涡旋充分混匀。
3. 加入1.25 mL 100%乙醇，涡旋混匀样品。将700 µL混合液转移至装配于收集管中的滤过柱中，在14,500 × g条件下离心30秒。重复此步骤，直至全部样品通过滤过柱。
   注意：此时样品可能略微变浑浊。若裂解的细胞、线虫或果蝇过多，可能会出现沉淀物，导致滤膜堵塞。
4. 用700 µL洗涤液1清洗滤过柱一次，再用500 µL洗涤液2或洗涤液3清洗两次。最后在14,500 × g条件下离心2分钟，彻底去除残留乙醇。
5. 将滤过柱转移至1.5 mL海豚管中，加入108 µL预热的洗脱液（65 °C）。
   注意：在进行逆转录之前，切勿使RNA样品暴露于高于65 °C的温度，否则会引起胞嘧啶向尿嘧啶的脱氨反应，此类修饰无法与转录错误相区分。
6. 通过加入11 µL 10× DNase I缓冲液、2 µL RNase抑制剂和4 µL DNase I（8 U），去除分离RNA中的DNA污染（参见步骤2.1–3.4），在37 °C孵育30分钟。
7. 消化完成后，加入11 µL DNase失活试剂。涡旋混匀后室温静置5分钟。随后在15,000 × g条件下离心3分钟，使失活试剂沉淀，小心吸取110 µL上清液，避免扰动沉淀，转移至上清液至1.5 mL离心管中。
   注意：DNase失活试剂可能难以准确移液，每次移液后应目视检查枪头内液体情况。若试剂过于黏稠难以移取，可加入相当于剩余体积1/5的10 mM Tris-HCl（pH 7.4）进行稀释。
8. （质量检测）使用分光光度计测定总RNA浓度。取1 µL总RNA，用无核酸酶水（NF水）稀释至10 ng/µL。使用高灵敏度RNA检测胶条（High Sensitivity RNA Tape）在适当的核酸分析仪器上进行检测，确认RNA未发生降解，且eRIN值至少达到8.5或更高（图2B）。

4. mRNA 富集

1. 使用 mRNA 小量制备试剂盒（参见材料表）进行 mRNA 富集。向样品中加入 140 µL 无核酸酶水，使总体积达到 250 µL。然后加入 250 µL 的 2 倍结合缓冲液，通过涡旋充分混匀样品，并加入 15 µL 寡聚(dT)磁珠。
2. 通过移液器反复吹打混匀样品，并在 65 °C 下孵育 2 分钟。随后将样品置于室温下 10 分钟。最后，在 16,100 x g 条件下离心 2 分钟，以沉淀磁珠:mRNA 复合物。
3. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 500 µL 洗涤液中。将溶液转移至离心柱中，在 15,000 x g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，并用额外的 500 µL 洗涤液洗涤样品。然后在 15,000 x g 条件下再离心 2 分钟，以去除离心柱滤膜中的过量乙醇。
4. 将离心柱转移至海豚管中，并用 80 µL 预热的洗脱液（65 °C）将柱中的沉淀重悬。在 65 °C 下孵育 1.5 分钟，然后在 15,000 x g 条件下离心 1 分钟以完成洗脱。
5. 使用分光光度计或类似工具测定纯化后 RNA 的浓度，该工具应能够定量 RNA 的浓度和质量。

5. RNase III 消化与 RNA 纯化

注意：（重要）为了制备适用于构建 C-seq 文库的环状 RNA 分子，必须将 RNA 片段化至大约 60–80 个碱基的长度。尽管先前的方法曾使用化学法进行 RNA 片段化，但使用重金属的化学片段化会损伤 RNA 样本，这些损伤在最终分析中可能被误读为转录错误。为避免这一问题，应改用 RNase III 进行酶切片段化以产生小片段。这种酶学方法的另一个优势在于，它可产生适用于连接反应的兼容末端，从而省去了化学片段化后所需的末端修复步骤。

1. 使用1 µg纯化的RNA、10 µL反应缓冲液、5 µL RNase III和足量的无核酸酶水（NF水）配制RNA片段化反应体系，总体积为100 µL（参见材料表）。最后加入酶，并用移液器反复吹打混合至少10次。将样品在37 °C孵育25分钟，通常可产生长度约为60–80个碱基的RNA片段。
2. 25分钟孵育结束后，立即使用寡核苷酸纯化浓缩试剂盒（参见材料表）对反应产物进行纯化，以防止进一步消化。向样品中加入200 µL寡核苷酸结合缓冲液，充分涡旋混匀，再加入800 µL 100%乙醇。再次涡旋混匀后，将混合液转移至提供的离心柱中（置于收集管内）。
3. 在10,000 × g条件下离心30秒，随后用750 µL洗涤缓冲液洗涤以去除RNase III。再次于10,000 × g离心30秒，弃去穿滤液，并按上述方法用750 µL洗涤缓冲液再洗涤一次。第二次洗涤后弃去穿滤液，将离心柱在15,000 × g条件下离心2分钟，以彻底去除残留乙醇。
4. 将离心柱转移至新的1.5 mL离心管中，加入24 µL无核酸酶水，在10,000 × g条件下离心1分钟，洗脱样品。
5. 质量检测：取2 µL纯化的RNA片段，加入2 µL无核酸酶水进行2倍稀释。将片段化RNA上样至毛细管电泳系统（screen tape）检测，确认其长度在50–100个碱基范围内（图2c）。

6. RNA 环化与滚环反转录

1. 为环化RNA片段，将20 µL样品在65 °C下加热变性1分钟，立即置于冰上2分钟。然后加入4 µL 10x T4 RNA连接酶缓冲液、4 µL 10 mM ATP、1 µL RNase抑制剂、1 µL NF水和8 µL 50%聚乙二醇（PEG）。
2. 通过涡旋充分混匀样品，然后加入2 µL浓度为10 U/µL的T4 RNA连接酶I。再次用移液器吹打混匀，随后在热循环仪中25 °C孵育2小时，盖子温度设定为30 °C。
3. 孵育2小时后，向样品中加入10 µL NF水，并根据制造商说明书使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒进行纯化。用20 µL NF水洗脱样品。
4. 为反转录环状RNA分子，向9 µL RNA中加入4 µL 10 mM dNTPs、4 µL 50 ng/µL随机六聚体引物和9 µL NF水。通过移液充分混匀，65 °C变性1分钟，然后置于冰上2分钟。将剩余RNA保存作为备份。
5. 加入8 µL 5x第一链合成缓冲液、2 µL 0.1 mM DTT和4 µL浓度为200 U/µL的反转录酶，通过移液混匀。先在25 °C孵育10分钟，随后在42 °C孵育20分钟，反应盖温度设定为比孵育温度高5 °C。
   注意：此步骤必须使用具有链置换能力的反转录酶，以实现滚环反转录。
6. 向样品中加入10 µL NF水，并根据制造商推荐的方法使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒进行纯化。用42 µL洗脱液洗脱样品。
7. 质量检测：将2 µL单链cDNA与2 µL NF水稀释，使用高灵敏度RNA胶带在核苷酸分析仪上检测该样品。若反转录成功，应可见长度约为60–1,500个碱基的cDNA文库。理想情况下，大多数cDNA片段长度在500–1,000个碱基范围内（图2d）。

7. 第二条链 cDNA 合成与末端修复

1. 使用第二链合成试剂盒构建双链cDNA文库。将样品置于冰上，在38 µL样品中加入30 µL无核酸酶水。然后加入8 µL 10x第二链缓冲液和4 µL第二链酶，轻轻吹打混匀后，在16 °C孵育2.5小时。
2. 根据厂商推荐的100 µL反应体系操作说明，使用寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒对样品进行纯化，并用38 µL无核酸酶水洗脱样品。
3. 在35.5 µL双链cDNA中加入20 µL无核酸酶水、6.5 µL末端修复反应缓冲液和3 µL末端修复酶混合液，以建立末端修复反应。仔细检查反应缓冲液中是否存在白色沉淀，如有，可通过手温加热溶解。
4. 通过移液混匀末端修复反应体系，在20 °C孵育30分钟，随后在65 °C继续孵育30分钟。将热循环仪盖温设置为比孵育温度高5 °C。

8. 文库构建中的接头连接与片段大小筛选

1. 使用用于最终文库构建的多步文库制备模块（参见材料表）。首先，将适用于下一代测序的接头用 10 mM Tris-HCl 稀释 10 倍，使其终浓度为 1.5 µM。然后，向每个样本中加入 2.5 µL 稀释后的接头和 1 µL 连接增强剂，并通过涡旋混合均匀。
2. 向每个样本中加入 15 µL Blunt/TA 连接酶主混合液，用移液器混匀后，在 20 °C 下孵育 15 分钟。接着，加入 3 µL 尿嘧啶特异性切除试剂酶，在 37 °C 下孵育 15 分钟。连接完成后，向样本中加入 13.5 µL 无核酸酶水（NF water），使总体积达到 100 µL，随后进行片段大小选择。
   注意：最佳选择长度在 600–800 个碱基范围内的 cDNA 分子。如果片段化的 RNA 分子长度约为 60–80 个碱基，则选择长度为 600–800 个碱基的分子可确保大多数被选中的分子包含至少三个串联重复序列，这有利于后续处理与分析。
3. 为筛选长度在 600–800 bp 范围内的分子，向每个样本中加入 30 µL 已重悬并平衡至室温的磁珠（参见材料表），并通过移液混匀。将样本转移至 1.5 mL 离心管中，在室温下孵育 5 分钟。
4. 将样本置于磁力架上静置 5 分钟，使磁珠与上清液分离。将上清液（含有目标 cDNA 分子）转移至新的 1.5 mL 管中，并弃去磁珠（磁珠上结合的是较大的 cDNA 分子）。
5. 向每个样本中加入 15 µL 新鲜分装的磁珠，充分移液混匀，并在室温下孵育 5 分钟。将样本置于磁力架上，在室温下再孵育 5 分钟。然后，小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠。
   注意：此时磁珠上含有目标 cDNA 分子，请勿丢弃磁珠。
6. 在不扰动已沉淀磁珠的前提下，向每个样本中加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇，孵育 30 秒。弃去乙醇，并用 80% 乙醇再清洗一次。随后彻底去除样本中残留的乙醇，将磁珠在空气中干燥 5 分钟，但注意不要过度干燥。若磁珠过度干燥，沉淀中会出现裂纹。
7. 为从磁珠上洗脱样本，先将离心管从磁力架上取下，加入 19 µL 10 mM Tris-HCl。反复移液多次以充分重悬磁珠，并在室温下孵育 5 分钟。若磁珠曾过度干燥，则孵育时间应超过 >10 分钟。
8. 将样本重新放回磁力架上，孵育 5 分钟以使磁珠与上清液分离。小心吸取 15 µL 含有纯化后且经大小选择的 cDNA 文库的上清液，转移至新的 1.5 mL 管中。

9. PCR 扩增与最终磁珠纯化

1. 向每个纯化的cDNA文库中加入5 µL通用引物和5 µL独特的index引物（参见材料表），并通过移液充分混匀。仔细检查聚合酶预混液中是否存在晶体或其他沉淀物，并用手温育预混液直至沉淀物完全溶解。
   1. 向样品中加入25 µL聚合酶预混液，通过移液混匀，然后按照以下循环条件进行PCR扩增。首先在98 °C下进行30 s的初始变性，随后进行双步PCR反应：在98 °C下变性10 s，然后在65 °C下退火/延伸75 s（共12个循环），最后在65 °C下延伸5 min，并在4 °C下无限期保存。
2. 通过将45 µL重悬的磁珠直接加入PCR反应体系中进行最终文库的纯化，用移液器混匀后在室温下孵育5 min。将样品转移至1.5 mL离心管中并置于磁力架上，孵育5 min后弃去上清液，再用新配制的80%乙醇洗涤两次，每次30 s。
3. 第二次洗涤后，彻底去除样品中的乙醇，将磁珠沉淀在空气中干燥5 min，然后用35 µL 0.1x TE缓冲液洗脱。通过移液重悬磁珠，在室温下孵育5 min。将样品置于磁力架上，5 min后将30 µL上清液转移至新的1.5 mL离心管中。将文库储存于-80 °C。
4. 质量检测：取1 µL最终文库加入9 µL无核酸酶水中稀释，使用高灵敏度芯片在专用DNA分析仪器上检测；大部分cDNA片段长度应在600–800 bp范围内（图2e）。
5. 洗脱完成后，将样品送至测序平台，使用250 bp双端读长或300 bp单端读长在高通量并行测序平台上进行测序。

10. 环形测序数据的生物信息学分析

注意：分析和解释C-seq检测的原始数据需要专用的生物信息学流程。我们的分析所用流程的示意图见图3。可在 https://github.com/LynchLab/MAPGD 下载该流程。

1. 首先，使用 cutadapt¹⁸ 对测序读段进行修剪，以去除接头序列和低质量的碱基识别，质量分数阈值设为 20。
2. 然后，利用适当的算法识别由串联重复 RNA 分子编码的重复序列¹⁸，检测至少 30 个核苷酸长度、且重复单元之间最多允许 2 个错配的重复区域。基于这些重复序列生成一致序列，并记录每个位置的所有碱基识别及其对应的质量分数。
   注意：由于反转录可在环化 RNA 分子的任意位置起始，因此重复序列的起始位置不一定对应于片段化 RNA 分子的 5′-端（下文称为连接点）。因此，该一致序列无法连续地比对到相应的转录组上，这就需要确定连接点的位置。
3. 为确定连接点，使用 BLAST 类比对工具（BLAT）¹⁹ 将一致序列的串联体比对到参考转录组上。
   1. 将两个一致序列串联起来，以确保比对的序列中至少包含一个完整且无中断的原始 RNA 片段序列。然后，将一致序列旋转至预测的连接点位置作为起始点。
4. 使用 TopHat²⁰ 将旋转后的一致序列比对到基因组上，并利用比对结果检测可能被误判为转录错误的单核苷酸多态性（SNP）。
5. 从比对后的旋转一致序列中识别转录错误，并检验候选错误是否通过另外四项检测。
   1. 首先，确保转录错误不与 SNP 重叠（通常要求至少有 20 条读段覆盖特定碱基，且支持替代碱基识别的读段比例不超过 5%）。
   2. 其次，检查一致序列是否来源于至少 3 个串联重复，且每个重复在该位置均识别出相同的碱基对；第三，确保该位置所有质量分数的总和超过 100。
6. 第四项也是最终一项检测：将一致序列以所有可能的组合进行旋转（模拟连接点的所有可能位置），并使用 TopHat 将每种版本比对到参考基因组上。
   注意：如果其中某个旋转后的序列在基因组中找到完全匹配，则该对应的连接点被视为正确连接点，相应的转录错误识别应被拒绝。

结果

与所有大规模并行测序方法一样，每次C-seq实验都会产生庞大且难以处理的数据集。对于初次使用者而言，处理这些数据集可能较为困难；因此，建议所有用户在实验前联系有经验的生物信息学专家。通常情况下，在大多数大规模并行测序平台上，每次运行预计可产生约55–70吉碱基（Gbases）的数据。在本实验方案中，每次运行通常会将12–30个样本进行多重测序，从而使每个样本获得约2–6 Gbases的数据。在从数据集中去除接头序列以及低质量碱基识别（< 20）后，剩余数据量约为原始数据大小的70%。

随后进一步分析这些碱基，以研究RNA片段化和环化的效率，方法是确定所产生的重复序列的长度。大多数重复序列的长度为45–80个碱基（图4A），测序得到的碱基中约有50%属于这些重复序列（图4B）。由于这些碱基大多存在于包含3个或更多重复序列的读段中，...

讨论

本文介绍了一种优化的C-seq文库制备方案，用于检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中的转录错误。该方案相较于现有方法及其他替代技术具有多项优势。

在过去的15年中，已开发出多种依赖荧光素酶^7,8或Cre-Lox重组^3,4,15,21来检测转录错误的报告系统。这些报告系统对研究人员理解转录保真度具有重要价值，因为它们使得能够鉴定出直接调控转录保真性的基因、等位基因和分子机制。然而，这些系统仅能报告人工损伤模板或特...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RiboPure RNA 纯化试剂盒	ThermoFisher	AM1926	总 RNA 纯化
Genelute mRNA 纯化试剂盒	Sigma-Aldrich	MRN70-1KT	mRNA 纯化
无核酸酶水	Ambion	AM9937	洗脱和稀释
Ambion RNase III	ThermoFisher	AM2290	RNA 片段化
T4 RNA 连接酶 1（ssRNA 连接酶）	New England Biolabs	M0204S	RNA 环化
Ribolock	ThermoFisher	EO0381	RNase 抑制剂
SuperScript III 逆转录酶	ThermoFisher	18080044	滚环逆转录
10 mM dNTP 混合液	ThermoFisher	18427013	滚环逆转录
随机六聚体（50 ng/µL）	ThermoFisher	N8080127	滚环逆转录
NEB 第二链合成模块	New England Biolabs	E6111S	第二链合成
NEBNext Ultra DNA 文库制备试剂盒（适用于 Illumina）	New England Biolabs	E7370S	cDNA 文库构建
NEB Next index 引物	NEB	E7335S	多重 PCR 引物
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4061	RNA 和 DNA 样本纯化
DynaMag-2 磁力架	ThermoFisher	12321D	磁珠纯化
AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63881	磁珠纯化
Eppendorf 5424 微型离心机	FisherScientific	05-403-93	离心
INCU-Shaker 10 L	Benchmark Scientific	H1010	细胞培养
T100 梯度 PCR 仪	BIO RAD	1861096	中高温循环条件
PTC-200 梯度 PCR 仪	GMI	8252-30-0001	低温循环条件
RNase Away	Molecular Bioproducts	700S-11	消毒
50 mL 离心管	Corning	430290	无核酸酶
15 mL 离心管	Corning	430052	无核酸酶
Eppendorf 管	USA Scientific	1615-5500	无核酸酶
4200 Tapestation 系统	Agilent	G2991AA	用于 RNA 和单链 DNA 样本质量控制的核苷酸分析仪器
高灵敏度 RNA Screen Tape	Agilent	5067-5579	RNA 和单链 DNA 样本的质量控制
RNA ScreenTape 样本缓冲液	Agilent	5067-5577	RNA 和单链 DNA 样本的质量控制
RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5578	RNA 和单链 DNA 样本的质量控制
2100 Bioanalyzer 仪器	Agilent	G2939BA	双链 DNA 质量控制
高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent	5067-4626	双链 cDNA 样本的质量控制
水浴锅	VWR	462-0244	孵育
NanoDrop 2000/2000C 分光光度计	ThermoFisher	ND-2000C	RNA 浓度测定