利用硅橡胶灌注化合物进行二维X射线血管造影以观察精细血管结构

摘要

本研究介绍了一种简单的二维血管造影方法，通过使用硅橡胶注射化合物和软组织X射线系统来观察精细的血管结构。

摘要

血管造影是研究各个领域中血管结构的重要工具。本研究旨在介绍一种简单的血管造影方法，用于观察未固定新鲜组织的精细血管结构，该方法采用硅橡胶注射化合物结合软组织X射线系统。本研究特别关注重建手术中常用的皮瓣区域。本研究在不同实验条件下，使用Sprague-Dawley大鼠并结合硅橡胶注射化合物进行血管造影。首先，将15 mL MV化合物与15 mL稀释剂混合。然后准备1.5 mL固化剂，并将24G导管插入大鼠的颈总动脉。接着将三通止液夹连接至导管，并在将造影剂与已备好的固化剂混合后立即注入，避免泄漏。最后，待造影剂固化后，取出标本，并使用软组织X射线系统获取血管造影图像。该方法表明，可在短时间内简便地获得显示精细血管结构的高质量血管造影图像。

引言

研究动脉和静脉等血管结构是一个重要的关注领域，尤其在重建外科中。在该领域，皮瓣手术被广泛应用。因此，血管造影成像被积极用于研究皮瓣区域、血管区（angiosome）以及新鲜组织的血液供应¹。具体而言，人们持续致力于观察精细的血管结构，包括穿支血管（从深部血管发出并通向皮肤的血管）和 choke 血管（相邻血管区之间的连接血管）²。这两类血管在穿支皮瓣重建领域具有重要意义，也是本研究的主要关注点^3,4。

血管造影中会使用多种材料。首先是印度墨水，它有助于观察血管的大体解剖结构，但因其具有放射透性，无法获得血管造影图像。更常用的放射不透材料是氧化铅和钡。然而，氧化铅具有显著的毒性，且因其粉末形态，与水混合后使用不便。钡无毒性，但可行性较低，因其使用前必须稀释。这两种放射不透材料均无法通过毛细血管，因此若需分析完整的血管结构，必须分别向动脉和静脉注射。此外，这两种材料在解剖过程中容易发生染料渗漏，因此需与明胶混合使用。氧化铅-明胶和钡-明胶混合物至少需要一天时间才能凝固⁵。^1,6,7

计算机断层扫描（CT）血管造影是另一种广泛应用的方法，有助于观察三维（3D）结构⁸。然而，静脉无法被有效显示⁵。在此成像模式下，除使用特定设备外，难以清晰显示 choke 静脉等精细血管结构。由于需要更昂贵的设备，这可能成为一种劣势，因此并非所有实验室都能使用 CT 血管造影。相比之下，软组织 X 射线系统成本相对较低，且操作更为简便。该系统适用于观察软组织，能够提供比普通 X 射线系统更高质量的软组织图像。尽管软组织 X 射线系统本身无法显示三维图像，但其在清晰显示精细血管结构方面优于 CT 血管造影。因此，我们在许多实验中采用了软组织 X 射线系统，特别是在多种皮瓣模型和基础解剖学研究中^2,9。

最后，使用硅橡胶注射造影剂具有多种优势。由于可制备多种着色剂，该造影剂注射后可呈现可区分的颜色，例如印度墨水。因此，可同时研究大体解剖结构和血管造影图像。它既能通过毛细血管，又能使静脉显影，从而实现对细微血管结构的观察。与明胶混合物不同，硅橡胶注射造影剂可在约15分钟内快速固化，无需任何额外操作步骤。整个流程已在图1的示意图中总结。

方案

所有实验步骤，包括涉及动物受试者的操作，均已获得首尔国立大学医院机构动物护理和使用委员会（IACUC 编号：10-0184）的批准。本方案已针对皮瓣血管系统的研究进行了优化。本示例基于我们先前研究报告中提出的四区域皮瓣模型。

1. 建立皮瓣条件

注意：在大鼠皮瓣模型中，应在肉眼观察评估前 4 至 5 天诱导产生血管变化^6,7。

1. 使用7周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200 - 250 g。
2. 采用异氟烷进行麻醉，诱导浓度为3 - 5%，维持浓度为2 - 2.5%。通过夹趾回缩反射测试确认麻醉深度足够。皮下注射美洛昔康5 mg/kg以缓解疼痛。
3. 使用动物毛发剪和脱毛膏（巯基乙酸，80%）剃除躯干毛发。用10%聚维酮碘溶液准备无菌手术区域，并覆盖无菌手术单以维持整个操作过程中的无菌状态。在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。 所有器械均需保持无菌状态。
4. 建立适当的皮瓣条件。
   1. 从下腹部至背部标记一个周向皮瓣设计，大小为4 × 12 cm。皮瓣中心位于剑突与阴茎之间中点处（图1）。
   2. 使用手术刀沿标记线切开皮肤。
   3. 使用剪刀解剖皮瓣，包括皮肤和肉膜层（panniculus carnosus）。
   4. 在下腹部区域围绕血管蒂[双侧深部阴部环状髂血管（DCI）和双侧浅表下腹壁血管（SIE）]进行解剖，并借助手术放大镜和显微外科器械暴露血管蒂。
   5. 根据实验设计需要，保留或结扎相应血管。
   6. 使用手术刀或剪刀沿背部正中线将皮瓣分开。
   7. 将皮瓣复位至原始位置，并用皮肤缝合钉固定。
   8. 术后连续3天在手术伤口处涂抹外用软膏，并每日口服一次美洛昔康（5 mg/kg）以提供术后镇痛。
   9. 确认大鼠已恢复足够意识，能够维持胸卧位。 将大鼠放回笼中并转移至饲养区域。为每只大鼠佩戴伊丽莎白圈。

2. 仪器的准备

1. 准备一根24G导管和一个三通旋塞阀。
2. 准备蚊式钳、小剪刀、外科手术刀片和手术刀柄。
3. 准备血管造影剂（硅橡胶注射混合物）。
   1. 在无菌标本采集杯中将着色剂与稀释液混合均匀。确保按重量等量配制：每只大鼠（Sprague-Dawley大鼠，200–250 g）使用15 mL着色剂和15 mL MV稀释液。
   2. 在注射前立即加入固化剂，其用量为混合液总重量或体积的5%：每只大鼠（Sprague-Dawley大鼠，200–250 g）加入1.5 mL固化剂。

3. 大鼠动脉制备

1. 使用异氟烷麻醉大鼠（诱导浓度为 3 - 5%，维持浓度为 2 - 2.5%）。 通过足趾夹捏回缩反射试验确认麻醉深度是否足够。
2. 使用动物毛发剪和脱毛膏（巯基乙酸，80%）剃除颈部毛发。 
3. 暴露颈总动脉¹⁰。
   1. 在肩胛骨之间做一条 2 cm 的正中切口。
   2. 使用蚊式钳和钝头剪刀进行更深层的解剖，直至暴露唾液腺复合体。
   3. 牵开唾液腺，并沿纵轴钝性分离肩胛舌骨肌。
   4. 解剖颈总动脉周围组织。
4. 用黑色丝线钩住颈总动脉的头端和尾端并固定。
   1. 在近端缝线处打结，并保持牵拉以维持动脉充盈状态。
   2. 在尾端预备一根丝线，用于固定 24G 导管。

4. 插管

1. 使用24G导管插管已准备好的颈动脉。
2. 结扎尾侧预先打好的结，并注意在注射过程中避免移除导管。
3. 制备固化剂（步骤1.3.2）。
4. 将三通旋塞阀牢固连接至插入的导管。
   1. 使用空注射器施加负压，确认导管内有回流血液。

5. 注射

1. 注入硅橡胶灌注剂，直至眼睛和足部的颜色发生变化。
   ​注意：随着灌注液体的推进，颜色应逐渐改变（每只大鼠的注射量约为 25–30 mL）。
2. 关闭三通阀，并等待灌注剂固化。
   1. 操作时需小心，避免灌注剂污染，尤其是在将注射器从三通阀上取下时。应使用纱布或塑料薄膜等防护屏障，将灌注区域与周围环境隔开。
      警告：由于该化合物具有射线不透性，任何污染都会使血管造影图像的分析变得困难。
   2. 确认心跳和呼吸已停止，随后停止麻醉。
   3. 以残留的灌注剂作为参照，观察其硬化速度（大约需要 15 分钟）。

6. 标本采集

1. 使用手术刀在筋膜层（panniculus carnosus）外侧1 cm处做切口，以避免损伤皮瓣内部的任何血管结构。
2. 沿步骤1.4中已分离的层面（筋膜层下方）进行解剖，使用剪刀切取包含皮瓣及血管蒂的组织（血管结构保留在皮瓣内）。
3. 使用5-0丝线结扎皮瓣的血管蒂，并将皮瓣从身体分离。注意避免损伤血管结构。

7. 采集血管造影图像

1. 用镊子将标本展开，确保其不折叠，并轻轻放置于手术巾上。
2. 拍摄放射影像。
   1. 将放置于胶片暗盒上的标本转移至样品加载区域。
   2. 将软组织X射线系统设置为60 kVp、5 mA，曝光时间为5 s。
3. 在暗室中使用自动显影机显影胶片。
4. 以尽可能高的分辨率扫描胶片。

8. 图像分析^6,7,11

1. 根据血流的连续性和血管直径区分动脉与静脉。
   1. 从蒂动脉的流入端开始，聚焦于待检查的目标血管。
   2. 通过首先打开图像，使用软件测量血管直径。
      1. 点击 直线 按钮，并在比例尺上绘制一条等长的线段。
      2. 打开 分析 | 设置比例尺 菜单，将比例尺的数值输入到 已知距离 栏中。
      3. 点击 直线 按钮，并在需要测量直径的血管上绘制一条线段。
      4. 打开 分析 | 测量 菜单，确认所测线段的 长度。
2. 结合皮瓣存活区域分析血管分布模式。

结果

通过遵循本方案，对Sprague-Dawley大鼠皮瓣的血管化情况进行了观察。根据我们之前的研究报告，在下腹部至背部标记出一个尺寸为4 × 12 cm的环形皮瓣。每个样本均处于不同的血管条件下。

所有皮瓣均以旋髂深动脉（DCIA）和静脉为蒂掀起，随后通过不同部位的动脉进行超供血。第1组为对照组，第2组通过同侧腹壁浅动脉（SIEA）进行超供血，第3组通过对侧SIEA进行超供血，第4组通过对侧DCIA进行超供血。结果发现，各皮瓣的血管造影显示出不同的模式。若以主干血管供血区域为标准将整个皮瓣分为四个区域，则血管造影剂已到达由超供血动脉远端下一个区域的主供血管。扩张的穿支吻合静脉（choke vein）亦被观察到，但在正常皮肤的血管造影中不可见（图2）。

在其他情况下，硅橡胶注射...

讨论

硅橡胶注射造影操作简便，无需昂贵设备，具有多种优势。与患者术前及术中评估相比，利用动物和尸体进行的实验能够提供特定条件下的详细信息，从而实现更广泛且深入的研究。大鼠皮瓣模型对临床医生尤为有价值，因其可在临床应用前观察各种条件下的变化^6,7,11。例如，当对长皮瓣应用增强供血或增强引流技术以缓解远端缺血性坏死时，可预测皮瓣区域的结局；因此，将这些技术应用于临床实践有望提高皮瓣存活率（图2）。在尸体解剖的情况下，可同时进行大体解剖学和血管造影评估，从而最大化利用尸体资源¹²。

硅橡胶注射化合物比其他造影材料更易于操作。主要操作步骤包括预先混合硅橡胶注射化合物与稀释剂，并在注射前立即加入固化剂。与其他成像方法一样，注射过程中需注意避免泄漏。为防止泄漏，我们建议在插管后使用牢固的结扎线以及带导管的三...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-112	白色显色剂
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-117	橙色显色剂
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-120	蓝色显色剂
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-122	黄色显色剂
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-130	红色显色剂
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-132	透明剂
MICROFIL 硅胶注射化合物	Flow Tech Inc.	MV-Diluent	稀释剂
MICROFIL CP-101 铸型腐蚀制备专用材料	Flow Tech Inc.	CP-101	固化剂
SOFTEX X射线胶片摄影检测设备	SOFTEX	CMB-2	软组织X射线系统
胶片	富士胶片	工业X射线胶片（FR 12x16.5cm）
自动显影机	富士胶片	FPM 2800
大鼠			体重200-250 g的Sprague-Dawley大鼠
三通旋塞阀
24号导管
Image J	美国国立卫生研究院		https://imagej.nih.gov/ij/