视网膜冷冻切片、全层铺片及低渗分离血管制备用于微血管周细胞的免疫组织化学可视化

摘要

我们展示了三种不同的组织制备技术，用于免疫组织化学可视化大鼠视网膜微血管周细胞， 即， 冷冻切片、整体封片以及血管网络的低渗分离

摘要

视网膜周细胞在多种眼部疾病中发挥着重要作用。视网膜血管及微血管周细胞的免疫组织化学染色技术是眼科研究的核心内容。选择合适的微血管周细胞可视化方法至关重要。本文描述了使用血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）和神经/胶质抗原2（NG2）抗体，对冷冻切片、整体装片以及低渗分离血管组织中的视网膜微血管周细胞进行免疫组织化学染色的方法。该方法使我们能够比较这三种组织制备方式在视网膜微血管周细胞可视化方面的优势与局限性。冷冻切片可横断显示所有视网膜层次，但仅包含少数偶然的微血管横截面。整体装片可提供整个视网膜血管系统的概览，但微血管的可视化可能存在困难。低渗分离法通过去除神经元细胞实现对整个视网膜血管系统的观察，但该方法会使组织变得极为脆弱。

引言

视网膜周细胞是许多研究实验室关注的重点，因为这些细胞在维持血管系统完整性方面发挥着重要作用。糖尿病性视网膜病变¹、缺血²和青光眼³等病理状态均具有涉及周细胞功能的血管特征。周细胞位于视网膜内层毛细血管丛中。供应内层视网膜的视网膜中央动脉分支形成两层毛细血管丛。内层血管床位于节细胞层与内核层之间。深层血管丛更为致密和复杂，定位于内核层与外核层之间^4,5。此外，视网膜的某些区域还包含第三层血管网络，称为放射状乳头旁毛细血管。这些是位于神经纤维层中的长而直的毛细血管，彼此之间或与其他两个血管丛之间极少发生吻合⁶。在毛细血管壁内，周细胞嵌入基底膜中，并排列于血管内皮细胞的管外侧。

迄今为止，尚无特异性的生物学标志物能够将这些周细胞与其他血管细胞明确区分开来。血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）和神经/胶质抗原2（NG2）是常用的标志物，二者均在周细胞上表达，但也存在于其他血管细胞中。此外，由于周细胞存在不同亚群，其形态和蛋白质表达具有异质性，进一步增加了周细胞鉴定的复杂性⁷目前，最可靠的鉴定方法依赖于多种蛋白标志物以及周细胞在血....

方案

该方案在成年雄性白化大鼠上进行了优化和验证。所有实验操作均遵循《ARVO 视觉与眼科研究中动物使用声明》中的相关规定。动物通过二氧化碳安乐死后，再进行颈椎脱位处死。

1. 大鼠视网膜组织制备

1. 冷冻切片
   1. 用手术刀在大鼠眼睑的后部和前部制作约 0.5 cm 的切口。
      1. 可选：使用电灼器在内眼角处标记眼球，以便在包埋过程中统一眼球方向，并允许通过视神经进行垂直冷冻切片。
   2. 用镊子夹住眼球并小心向一侧倾斜，以暴露周围组织。使用解剖剪在结缔组织和肌肉组织中进行剪切，摘除眼球。
      警告：不要用力牵拉眼球，因为对视神经施加过大压力可能导致视网膜脱离。
   3. 将眼球短暂放入磷酸盐缓冲液（PBS）中含 4% 甲醛的溶液中固定，然后用手术刀尖轻轻施压，在角膜缘处打一个小孔。
   4. 在显微镜下，沿角膜缘用解剖剪剪开以去除角膜，并用镊子取出晶状体，随后将眼球浸入 PBS 中含 4% 甲醛的溶液中固定 2–4 小时。
   5. 依次用含 10% 蔗糖和 25% 蔗糖的 Sörensen 磷酸盐缓冲液冲洗。
   6. 将组织包埋于 Yazulla 包埋剂中，该试剂由 3% 猪皮明胶和 30% 鸡蛋清白蛋白配制而成。
      注意：此处可暂停实验流程，将组织储存于 -20....

结果

成功的实验方案提供了三种不同的视网膜制备方法，用于观察微血管周细胞。这些方法均利用PDGFRβ与NG2免疫反应性的共定位，以及周细胞环绕毛细血管内皮的独特位置来进行鉴定。

通过冷冻切片，神经元层可通过DAPI标记细胞核的荧光密度进行识别，而内层和深层毛细血管丛中含有表达PDGFRβ和NG2免疫反应性的周细胞（图1）。周细胞在血管壁中的独特位置可表现为血管周边呈环形或马蹄形的免疫反应信号（图1，箭头），或偶尔见于纵向切开的血管（图1，箭头所示）。

在成年大鼠全层标本中成功可视化微血管周细胞具有挑战性¹⁴

讨论

我们介绍了三种可用于研究视网膜微血管周细胞的视网膜制备技术。下文对每种方法进行了比较，并强调了各实验方案中的关键步骤。

通过冷冻切片技术，视网膜被切成矢状切面，因此可以从同一只视网膜中获得多个样本。该方法产生的多个切片使其成为抗体特异性验证和滴定测试的理想选择，有助于避免不必要的动物牺牲。制备过程对获得良好结果至关重要。在解剖眼球时，关键是要避免牵拉眼球，而应切断眼球周围的所有肌肉。若施加外力，可能导致视网膜脱离。由于眼杯较薄，固定时间不宜过长。使用含4%多聚甲醛的PBS溶液浸渍固定2–4小时即可。若固定时间过长，可能破坏目标抗原。为了获得最佳的免疫染色效果，每个切片必须尽可能平整地贴附在载玻片上。由于切片中仅包含少量偶然出现的微血管横切面，该组织制备技术只能间断显示微血管结构。因此，该方法不适用于整体血管架构研究以及周细胞的定量分析。

整体血管网络可在整体封片后进行染色，以提供血管系统的概览。掌握该技术后，这将是一种快速的组织制备方法，所需工作量相对较少。然而，有几个关键点需要特别注意。视网膜组织脆弱，必须小心操作，避免撕裂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	G2625-500G
鸡卵清白蛋白	Sigma-Aldrich	A5253-500G
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNAse）I	Sigma-Aldrich	D5025-15KU	溶于 0.15 M NaCl
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	0332-100G
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121, lot 129348
兔抗 PDGFRβ	Santa Cruz	sc-432	1:100
小鼠抗 NG2	Abcam	ab50009	1:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗兔 IgG	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	1:100
荧光素（FITC）AffiniPure 驴抗小鼠 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	715-095-151	1:100
Cy2 AffiniPure 驴抗兔 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	711-225-152	1:100
Cy3 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	1:100
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	溶于 DMSO
抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200
Nunc Lab-Tek II 4 孔腔室载玻片	Thermo Fisher Scientific	154526