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方法文章

视网膜冷冻切片、全层铺片及低渗分离血管制备用于微血管周细胞的免疫组织化学可视化

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DOI：

10.3791/57733

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2018年10月7日

 ,  , 
1Department of Clinical Experimental Research, Glostrup Research Institute, 2Department of Clinical Sciences, Division of Experimental Vascular Research, Lund University

本文内容

摘要

我们展示了三种不同的组织制备技术，用于免疫组织化学可视化大鼠视网膜微血管周细胞， 即， 冷冻切片、整体封片以及血管网络的低渗分离

摘要

视网膜周细胞在多种眼部疾病中发挥着重要作用。视网膜血管及微血管周细胞的免疫组织化学染色技术是眼科研究的核心内容。选择合适的微血管周细胞可视化方法至关重要。本文描述了使用血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）和神经/胶质抗原2（NG2）抗体，对冷冻切片、整体装片以及低渗分离血管组织中的视网膜微血管周细胞进行免疫组织化学染色的方法。该方法使我们能够比较这三种组织制备方式在视网膜微血管周细胞可视化方面的优势与局限性。冷冻切片可横断显示所有视网膜层次，但仅包含少数偶然的微血管横截面。整体装片可提供整个视网膜血管系统的概览，但微血管的可视化可能存在困难。低渗分离法通过去除神经元细胞实现对整个视网膜血管系统的观察，但该方法会使组织变得极为脆弱。

引言

视网膜周细胞是许多研究实验室关注的重点，因为这些细胞在维持血管系统完整性方面发挥着重要作用。糖尿病性视网膜病变1、缺血2和青光眼3等病理状态均具有涉及周细胞功能的血管特征。周细胞位于视网膜内层毛细血管丛中。供应内层视网膜的视网膜中央动脉分支形成两层毛细血管丛。内层血管床位于节细胞层与内核层之间。深层血管丛更为致密和复杂，定位于内核层与外核层之间4,5。此外，视网膜的某些区域还包含第三层血管网络，称为放射状乳头旁毛细血管。这些是位于神经纤维层中的长而直的毛细血管，彼此之间或与其他两个血管丛之间极少发生吻合6。在毛细血管壁内，周细胞嵌入基底膜中，并排列于血管内皮细胞的管外侧。

迄今为止，尚无特异性的生物学标志物能够将这些周细胞与其他血管细胞明确区分开来。血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）和神经/胶质抗原2（NG2）是常用的标志物，二者均在周细胞上表达，但也存在于其他血管细胞中。此外，由于周细胞存在不同亚群，其形态和蛋白质表达具有异质性，进一步增加了周细胞鉴定的复杂性7目前，最可靠的鉴定方法依赖于多种蛋白标志物以及周细胞在血管壁中的特征性定位。本文展示了三种不同的组织制备技术，用于大鼠视网膜微血管周细胞的免疫组织化学PDGFRβ/NG2染色， 即冷冻切片、整体封片以及血管网络的低渗分离

使用冷冻切片时，视网膜和巩膜会沿视神经进行切割。这使得所有神经元的分层结构均可被观察到。视网膜明显的十层结构表现为交替排列的核层与轴突/树突结构，可通过苏木精/伊红染色或荧光核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行可视化8。各层之间的代谢需求存在差异9，因此该方法可用于测定特定层的厚度或完全缺失情况（例如，视网膜神经节细胞的丢失是视网膜缺血的标志性特征之一10,11）。血管系统在视网膜横切面上清晰可见，从而可以分别研究各视网膜层内的毛细血管丛12,13。

传统上，对视网膜血管网络的研究通常在视网膜全层铺片上进行。通过这种组织制备方法，将视网膜切割并展平为花朵状结构。该方法是一种相对快速的组织制备技术，能够清晰显示视网膜血管的整体架构，因此常用于研究小鼠视网膜中的新生血管形成。已有研究报道，在新生小鼠和大鼠发育期的视网膜全层铺片中，也可成功实现微血管系统的可视化14,15,16,17,18,19。这些研究表明，与新生期视网膜相比，成年视网膜中周细胞活性更为显著，且毛细血管无灌注区域更大14。

另一种可视化方法是在低渗分离后观察视网膜微血管系统。该组织制备技术可使视网膜血管和毛细血管脱离神经元细胞。这种对分离的视网膜血管网络进行二维成像的方法通常在视网膜胰蛋白酶消化后进行20，用于评估糖尿病视网膜病变中的血管异常，包括周细胞丢失和毛细血管退化20,21,22。低渗分离法可用于研究视网膜血管基因和蛋白的调控反应，已有研究采用RT-PCR和蛋白质印迹法（western blotting）进行分析23,24,25。本文提供一种针对低渗分离所得视网膜血管系统的游离漂浮免疫组织化学染色方案，作为胰蛋白酶消化法的替代方法，用于检测微血管周细胞。

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方案

该方案在成年雄性白化大鼠上进行了优化和验证。所有实验操作均遵循《ARVO 视觉与眼科研究中动物使用声明》中的相关规定。动物通过二氧化碳安乐死后，再进行颈椎脱位处死。

1. 大鼠视网膜组织制备

  1. 冷冻切片
    1. 用手术刀在大鼠眼睑的后部和前部制作约 0.5 cm 的切口。
      1. 可选：使用电灼器在内眼角处标记眼球，以便在包埋过程中统一眼球方向，并允许通过视神经进行垂直冷冻切片。
    2. 用镊子夹住眼球并小心向一侧倾斜，以暴露周围组织。使用解剖剪在结缔组织和肌肉组织中进行剪切，摘除眼球。
      警告：不要用力牵拉眼球，因为对视神经施加过大压力可能导致视网膜脱离。
    3. 将眼球短暂放入磷酸盐缓冲液（PBS）中含 4% 甲醛的溶液中固定，然后用手术刀尖轻轻施压，在角膜缘处打一个小孔。
    4. 在显微镜下，沿角膜缘用解剖剪剪开以去除角膜，并用镊子取出晶状体，随后将眼球浸入 PBS 中含 4% 甲醛的溶液中固定 2–4 小时。
    5. 依次用含 10% 蔗糖和 25% 蔗糖的 Sörensen 磷酸盐缓冲液冲洗。
    6. 将组织包埋于 Yazulla 包埋剂中，该试剂由 3% 猪皮明胶和 30% 鸡蛋清白蛋白配制而成。
      注意：此处可暂停实验流程，将组织储存于 -20 °C。
  2. 整体装片
    1. 用手术刀在大鼠眼睑的后部和前部制作约 0.5 cm 的切口。
    2. 用镊子夹住眼球并小心向一侧倾斜，以暴露周围组织。使用解剖剪在结缔组织和肌肉组织中进行剪切，摘除眼球。
      警告：不要用力牵拉眼球，因为对视神经施加过大压力可能导致视网膜脱离。
    3. 将眼球短暂放入 PBS 中含 4% 甲醛的溶液中固定，然后用手术刀尖轻轻施压，在角膜缘处打一个小孔。
    4. 在显微镜下，沿角膜缘用解剖剪剪开以去除角膜，并用镊子取出晶状体。
    5. 用镊子从视网膜色素上皮层向视神经方向轻轻分离视网膜，采用小幅张开动作，避免造成大面积撕裂。
    6. 用解剖剪在视神经处将视网膜完全游离，并从视网膜周边向视盘方向做四个几毫米长的切口。
    7. 将视网膜展平于载玻片上，室温干燥 5–10 分钟。
    8. 通过滴加甲醛溶液对视网膜进行 20–30 分钟的 4% 甲醛固定。
      警告：不要直接将甲醛滴在视网膜表面，以免其从玻片上脱落。
    9. 用 PBS 冲洗。为获得最佳效果，建议冲洗后立即进行免疫染色。
  3. 低渗分离法
    1. 用手术刀在大鼠眼睑的后部和前部制作约 0.5 cm 的切口。
    2. 用镊子夹住眼球并小心向一侧倾斜，以暴露周围组织。使用解剖剪在结缔组织和肌肉组织中进行剪切，摘除眼球。
      警告：不要用力牵拉眼球，因为对视神经施加过大压力可能导致视网膜脱离。
    3. 用手术刀尖轻轻施压，在角膜缘处打一个小孔。
    4. 在显微镜下，沿角膜缘用解剖剪剪开以去除角膜，并用镊子取出晶状体。
    5. 用镊子从视网膜色素上皮层向视盘方向分离视网膜，采用小幅张开动作，避免造成大面积撕裂。
    6. 用解剖剪在视神经处将视网膜游离，将视网膜放入 24 孔板中的 1 mL 去离子水中，在室温下以 200 rpm 转速、1.5 mm 振动行程振荡 1 小时。
      注意：此后视网膜边缘将变得不那么清晰。
    7. 加入 200 U 的 DNase 1，以解离裂解细胞碎片与视网膜血管系统，并在室温下继续振荡 30 分钟。
      注意：孔中可能开始出现碎片沉淀。
    8. 用去离子水在 150–300 rpm 振荡条件下至少冲洗 3 次，每次 5 分钟，以去除神经元细胞碎片。每次冲洗后视网膜应变得更加透明，表明神经元细胞碎片正在被清除。
      1. 使用深色背景观察 24 孔板，以便清晰看到透明的分离视网膜血管系统。
      2. （可选）： 若此时血管系统仍未完全脱离神经元层（呈半透明状态），可增加冲洗次数、提高振荡速度，或使用移液器将液体吹打至血管系统表面。
        警告：上述任一可选步骤均可能损伤血管系统。
    9. 在室温下用 PBS 中含 4% 多聚甲醛的溶液固定 10 分钟，随后用 PBS 冲洗 3 次。
      注意：此处可暂停实验流程，将组织储存于 4 °C。

2. 免疫组织化学

  1. 冷冻切片染色
    1. 将明胶包埋的视网膜切成10 µm厚的冷冻切片，切片方向为通过视神经的垂直面，将切片贴附于载玻片上并自然干燥（至少1小时）。
    2. 将载玻片浸入含0.25% Triton X-100的PBS（PBS-T）中，孵育15分钟。
    3. 将PDGFRβ一抗（1:100稀释）和NG2一抗（1:500稀释）用PBS-T + 1% BSA稀释后滴加至冷冻切片上，置于湿盒中4 °C孵育过夜。
    4. 将载玻片在PBS-T中浸洗两次，每次15分钟，然后滴加用含3% BSA的PBS-T稀释的二抗：抗小鼠Alexa Fluor 594标记抗体（1:100）和抗兔FITC标记抗体（1:100）。
    5. 室温避光孵育1小时。
    6. 用PBS-T漂洗载玻片两次，每次15分钟。
      注意：可选步骤：对于双重或三重免疫荧光染色，可通过分别重复步骤2.1.3至2.1.6两次或三次进行连续染色。
    7. 用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。
  2. 全层组织染色
    1. 向全层组织滴加PBS-T，室温孵育15分钟。
    2. 吸去液体，滴加用PBS-T + 1% BSA稀释的一抗（PDGFRβ 1:100，NG2 1:500），置于湿盒中4 °C孵育过夜。
    3. 吸去液体，滴加PBS-T漂洗载玻片两次，每次15分钟。
    4. 吸去液体，滴加用含3% BSA的PBS-T稀释的二抗：抗兔Cy2标记抗体（1:100）和抗鼠Cy3标记抗体（1:100），置于湿盒中室温避光孵育1小时。
    5. 吸去液体，滴加PBS-T在避光条件下漂洗两次，每次15分钟。
      注意：可选步骤：对于双重或三重免疫荧光染色，可通过分别重复步骤2.2.2至2.2.5两次或三次进行连续染色。
    6. 用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。
  3. 低渗法分离血管系统的染色
    1. 用500 µL/孔含10%驴血清的PBS在室温下以100 rpm振荡封闭低渗法分离的血管系统1小时。
    2. 在室温下以100 rpm振荡，用600 µL/孔含10%驴血清的PBS稀释的一抗（PDGFRβ 1:100，NG2 1:500）孵育过夜。
    3. 用PBS漂洗视网膜血管网络3次，每次5分钟；然后在含10%驴血清的PBS中加入二抗（抗小鼠Alexa Fluor 594标记抗体1:100，抗兔FITC标记抗体1:100），于室温避光条件下以100 rpm振荡孵育1小时。
    4. 用PBS-T漂洗5分钟，随后在含0.2 ng/mL DAPI的PBS-T中孵育15分钟，再于避光条件下用PBS-T漂洗3次，每次5分钟。
    5. 剪去塑料巴斯德吸管的尖端，用PBS-T润湿，用于将视网膜血管网络转移至4孔玻璃腔室载玻片中。
      注意：润湿步骤至关重要，可防止血管网络黏附在巴斯德吸管内壁。
    6. 展开视网膜血管网络。避免使用镊子接触血管网络，以防血管缠绕。
      注意：可通过来回倾斜腔室载玻片或向血管网络表面滴加液体并吸液的方式完成展开。
    7. 吸去孔内液体，液体的表面张力将使血管网络展平并贴附于载玻片底部。
    8. 在移除腔室载玻片上的塑料腔室前，需在显微镜下确认血管网络已正确展开。
    9. 用抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。

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结果

成功的实验方案提供了三种不同的视网膜制备方法，用于观察微血管周细胞。这些方法均利用PDGFRβ与NG2免疫反应性的共定位，以及周细胞环绕毛细血管内皮的独特位置来进行鉴定。

通过冷冻切片，神经元层可通过DAPI标记细胞核的荧光密度进行识别，而内层和深层毛细血管丛中含有表达PDGFRβ和NG2免疫反应性的周细胞（图1）。周细胞在血管壁中的独特位置可表现为血管周边呈环形或马蹄形的免疫反应信号（图1，箭头），或偶尔见于纵向切开的血管（图1，箭头所示）。

在成年大鼠全层标本中成功可视化微血管周细胞具有挑战性14

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讨论

我们介绍了三种可用于研究视网膜微血管周细胞的视网膜制备技术。下文对每种方法进行了比较，并强调了各实验方案中的关键步骤。

通过冷冻切片技术，视网膜被切成矢状切面，因此可以从同一只视网膜中获得多个样本。该方法产生的多个切片使其成为抗体特异性验证和滴定测试的理想选择，有助于避免不必要的动物牺牲。制备过程对获得良好结果至关重要。在解剖眼球时，关键是要避免牵拉眼球，而应切断眼球周围的所有肌肉。若施加外力，可能导致视网膜脱离。由于眼杯较薄，固定时间不宜过长。使用含4%多聚甲醛的PBS溶液浸渍固定2–4小时即可。若固定时间过长，可能破坏目标抗原。为了获得最佳的免疫染色效果，每个切片必须尽可能平整地贴附在载玻片上。由于切片中仅包含少量偶然出现的微血管横切面，该组织制备技术只能间断显示微血管结构。因此，该方法不适用于整体血管架构研究以及周细胞的定量分析。

整体血管网络可在整体封片后进行染色，以提供血管系统的概览。掌握该技术后，这将是一种快速的组织制备方法，所需工作量相对较少。然而，有几个关键点需要特别注意。视网膜组织脆弱，必须小心操作，避免撕裂...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

该研究由丹麦伦德贝克基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
猪皮明胶Sigma-AldrichG2625-500G
鸡卵清白蛋白Sigma-AldrichA5253-500G
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNAse）ISigma-AldrichD5025-15KU溶于 0.15 M NaCl
牛血清白蛋白（BSA）VWR0332-100G
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-121, lot 129348
兔抗 PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
小鼠抗 NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗兔 IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
荧光素（FITC）AffiniPure 驴抗小鼠 IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure 驴抗兔 IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Sigma-AldrichD9542-1MG溶于 DMSO
抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1000
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1200
Nunc Lab-Tek II 4 孔腔室载玻片Thermo Fisher Scientific154526

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