评估线粒体功能在癌症相关性疲劳中的作用

摘要

我们的目标是开发一种实用的方案，用于评估癌症患者疲劳相关的线粒体功能障碍。该创新性方案针对临床应用进行了优化，仅需常规静脉采血和基本的实验室操作。

摘要

疲劳是一种常见且致残的病症，影响着大多数癌症患者。迄今为止，疲劳的特征仍不明确，尚无能够客观评估其严重程度的诊断检测方法。本文介绍了一种优化的方法，用于评估从疲劳癌症患者采集的外周血单个核细胞（PBMC）的线粒体功能。利用紧凑型细胞外通量分析系统，并依次注射呼吸抑制剂，我们通过测量基础线粒体呼吸、备用呼吸能力以及能量表型来考察PBMC的线粒体功能状态，其中能量表型描述了细胞应对压力时偏好的能量代谢途径。在临床环境中，通过标准静脉采血即可方便地获取新鲜PBMC。本方案所述的整个检测过程可在4小时内完成，无需复杂的生化技术。此外，我们还介绍了一种获得可重复数据所必需的标准化方法。该简便的实验流程与标准化方法使得可对同一患者进行多次样本采集，并生成可在不同时间点之间比较的可重复数据，从而用于评估潜在治疗效果。

引言

疲劳是一种常见且令人痛苦的状况，会对癌症患者的生活质量产生负面影响¹。迄今为止，癌症相关疲劳仍缺乏明确的定义，且仅依赖患者的主观描述进行判断²。因此，迫切需要建立一种易于推广的实验室诊断方法，以便在临床环境中客观地评估疲劳状态^3,4。

已有多种潜在机制被提出可导致疲劳，其中包括线粒体功能障碍⁵。线粒体是细胞的能量工厂，通过氧化磷酸化提供细胞95%的能量需求，并在钙信号传导、细胞凋亡、免疫信号以及调控其他细胞内信号事件中发挥重要作用⁶。因此，线粒体生物能量学功能受损以及能量生成缺陷可能与疲劳的发生有关。支持这一假说的证据来自先前的研究，这些研究已在慢性疲劳综合征患者中观察到线粒体DNA的突变⁷。尽管目前尚不清楚疲劳的病理生理学起源位于中枢神经系统还是外周组织（如骨骼肌）^8,9，但目前仍缺乏一种直接方法，用于在活的、进行呼吸作用的细胞中准确评估与疲劳相关的线粒体功能障碍。

方案

本研究（NCT00852111）已获得马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会（IRB）批准。纳入本研究的受试者为情绪稳定的男性，年龄在18岁或以上，经诊断患有非转移性前列腺癌，无论是否曾接受过前列腺切除术，并计划接受外照射放射治疗（EBRT）。若潜在受试者在过去五年内患有可导致显著疲劳的进行性疾病、精神疾病，或存在未纠正的甲状腺功能减退或贫血，或患有第二种恶性肿瘤，则被排除在外。使用镇静剂、类固醇或非甾体抗炎药物的个体也被排除。健康对照组的血液样本来自NIH输血医学部，在IRB批准的另一项研究方案（NCT00001846）下招募的健康献血者。所有受试者均在美国国立卫生研究院的马格努森临床研究中心招募。在参与研究前，所有受试者均已签署书面知情同意书。

1. 线粒体功能检测的准备工作（实验第1天）

1. 水合传感器芯片（参见 材料表；大约耗时：5 分钟）。
   1. 从包装中取出传感器芯片。向工具板的每个孔中加入 200 μL 校准液，然后向每个外槽中加入 400 μL 校准液。
   2. 将传感器板放回已加入校准液的工具板中，在不含 CO₂ 的 37 °C 培养箱中过夜水合。
      注意：传感器芯片的水合时间最少为 4 小时，最长不超过 72 小时。

2.....

结果

线粒体应激测试依赖于依次注射多种呼吸抑制剂后测量耗氧速率（OCR），以绘制完整的线粒体功能谱。每次药物注射后的OCR测量值可用于计算以下与线粒体健康相关的参数： 基础耗氧率 在给予任何药物注射之前，首先测量氧气消耗率，以评估满足静息状态下ATP需求所需的氧耗水平。基础呼吸（Basal respiration）通过从寡霉素注射前的基线氧消耗率（OCR）中减去非线粒体呼吸速率计算得出。随后，注射寡霉素以抑制ATP合酶（复合体V）的质子通道。寡霉素注射后OCR的下降值代表 ATP 生成相关的氧气消耗随后使用离子载体FCCP（羰基氰化-4-三氟甲氧基苯腙）破坏质子梯度和线粒体膜电位，以诱导最大氧消耗。 最大呼吸速率 通过从FCCP注射后的最大OCR中减去非线粒体呼吸来计算。 备用呼吸能力 最大呼吸与基础呼吸之间的差值。最后，同时注射抗霉素A（复合体III抑制剂）和鱼藤酮（复合体I抑制剂），以关闭电子传递链。根据定义， 非线粒体呼吸.......

讨论

癌症患者的疲劳是一种致残性状况，目前尚无明确定义或特征描述¹。疲劳的诊断完全依赖于患者的主观报告，且目前尚无针对该状况的诊断标准或治疗方法，这主要归因于对其病理生物学机制缺乏理解²。在已提出的多种癌症患者疲劳发生机制中，线粒体功能障碍是最具治疗靶向潜力的通路之一。因此，我们开发了一种快速且实用的方法，用于检测临床样本中的线粒体功能，可用于主动识别那些有风险发生与癌症治疗相关毒性（包括疲劳）的患者，从而及早实施干预管理。

细胞外通量技术结合呼吸抑制剂的顺序注射可用于评估线粒体功能状态，已被广泛应用于 体外 和 体内 模型^19,20,21我们拓展了现有研究，开发出一种优化后可用于临床样本中线粒体功能障碍检测的方法。本研究的优势在于使用了小型细胞外通量分析仪。如我们所展示的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CPT 单个核细胞制备管	BD Biosciences	362761	用于静脉采血后分离外周血单个核细胞（PBMCs）
RPMI-1640	Corning	10-040	用于配制 PBMCs 的生长培养基
胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV	用于配制 PBMCs 的生长培养基
青霉素/链霉素	ThermoFisher	15140122	用于配制 PBMCs 的生长培养基
Cell-Tak	Corning	354240	细胞和组织粘附溶液；使悬浮细胞能够贴附于表面
Seahorse XF 校准液	Agilent	103059-000	用于水合传感器微孔板
XFp Fluxpak（微型板和传感器微孔板）	Agilent	103022-100	包含 XFp 细胞培养微型板和传感器微孔板
XF 基础培养基	Agilent	103335-100	用于配制 XF 检测培养基
45% 细胞培养用 D-(+)-葡萄糖溶液	Corning	25-037-CI	用于配制 XF 检测培养基
丙酮酸钠溶液	Corning	25-000-CI	用于配制 XF 检测培养基
L-谷氨酰胺溶液	ThermoFisher	25030081	用于配制 XF 检测培养基
Seahorse XFp 线粒体应激检测试剂盒	Agilent	103010-100	包含寡霉素、FCCP、抗霉素 A/鱼藤酮
CyQUANT Direct 细胞增殖检测试剂盒	ThermoFisher	C35011	用于活细胞定量及数据归一化
Seahorse XFp 分析仪	Agilent	S7802AEA	用于检测活细胞中的线粒体功能
Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪（或任何可定量微孔板中荧光细胞的仪器）	BioTek	BTCYT5PV	用于活细胞定量及数据归一化