线粒体功能在癌症相关疲劳中的作用评价

摘要

我们的目标是制定一个实用的协议, 以评估线粒体功能障碍与疲劳相关的癌症患者。这种创新的协议是优化的临床使用只涉及标准放血和基本的实验室程序。

摘要

疲劳是影响大多数癌症患者的常见和衰弱的条件。到目前为止, 疲劳仍然很低的特点, 没有诊断测试, 客观地测量这种情况的严重性。在这里, 我们描述了一个最优化的方法来评估 PBMCs 的线粒体功能收集从疲劳的癌症患者。利用紧凑的胞外通量系统和顺序注射呼吸抑制剂, 我们通过测量基底线粒体呼吸、剩余呼吸能力和能量表型来检查 PBMC 线粒体功能状态, 描述应对压力的首选能量通路。新鲜 PBMCs 是现成的临床设置使用标准放血。本议定书所描述的整个化验方法在不到4小时内就可以完成, 而不需要复杂的生化技术。此外, 我们还描述了获取可重现数据所需的规范化方法。所提出的简单程序和规范化方法允许重复样本收集从同一病人和生成可重复的数据, 可以比较时间点, 以评估潜在的治疗效果。

引言

疲劳是一种普遍和令人痛心的情况, 对癌症患者的生活质量有负面影响¹。到目前为止, 癌症疲劳的定义仍然很差, 仅依靠患者的主观报告²。因此, 迫切需要确定一个易于适应的诊断实验室测试, 客观地描述疲劳的临床设置^3,4。

许多潜在的机制, 包括线粒体功能障碍, 已被建议导致疲劳的⁵。线粒体是发电站的细胞器, 通过氧化磷酸化提供95% 的蜂窝能量需求, 并在钙信号、凋亡、免疫信号和调节其他细胞内信号事件中发挥重要作用⁶.因此, 线粒体生物能学受损和能源生产缺陷可能导致疲劳。支持这个假说, 以前的研究观察了线粒体 DNA 在慢性疲劳综合征患者中的突变⁷。尽管目前尚不清楚疲劳的病理生理学起源是否存在于中枢神经系统或周边组织中, 例如骨骼肌^8,9, 当前还没有直接的方法来准确评估线粒体功能障碍与活着的 respiring 细胞的疲劳有关。

利用外周血单个核细胞 (P....

方案

目前的研究 (NCT00852111) 得到了马里兰国家卫生研究院 (NIH) 机构审查委员会的批准。参加这项研究的参与者为18岁或以上的 euthymic 男性, 他们被诊断为无转移性前列腺癌, 有或没有事先前列腺切除术, 并计划接受外照射治疗 (外照射)。潜在的参与者被排除, 如果他们有一个渐进性疾病, 可能导致严重的疲劳, 在过去五年的精神疾病, 有未矫正甲状腺功能减退或贫血, 或有第二次恶性肿瘤。使用镇静剂、类固醇或非甾体抗炎药物的个体也被排除在外。健康的对照血液样本是在 NIH 批准的协议 (NCT00001846) 下由健康的捐赠者在国立卫生研究院输血医学部门获得的。所有参与者都在 NIH 的马格努森临床研究中心招聘。在学习参与之前获得了书面知情同意书。

1. 线粒体功能测量准备 (实验1天)

1. 水合物传感器墨盒 (请参阅材料表; 大约持续时间: 5 分钟)。
   1. 从包中卸下传感器墨盒。添加 200 ul Calibrant 解决方案的每个井的公用事业板块, 然后填补每个护城河与 400 ul Calibrant 解决方案。
   2. 将传感器板返回到实用新型板上, 现在有 Calibrant 解决方案。将墨盒在非 CO₂ 37 °c 孵化器过夜。
      注: 传感器墨盒需水合至少4小时, 最大可达72小时。

结果

在对不同的呼吸抑制剂进行序贯注射后, 图面应力测试依赖于测量氧气消耗率 (OCR) 来映射一个完整的线粒体剖面。每种药物注射后的 OCR 测量可用于计算以下与线粒体健康相关的参数:基底 OCR首先在任何药物注射前测量, 以评估满足静止水平 ATP 需求所需的氧气消耗。基础呼吸是通过在寡霉素注射液前减去基线 OCR 的非线粒体呼吸率来计算的。其次, 寡霉素被注射来抑制 ATP 合成酶 (复杂 V) 的质子通道。寡霉素注射后的 OCR 随后下降表示与 ATP 生产相关的氧气消耗量。FCCP (羰基氰化物 4-[三氟甲氧基] 苯腙), 一个载体用来扰乱质子梯度和线粒体膜电位, 然后被用来引出最大的氧气消耗。最大呼吸的计算方法是从 FCCP 注射后的最大 OCR 中减去非线粒体呼吸。备用呼吸容量是最大和基本呼吸的区别。最后, antimycin A (复合 III 抑制剂) 和鱼藤酮 (复合 I 抑制剂) 被注射在同一时间关闭电子传输链。根据定义.......

讨论

癌症患者的疲劳是一个虚弱的状况, 没有很好的定义或特征¹。疲劳诊断完全依赖于主观报告, 目前还没有诊断标准或治疗, 这主要是由于在其病理²中缺乏了解。在癌症患者所提出的疲劳机制中, 线粒体功能受损是治疗多弹头的最主要途径之一。因此, 我们开发了一种快速实用的方法来测量临床样品中的线粒体功能, 可用于主动识别患癌症治疗相关毒性包括疲劳的患者, 使早期可以建立管理。

细胞外通量技术结合序贯注射呼吸抑制剂, 可以评估线粒体功能状态, 并已用于体外和体内模型^{19, 20,21}。我们扩大了现有的工作机构, 并制定了一个方法, 以检查线粒体功能障碍的临床标本。本研究的优点是利用了紧凑的胞外通量分析仪。正如我们已经表明, 实验的时间是关键后, 从人类血液中分离新鲜 PBMCs。虽然.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CPT 单核细胞制备管	BD Biosciences 362761		用于放血后分离PBMC
RPMI-1640	康宁	10-040	用于制备 PBMC 生长培养基
牛血清 （FBS）康	宁	35-010-CV	用于制备 PBMC
生长培养基 青霉素/链霉素	ThermoFisher	15140122	用于制备 PBMC 生长培养基
Cell-Tak	Corning	354240	细胞和组织胶粘剂溶液;允许悬浮细胞粘附在表面
Seahorse XF 校准液	Agilent	103059-000	用于水合小柱
XFp Fluxpak（迷你板和传感器小柱）	Agilent	103022-100	包含 XFp 细胞培养小板和传感器小柱
XF 基础培养基	Agilent	103335-100	用于制备 XF 分析培养基
45% 细胞培养物 D-（+）-葡萄糖溶液	康宁	25-037-CI	用于制备 XF检测培养基
丙酮酸钠溶液	Corning	25-000-CI	用于制备 XF 检测培养基
L-谷氨酰胺溶液	ThermoFisher	25030081	用于制备 XF 检测培养基
Seahorse XFp 线粒体应激检测试剂盒	Agilent	103010-100	含有寡霉素、FCCP、抗霉素 A/鱼藤酮
CyQUANT 直接细胞增殖检测	ThermoFisher	C35011	用于活细胞定量和数据归一化
Seahorse XFp 分析仪	Agilent	S7802AEA	用于测量活细胞中的线粒体功能
Cytation 5 Cell Imaging 多功能微孔板检测仪（或任何可以定量板中荧光细胞的仪器）	BioTek	BTCYT5PV	用于活细胞定量和数据归一化