线粒体功能在癌症相关疲劳中的作用评价

摘要

我们的目标是制定一个实用的协议, 以评估线粒体功能障碍与疲劳相关的癌症患者。这种创新的协议是优化的临床使用只涉及标准放血和基本的实验室程序。

摘要

疲劳是影响大多数癌症患者的常见和衰弱的条件。到目前为止, 疲劳仍然很低的特点, 没有诊断测试, 客观地测量这种情况的严重性。在这里, 我们描述了一个最优化的方法来评估 PBMCs 的线粒体功能收集从疲劳的癌症患者。利用紧凑的胞外通量系统和顺序注射呼吸抑制剂, 我们通过测量基底线粒体呼吸、剩余呼吸能力和能量表型来检查 PBMC 线粒体功能状态, 描述应对压力的首选能量通路。新鲜 PBMCs 是现成的临床设置使用标准放血。本议定书所描述的整个化验方法在不到4小时内就可以完成, 而不需要复杂的生化技术。此外, 我们还描述了获取可重现数据所需的规范化方法。所提出的简单程序和规范化方法允许重复样本收集从同一病人和生成可重复的数据, 可以比较时间点, 以评估潜在的治疗效果。

引言

疲劳是一种普遍和令人痛心的情况, 对癌症患者的生活质量有负面影响¹。到目前为止, 癌症疲劳的定义仍然很差, 仅依靠患者的主观报告²。因此, 迫切需要确定一个易于适应的诊断实验室测试, 客观地描述疲劳的临床设置^3,4。

许多潜在的机制, 包括线粒体功能障碍, 已被建议导致疲劳的⁵。线粒体是发电站的细胞器, 通过氧化磷酸化提供95% 的蜂窝能量需求, 并在钙信号、凋亡、免疫信号和调节其他细胞内信号事件中发挥重要作用⁶.因此, 线粒体生物能学受损和能源生产缺陷可能导致疲劳。支持这个假说, 以前的研究观察了线粒体 DNA 在慢性疲劳综合征患者中的突变⁷。尽管目前尚不清楚疲劳的病理生理学起源是否存在于中枢神经系统或周边组织中, 例如骨骼肌^8,9, 当前还没有直接的方法来准确评估线粒体功能障碍与活着的 respiring 细胞的疲劳有关。

利用外周血单个核细胞 (PBMCs) 研究线粒体功能提供了一些优势。首先, PBMCs 是现成的在临床设置使用标准的放血, 可以快速隔离使用基本的实验室技术。其次, 血液收集比收集其他组织如肌肉活检更少侵入。因此, 血液样本可以收集从同一病人反复一段时间, 这有助于纵向评估治疗效果。有趣的是, PBMCs 的线粒体功能在动物模型¹⁰中似乎与肾脏线粒体状态有很好的相关性。此外, 免疫细胞线粒体已被用于检测不同疾病条件下的系统性变化^11,12。循环免疫细胞中的线粒体对免疫功能和免疫信号分子的变化特别敏感, 如细胞因子^13,14,15。例如, 有人观察到, 急性风湿性炎症疾病患者的 PBMCs 表现为高基线耗氧量¹⁴。相比之下, PBMCs 与全身炎症性疾病 (包括脓毒症¹⁶) 隔离的患者的氧耗减少。在炎症条件下, 功能失调的线粒体产生的自由基可能进一步促进氧化应激和长时间炎症¹⁷。线粒体在能源生产和氧化应激中的中心作用表明, 利用线粒体功能作为研究癌症患者疲劳的一个重要因素, 可能是¹³。

以前的研究检测线粒体功能使用生物化学技术, 线粒体膜电位测量, 或隔离特定的细胞群体, 可能不容易适应在临床设置^{5, 14,18}。近年来, 细胞外通量检测的发展使研究人员能够轻松准确地检查氧气消耗率 (OCR) 对呼吸抑制剂自动注射的影响^19,20,21,22. 然而, 大多数这些研究都是针对特定的细胞类型而设计的, 而大容量的高通量格式可能不适用于临床设置。在这篇手稿中, 我们描述了一个优化的协议, 以检查线粒体功能的临床使用。

方案

目前的研究 (NCT00852111) 得到了马里兰国家卫生研究院 (NIH) 机构审查委员会的批准。参加这项研究的参与者为18岁或以上的 euthymic 男性, 他们被诊断为无转移性前列腺癌, 有或没有事先前列腺切除术, 并计划接受外照射治疗 (外照射)。潜在的参与者被排除, 如果他们有一个渐进性疾病, 可能导致严重的疲劳, 在过去五年的精神疾病, 有未矫正甲状腺功能减退或贫血, 或有第二次恶性肿瘤。使用镇静剂、类固醇或非甾体抗炎药物的个体也被排除在外。健康的对照血液样本是在 NIH 批准的协议 (NCT00001846) 下由健康的捐赠者在国立卫生研究院输血医学部门获得的。所有参与者都在 NIH 的马格努森临床研究中心招聘。在学习参与之前获得了书面知情同意书。

1. 线粒体功能测量准备 (实验1天)

1. 水合物传感器墨盒 (请参阅材料表; 大约持续时间: 5 分钟)。
   1. 从包中卸下传感器墨盒。添加 200 ul Calibrant 解决方案的每个井的公用事业板块, 然后填补每个护城河与 400 ul Calibrant 解决方案。
   2. 将传感器板返回到实用新型板上, 现在有 Calibrant 解决方案。将墨盒在非 CO₂ 37 °c 孵化器过夜。
      注: 传感器墨盒需水合至少4小时, 最大可达72小时。

2. 临床样品准备 (实验2天)

1. 使用慢性病治疗的13项功能评估-疲劳 (FACIT)^2,23,24在基线 (外照射启动之前), 中点和完成外照射, 1 年外照射后, 测量疲劳。
   1. 对每个项目的响应使用 0-4 刻度, 其中0代表 "不完全", 4 表示答辩人与相应的声明 "非常" 相关。总分应从 16-53 不等, 低分数反映高疲劳强度。
   2. 将疲劳定义为 FACIT 分数低于 43, FACIT 评分≥43表示没有或没有临床意义的疲劳²。
      注: FACIT 评分为 43, 最佳划分癌症患者和一般人群的疲劳评分为²。
   3. 包括以下13项 FACIT 疲劳等级: 1) 我感到疲倦;2) 我感到身体虚弱;3) 我感到无精打采 ("冲出");4) 我感到疲倦;5) 我有困难开始的事情, 因为我累了;6) 因为我累了, 所以我很难完成事情;7) 我有活力;8) 我能做我平时的活动;9) 白天我要睡觉。10) 我太累了, 不能吃;11) 我需要帮助做我通常的活动;12) 我因太累而无法做我想做的事而感到沮丧;13) 我必须限制我的社交活动, 因为我累了。
2. 从新鲜收集的血液样本中分离 PBMC (大约持续时间: 1 小时)。
   1. 收集8毫升血液进入单个核细胞制备管 (见材料表)。
      注: 血液样本应在收集2小时内处理。如果样品收集后的血液样品处理超过2小时, PBMCs 的质量可能会受到损害。
   2. 离心机在 1750 x g 在室温下30分钟 (18-25 °c)。将混浊层转移到15毫升锥形管上。加15毫升 PBS, 反转5次。
   3. 离心机在 300 x g 15 分钟在4摄氏度。小心地除去和丢弃上清, 不干扰颗粒。通过添加多达10毫升 PBS, 并反转5次, 重新悬浮颗粒。
   4. 离心机在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。在1毫升 PBS 中丢弃液体上清和重新悬浮细胞。将 PBMCs 转移到1.5 毫升离心管。
   5. 离心机在 610 x g 10 分钟。小心地移除上清和并用重悬丸在完全 RPMI-1640 (RPMI-1640 补充10% 血清, 10 毫米青霉素/链霉素)。
3. 非黏附细胞的涂层细胞板 (大约持续时间:30 分钟)。
   1. 通过稀释0.1 米碳酸氢钠 pH 值8.0 中的库存溶液, 制备细胞和组织粘合剂溶液 (参见材料表)。工作解决方案应位于表面积的3.5 微克/厘米²处。
      注意: 此解决方案包含从海洋贻贝中提取的多酚类蛋白,贻。这些蛋白质是由贻贝分泌的胶水的关键成分, 以锚定自己的表面。我们发现, 细胞-德的工作与 PBMCs 最好的。
   2. 添加 100 ul 稀释胶粘剂溶液的每一个井和孵化至少20分钟室温。洗三次, 用 DI 水和空气干燥。

3. 线粒体功能测量

1. 测定培养基的制备 (大约持续时间:10 分钟)。
   注意: 化验介质必须在实验当天进行新的准备。
   1. 将 l-谷氨酰胺、丙酮酸和葡萄糖添加到基介质中 (与 Dulbecco 的修饰鹰的培养基 (DMEM) 相同, 但不含碳酸氢钠、葡萄糖、谷氨酰胺或丙酮酸钠) 来制作化验介质。暖媒体高达37摄氏度, 然后调整 pH 值为7.4。
      注: l-谷氨酰胺、丙酮酸和葡萄糖的浓度通常与正常生长培养基中的浓度相同, 但可根据该检测进行调整。
2. 为图美的应力测试准备 PBMCs (大约持续时间: 2 小时)。
   1. 板材足够 PBMCs 从步2入每个井到达 80-90% 融合。根据我们的经验, 1.5 x 10⁵单元格/很好地产生了最一致的结果。
      注: 井 A 和 H 为背景井, 只应包含无细胞的化验介质。在井 B 到 G, 我们建议电镀至少 3-6 井每个患者样品为了考虑异常点。
   2. 旋转板以 200 x g 为2分钟, 允许细胞粘在井底。用化验介质清洗细胞。这一步从生长培养基中去除血清和碳酸氢钠。
      注意: 按照我们的经验, 洗涤步骤通常会去除 20-30% 的细胞。
   3. 在每个井中添加 180 ul 化验介质, 包括背景井 a 和 h. 在非 CO₂ 37 °c 孵化器中孵化 45-60 分钟。
3. 运行户内应力测试
   1. 用化验介质在图美的应力试剂盒中重建药物, 如下所示:
      1. 寡霉素: 添加 252 ul 化验介质到瓶子, 以产生一个股票溶液在50微米。
      2. FCCP: 在小瓶中加入 288 ul 的化验介质, 生成50微米的库存溶液。
      3. Antimycin/鱼藤酮: 添加 216 ul 的化验介质到瓶子, 以产生一个股票溶液在25微米。
   2. 漩涡重组药物约1分钟。稀释成工作解决方案。
      注意: 工作溶液的浓度应在实验前根据细胞类型滴定和预先确定。对于 PBMCs, 我们发现1微米的寡霉素, 1 微米 FCCP, 0.5 微米 antimycin A/鱼藤酮的工作最好。
   3. 按顺序将药物吸管插入传感器墨盒中的每个端口:
      1. 端口 A: 吸管 20 ul 10 微米寡霉素, 为最终浓度在每井1微米。
      2. 端口 B: 吸管 22 ul 10 微米 FCCP, 为最终浓度在每井1微米。
      3. C 港: 吸管 25 ul 5 微米 antimycin/鱼藤酮为最终浓度在每井0.5 微米。
4. 在胞外通量仪上选择 "图美应力测试"。按照仪表提示插入传感器墨盒。该仪器将自动执行传感器校准。在传感器校准后插入细胞板, 仪器将完成其余的化验。氧气动力学被测量在530毫微米 (励磁)/650 毫微米 (发射), 并且质子浓度被测量在470毫微米 (励磁)/530 毫微米 (放射)。

4. 线粒体功能数据的规范化

1. 准备细胞增殖测定溶液 (大约持续时间: 5 分钟)。
   1. 添加 48 ul 核酸染色 (500x) 和 240 ul 背景抑制器11.7 毫升 PBS (2x)。核酸染色是一种细胞 permeant DNA 结合染料, 背景抑制剂是一种掩蔽染料, 它阻止死细胞或细胞受损细胞膜完整性的染色。DNA 结合染料和背景抑制剂的结合确保只有活细胞被染色。
   2. 在图中应力测试完成后, 将2x 工作溶液 (180 ul) 的相等容积直接添加到每个井中的介质中。
2. 在37摄氏度孵化器的细胞增殖试验溶液中孵化细胞, 用于 45-60 分钟. 用 508 nm (励磁)/527 nm (发射) 和规范化 OCR 数据 (近似持续时间:10 分钟) 量化板读器上活细胞 (荧光) 的数量。.
   注意: 除了数字活细胞外, 用户还可以选择使用细胞总数、核酸量、蛋白质浓度、等来规范化数据。

结果

在对不同的呼吸抑制剂进行序贯注射后, 图面应力测试依赖于测量氧气消耗率 (OCR) 来映射一个完整的线粒体剖面。每种药物注射后的 OCR 测量可用于计算以下与线粒体健康相关的参数:基底 OCR首先在任何药物注射前测量, 以评估满足静止水平 ATP 需求所需的氧气消耗。基础呼吸是通过在寡霉素注射液前减去基线 OCR 的非线粒体呼吸率来计算的。其次, 寡霉素被注射来抑制 ATP 合成酶 (复杂 V) 的质子通道。寡霉素注射后的 OCR 随后下降表示与 ATP 生产相关的氧气消耗量。FCCP (羰基氰化物 4-[三氟甲氧基] 苯腙), 一个载体用来扰乱质子梯度和线粒体膜电位, 然后被用来引出最大的氧气消耗。最大呼吸的计算方法是从 FCCP 注射后的最大 OCR 中减去非线粒体呼吸。备用呼吸容量是最大和基本呼吸的区别。最后, antimycin A (复合 III 抑制剂) 和鱼藤酮 (复合 I 抑制剂) 被注射在同一时间关闭电子传输链。根据定义...

讨论

癌症患者的疲劳是一个虚弱的状况, 没有很好的定义或特征¹。疲劳诊断完全依赖于主观报告, 目前还没有诊断标准或治疗, 这主要是由于在其病理²中缺乏了解。在癌症患者所提出的疲劳机制中, 线粒体功能受损是治疗多弹头的最主要途径之一。因此, 我们开发了一种快速实用的方法来测量临床样品中的线粒体功能, 可用于主动识别患癌症治疗相关毒性包括疲劳的患者, 使早期可以建立管理。

细胞外通量技术结合序贯注射呼吸抑制剂, 可以评估线粒体功能状态, 并已用于体外和体内模型^{19, 20,21}。我们扩大了现有的工作机构, 并制定了一个方法, 以检查线粒体功能障碍的临床标本。本研究的优点是利用了紧凑的胞外通量分析仪。正如我们已经表明, 实验的时间是关键后, 从人类血液中分离新鲜 PBMCs。虽然...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CPT 单核细胞制备管	BD Biosciences 362761		用于放血后分离PBMC
RPMI-1640	康宁	10-040	用于制备 PBMC 生长培养基
牛血清 （FBS）康	宁	35-010-CV	用于制备 PBMC
生长培养基 青霉素/链霉素	ThermoFisher	15140122	用于制备 PBMC 生长培养基
Cell-Tak	Corning	354240	细胞和组织胶粘剂溶液;允许悬浮细胞粘附在表面
Seahorse XF 校准液	Agilent	103059-000	用于水合小柱
XFp Fluxpak（迷你板和传感器小柱）	Agilent	103022-100	包含 XFp 细胞培养小板和传感器小柱
XF 基础培养基	Agilent	103335-100	用于制备 XF 分析培养基
45% 细胞培养物 D-（+）-葡萄糖溶液	康宁	25-037-CI	用于制备 XF检测培养基
丙酮酸钠溶液	Corning	25-000-CI	用于制备 XF 检测培养基
L-谷氨酰胺溶液	ThermoFisher	25030081	用于制备 XF 检测培养基
Seahorse XFp 线粒体应激检测试剂盒	Agilent	103010-100	含有寡霉素、FCCP、抗霉素 A/鱼藤酮
CyQUANT 直接细胞增殖检测	ThermoFisher	C35011	用于活细胞定量和数据归一化
Seahorse XFp 分析仪	Agilent	S7802AEA	用于测量活细胞中的线粒体功能
Cytation 5 Cell Imaging 多功能微孔板检测仪（或任何可以定量板中荧光细胞的仪器）	BioTek	BTCYT5PV	用于活细胞定量和数据归一化