我们的目标是开发一种实用的方案，用于评估癌症患者疲劳相关的线粒体功能障碍。该创新性方案针对临床应用进行了优化，仅需常规静脉采血和基本的实验室操作。
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本文内容
摘要
摘要
疲劳是一种常见且致残的病症，影响着大多数癌症患者。迄今为止，疲劳的特征仍不明确，尚无能够客观评估其严重程度的诊断检测方法。本文介绍了一种优化的方法，用于评估从疲劳癌症患者采集的外周血单个核细胞（PBMC）的线粒体功能。利用紧凑型细胞外通量分析系统，并依次注射呼吸抑制剂，我们通过测量基础线粒体呼吸、备用呼吸能力以及能量表型来考察PBMC的线粒体功能状态，其中能量表型描述了细胞应对压力时偏好的能量代谢途径。在临床环境中，通过标准静脉采血即可方便地获取新鲜PBMC。本方案所述的整个检测过程可在4小时内完成，无需复杂的生化技术。此外，我们还介绍了一种获得可重复数据所必需的标准化方法。该简便的实验流程与标准化方法使得可对同一患者进行多次样本采集，并生成可在不同时间点之间比较的可重复数据，从而用于评估潜在治疗效果。
引言
疲劳是一种常见且令人痛苦的状况，会对癌症患者的生活质量产生负面影响1。迄今为止，癌症相关疲劳仍缺乏明确的定义，且仅依赖患者的主观描述进行判断2。因此，迫切需要建立一种易于推广的实验室诊断方法，以便在临床环境中客观地评估疲劳状态3,4。
已有多种潜在机制被提出可导致疲劳，其中包括线粒体功能障碍5。线粒体是细胞的能量工厂，通过氧化磷酸化提供细胞95%的能量需求，并在钙信号传导、细胞凋亡、免疫信号以及调控其他细胞内信号事件中发挥重要作用6。因此，线粒体生物能量学功能受损以及能量生成缺陷可能与疲劳的发生有关。支持这一假说的证据来自先前的研究，这些研究已在慢性疲劳综合征患者中观察到线粒体DNA的突变7。尽管目前尚不清楚疲劳的病理生理学起源位于中枢神经系统还是外周组织（如骨骼肌）8,9，但目前仍缺乏一种直接方法，用于在活的、进行呼吸作用的细胞中准确评估与疲劳相关的线粒体功能障碍。
利用外周血单个核细胞（PBMCs）研究线粒体功能具有多项优势。首先，在临床环境中，PBMCs可通过标准静脉采血获得，并能利用基础实验室技术快速分离。其次，血液采集相比肌肉活检等组织取样方式更具非侵入性。因此，可对同一患者在不同时间点进行多次采血，便于纵向评估治疗效果。有趣的是，在动物模型中，PBMCs的线粒体功能与肾脏线粒体状态表现出良好的相关性10。此外，免疫细胞中的线粒体已被用作检测不同疾病状态下全身性变化的替代指标11,12。循环免疫细胞中的线粒体对免疫功能变化以及细胞因子等免疫信号分子尤为敏感13,14,15。例如，已有研究发现，急性风湿性炎症疾病患者的PBMCs表现出较高的基础氧耗水平14。相反，在系统性炎症状态（包括脓毒症）患者分离的PBMCs中，氧耗水平则降低16。在炎症条件下，功能障碍的线粒体产生的自由基可能进一步加剧氧化应激并延长炎症反应17。线粒体在能量生成和氧化应激中的核心作用提示，其功能可能作为研究癌症患者疲劳症状的潜在替代指标13。
以往研究线粒体功能的方法包括生化技术、线粒体膜电位测定或特定细胞群体的分离，这些方法在临床环境中可能难以直接应用5,14,18。近年来，细胞外通量检测技术的发展使研究人员能够通过自动注射呼吸抑制剂，简便而准确地检测氧消耗率（OCR）的变化19,20,21,22。然而，大多数此类研究针对特定细胞类型设计，且通量高、规模较大，可能不适用于临床环境。在本文中，我们描述了一种优化的、适用于临床研究的线粒体功能检测方案。
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方案
本研究（NCT00852111）已获得马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会（IRB）批准。纳入本研究的受试者为情绪稳定的男性，年龄在18岁或以上，经诊断患有非转移性前列腺癌，无论是否曾接受过前列腺切除术，并计划接受外照射放射治疗（EBRT）。若潜在受试者在过去五年内患有可导致显著疲劳的进行性疾病、精神疾病，或存在未纠正的甲状腺功能减退或贫血，或患有第二种恶性肿瘤，则被排除在外。使用镇静剂、类固醇或非甾体抗炎药物的个体也被排除。健康对照组的血液样本来自NIH输血医学部，在IRB批准的另一项研究方案（NCT00001846）下招募的健康献血者。所有受试者均在美国国立卫生研究院的马格努森临床研究中心招募。在参与研究前，所有受试者均已签署书面知情同意书。
1. 线粒体功能检测的准备工作（实验第1天）
- 水合传感器芯片（参见 材料表；大约耗时：5 分钟）。
- 从包装中取出传感器芯片。向工具板的每个孔中加入 200 μL 校准液，然后向每个外槽中加入 400 μL 校准液。
- 将传感器板放回已加入校准液的工具板中，在不含 CO2 的 37 °C 培养箱中过夜水合。
注意：传感器芯片的水合时间最少为 4 小时，最长不超过 72 小时。
2. 临床样本制备（实验第2天）
- 使用13项慢性病治疗功能评估量表-疲劳子量表（FACIT-F）测量疲劳2,23,24 在基线期（EBRT开始前）、EBRT中期、EBRT结束时以及EBRT结束后1年。
- 使用0 - 4分制对每项条目进行评分，其中0表示 "一点也不" 4 表示受访者与相应陈述相符 "非常地。" 总分范围应为16至53分，分数越低表示疲劳程度越高。
- 将疲劳定义为FACIT-F评分低于43，FACIT-F评分≥43表示无疲劳或无临床意义的疲劳2.
注意：FACIT-F 评分为 43 时，最能区分癌症患者与普通人群的疲劳程度2. - 在FACIT疲劳量表中包含以下13项内容：1）我感到疲劳；2）我感到全身无力；3）我感到倦怠（无精打采）"洗脱"）；4）我感到疲倦；5）由于疲倦，我难以开始做事；6）由于疲倦，我难以完成事情；7）我有精力；8）我能够进行日常活动；9）我白天需要睡觉；10）我因太疲倦而无法进食；11）我需要他人帮助才能完成日常活动；12）我因疲倦而无法做想做的事，感到沮丧；13）我因疲倦而不得不限制社交活动。
- 从新鲜采集的血液样本中分离外周血单个核细胞（PBMC）（预计耗时：1 h）。
- 将8 mL血液收集至单个核细胞分离管中（参见 材料表).
注意：血液样本应在采集后2小时内处理。若血液样本在采集后超过2小时才进行处理，PBMCs的质量可能会受到影响。 - 在室温（18 - 25 °C）下以 1,750 x g 离心 30 分钟。将浑浊层转移至 15 mL 圆锥形离心管中。加入最多 15 mL 的 PBS，倒置混匀 5 次。
- 在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 15 分钟。小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀。加入最多 10 mL PBS 重悬沉淀，倒置混匀 5 次。
- 在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL PBS 中。将 PBMC 转移至 1.5 mL 微量离心管中。
- 以 610 × g 离心 10 分钟。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于完全 RPMI-1640 培养基（RPMI-1640 加 10% FBS、10 mM 青霉素/链霉素）中。
- 将8 mL血液收集至单个核细胞分离管中（参见 材料表).
- 为非贴壁细胞包被细胞培养板（预计耗时：30 分钟）。
- 制备细胞和组织粘附溶液（参见 材料表) 通过将储备液用0.1 M pH 8.0的碳酸氢钠稀释制备工作液。工作液浓度应为3.5 μg/cm2 表面积。
注意：该溶液含有从海洋贻贝中提取的多酚蛋白， Mytilus edulis这些蛋白质是贻贝分泌的黏性物质中的关键成分，可使贻贝附着于各种表面。我们发现，Cell-Tak 在 PBMCs 中的效果最佳。 - 向每个孔中加入100 μL稀释的粘附溶液，在室温下孵育至少20分钟。用去离子水洗涤三次，自然晾干。
- 制备细胞和组织粘附溶液（参见 材料表) 通过将储备液用0.1 M pH 8.0的碳酸氢钠稀释制备工作液。工作液浓度应为3.5 μg/cm2 表面积。
3. 线粒体功能测定
- 测定培养基的制备（预计耗时：10 分钟）。
注意：测定培养基必须在实验当天新鲜配制。- 将 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和葡萄糖加入基础培养基中（成分与 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）相同，但不含碳酸氢钠、葡萄糖、谷氨酰胺或丙酮酸钠），配制成测定培养基。将培养基预热至 37 °C，然后调节 pH 至 7.4。
注意：L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和葡萄糖的浓度通常与常规生长培养基中的浓度相同，但可根据具体测定需求进行调整。
- 将 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和葡萄糖加入基础培养基中（成分与 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）相同，但不含碳酸氢钠、葡萄糖、谷氨酰胺或丙酮酸钠），配制成测定培养基。将培养基预热至 37 °C，然后调节 pH 至 7.4。
- 为线粒体应激测试准备外周血单个核细胞（PBMCs）（预计耗时：2 小时）。
- 将步骤 2 中获得的 PBMCs 以每孔足够达到 80–90% 汇合度的数量接种。根据我们的经验，每孔接种 1.5 × 105 个细胞可获得最一致的结果。
注意：A 和 H 列为背景孔，仅含测定培养基，不含细胞。对于 B 至 G 列，我们建议每个患者样本至少设置 3–6 个复孔，以排除异常值的影响。 - 以 200 × g 离心 2 分钟，使细胞沉降并贴附于孔底。用测定培养基洗涤细胞一次，以去除生长培养基中的血清和碳酸氢钠。
注意：根据我们的经验，该洗涤步骤通常会导致 20–30% 的细胞丢失。 - 向每个孔（包括背景孔 A 和 H）加入 180 μL 测定培养基，在 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育 45–60 分钟。
- 将步骤 2 中获得的 PBMCs 以每孔足够达到 80–90% 汇合度的数量接种。根据我们的经验，每孔接种 1.5 × 105 个细胞可获得最一致的结果。
- 运行线粒体应激测试
- 使用测定培养基按以下方式重悬线粒体应激测试试剂盒中的药物：
- 寡霉素：向瓶中加入 252 μL 测定培养基，配制成 50 μM 的储存液。
- FCCP：向瓶中加入 288 μL 测定培养基，配制成 50 μM 的储存液。
- 抗霉素 A/鱼藤酮：向瓶中加入 216 μL 测定培养基，配制成 25 μM 的储存液。
- 将重悬后的药物涡旋震荡约 1 分钟，随后稀释为工作液。
注意：工作液的浓度应根据细胞类型在实验前通过预实验确定。对于 PBMCs，我们发现 1 μM 寡霉素、1 μM FCCP 和 0.5 μM 抗霉素 A/鱼藤酮效果最佳。 - 依次将药物加入传感器微板的各个加样孔中：
- A 孔：加入 20 μL 10 μM 寡霉素，使每孔终浓度为 1 μM。
- B 孔：加入 22 μL 10 μM FCCP，使每孔终浓度为 1 μM。
- C 孔：加入 25 μL 5 μM 抗霉素 A/鱼藤酮，使每孔终浓度为 0.5 μM。
- 使用测定培养基按以下方式重悬线粒体应激测试试剂盒中的药物：
- 在细胞外通量分析仪上选择 "线粒体应激测试"程序。按照仪器提示插入传感器微板，仪器将自动完成传感器校准。校准完成后插入细胞培养板，仪器将自动完成后续测定。氧气动态变化的检测激发波长为 530 nm，发射波长为 650 nm；质子浓度的检测激发波长为 470 nm，发射波长为 530 nm。
4. 线粒体功能数据的标准化
- 制备细胞增殖检测试剂（预计耗时：5 分钟）。
- 向11.7 mL PBS（2x）中加入48 μL核酸染料（500x）和240 μL背景抑制剂。核酸染料是一种可穿透细胞膜的DNA结合染料，背景抑制剂则是一种遮蔽性染料，可阻止死细胞或细胞膜完整性受损的细胞被染色。DNA结合染料与背景抑制剂联用可确保仅有活细胞被染色。
- 加入等体积的 2x 在完成线粒体应激测试后，将工作液（180 μL）直接加入每个孔的培养基中。
- 在37 °C培养箱中，将细胞与细胞增殖检测试剂共同孵育45–60分钟。使用酶标仪在508 nm（激发）/527 nm（发射）条件下定量活细胞数（荧光），并对OCR数据进行归一化处理（预计耗时：10分钟）。
注意：除了活细胞数量外，用户还可以选择使用总细胞数、核酸量或蛋白质浓度对数据进行标准化处理， 等等.
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结果
线粒体应激测试依赖于依次注射多种呼吸抑制剂后测量耗氧速率（OCR），以绘制完整的线粒体功能谱。每次药物注射后的OCR测量值可用于计算以下与线粒体健康相关的参数： 基础耗氧率 在给予任何药物注射之前，首先测量氧气消耗率，以评估满足静息状态下ATP需求所需的氧耗水平。基础呼吸（Basal respiration）通过从寡霉素注射前的基线氧消耗率（OCR）中减去非线粒体呼吸速率计算得出。随后，注射寡霉素以抑制ATP合酶（复合体V）的质子通道。寡霉素注射后OCR的下降值代表 ATP 生成相关的氧气消耗随后使用离子载体FCCP（羰基氰化-4-三氟甲氧基苯腙）破坏质子梯度和线粒体膜电位，以诱导最大氧消耗。 最大呼吸速率 通过从FCCP注射后的最大OCR中减去非线粒体呼吸来计算。 备用呼吸能力 最大呼吸与基础呼吸之间的差值。最后，同时注射抗霉素A（复合体III抑制剂）和鱼藤酮（复合体I抑制剂），以关闭电子传递链。根据定义， 非线粒体呼吸...
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讨论
癌症患者的疲劳是一种致残性状况，目前尚无明确定义或特征描述1。疲劳的诊断完全依赖于患者的主观报告，且目前尚无针对该状况的诊断标准或治疗方法，这主要归因于对其病理生物学机制缺乏理解2。在已提出的多种癌症患者疲劳发生机制中，线粒体功能障碍是最具治疗靶向潜力的通路之一。因此，我们开发了一种快速且实用的方法，用于检测临床样本中的线粒体功能，可用于主动识别那些有风险发生与癌症治疗相关毒性（包括疲劳）的患者，从而及早实施干预管理。
细胞外通量技术结合呼吸抑制剂的顺序注射可用于评估线粒体功能状态，已被广泛应用于 体外 和 体内 模型19,20,21我们拓展了现有研究，开发出一种优化后可用于临床样本中线粒体功能障碍检测的方法。本研究的优势在于使用了小型细胞外通量分析仪。如我们所展示的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究完全由美国国立卫生研究院（NIH）护理研究所的院内研究部资助，美国马里兰州贝塞斯达。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CPT 单个核细胞制备管 | BD Biosciences | 362761 | 用于静脉采血后分离外周血单个核细胞（PBMCs） |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | 用于配制 PBMCs 的生长培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Corning | 35-010-CV | 用于配制 PBMCs 的生长培养基 |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher | 15140122 | 用于配制 PBMCs 的生长培养基 |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | 细胞和组织粘附溶液；使悬浮细胞能够贴附于表面 |
| Seahorse XF 校准液 | Agilent | 103059-000 | 用于水合传感器微孔板 |
| XFp Fluxpak（微型板和传感器微孔板） | Agilent | 103022-100 | 包含 XFp 细胞培养微型板和传感器微孔板 |
| XF 基础培养基 | Agilent | 103335-100 | 用于配制 XF 检测培养基 |
| 45% 细胞培养用 D-(+)-葡萄糖溶液 | Corning | 25-037-CI | 用于配制 XF 检测培养基 |
| 丙酮酸钠溶液 | Corning | 25-000-CI | 用于配制 XF 检测培养基 |
| L-谷氨酰胺溶液 | ThermoFisher | 25030081 | 用于配制 XF 检测培养基 |
| Seahorse XFp 线粒体应激检测试剂盒 | Agilent | 103010-100 | 包含寡霉素、FCCP、抗霉素 A/鱼藤酮 |
| CyQUANT Direct 细胞增殖检测试剂盒 | ThermoFisher | C35011 | 用于活细胞定量及数据归一化 |
| Seahorse XFp 分析仪 | Agilent | S7802AEA | 用于检测活细胞中的线粒体功能 |
| Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪（或任何可定量微孔板中荧光细胞的仪器） | BioTek | BTCYT5PV | 用于活细胞定量及数据归一化 |
参考文献
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