脂多糖诱导的脓毒性肺损伤中支气管肺泡灌洗外泌体

摘要

经腹腔注射LPS的小鼠在支气管肺泡灌洗（BAL）液中分泌含有miRNA的外泌体。利用共培养系统，我们发现BAL液中释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达，并增加促炎性细胞因子的表达，从而加剧肺损伤。

摘要

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一组异质性肺部疾病，其发病率和死亡率仍然较高。尽管ALI的分子发病机制正在逐步明确，但由于该疾病具有复杂的特性，目前尚未开发出有效的分子疗法。本文采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性脓毒症肺损伤模型，以阐明外泌体在炎症反应中的作用。利用该模型，我们发现经腹腔注射LPS的小鼠会从肺部分泌含有miRNA和细胞因子的外泌体进入支气管肺泡灌洗（BAL）液中，这些分子可调控炎症反应。此外，通过共培养模型系统，我们证实巨噬细胞释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达。这些结果提示：1）天然免疫细胞与结构细胞之间通过外泌体介导的信号传递相互作用，参与了炎症反应及结构屏障的破坏；2）靶向这些miRNA可能为治疗ALI和ARDS提供一种全新的策略。

引言

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是非心源性肺水肿引起的严重低氧血症性呼吸衰竭的危及生命的形式，全球每年约影响100万人¹。ARDS的病因包括由感染或误吸导致的肺部直接损伤以及多种间接损伤。在过去十年中，人们对ARDS的分子发病机制有了更深入的理解，但目前尚未开发出针对ARDS的特异性靶向治疗方法^2,3。

已开发出多种急性肺损伤的动物模型，这些模型为将实验性治疗手段转化为人类研究提供了桥梁^4,5。常用的模型包括局部注射油酸、细菌、脂多糖（LPS）和博来霉素。其他方法包括缺血-再灌注、盲肠结扎穿孔、机械通气引起的牵拉损伤、高氧暴露，以及细菌和LPS的全身给药⁵。这些模型为检验临床假设和开发潜在治疗方法提供了有用的生物系统。为了模拟人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS），动物模型应能重现肺部上皮细胞和内皮细胞的炎症与急性损伤，并伴有肺屏障功能障碍。

外泌体是直径为20 - 200 nm的膜性囊泡，其分子内容物包含蛋白质、DNA、RNA和脂质，可通过分子成分的转移介导组织微环境中细胞间的通讯。外泌体由多种细胞分泌，如内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞，并存在于人体体液中。研究表明，在感染性和非感染性炎症疾病过程中，外泌体可调节免疫细胞与基质细胞之间的相互作用，其异常释放似乎在生理和病理过程中受到多种天然及实验性刺激的调控⁶。此类通讯网络可能在肺部疾病的发病机制中发挥重要作用，并影响其病理生理进程^7,8。miRNA是一类长度为18 - 22个核苷酸的非编码RNA，存在于组织和体液（如血浆、血清）中，可在转录后水平调控mRNA的表达^9,10。

外泌体中包裹的miRNA影响多种细胞的分化和功能，其过量表达与多种疾病相关，包括癌症、肺部疾病、肥胖、糖尿病和心血管疾病^{11,12,13,14,15,16}。外泌体miRNA进入受体细胞并进行转运，有助于细胞间通讯，从而调节微环境的稳态^17,18。急性肺损伤是一个复杂的过程，涉及多种细胞类型，并通过外泌体实现广泛的细胞间通讯⁸。miR-155和miR-146a具有共同的转录调控机制，在炎症反应和免疫耐受中发挥重要作用^19,20。近期研究表明，两者均通过免疫细胞间外泌体miRNA的转运来调节炎症反应²¹。然而，外泌体miRNA对肺泡细胞响应内毒素的调节作用所涉及的分子机制仍不明确，其潜在的临床意义和转化价值无疑值得进一步研究。

共培养模型被用于界定特定细胞类型在复杂环境（如炎症和癌症）中的相互作用^22,23。这些平台为研究细胞类型之间的相互交流，特别是免疫细胞与结构细胞之间的相互作用，提供了一种替代策略。

气管内、气溶胶、腹腔或全身给予脂多糖（LPS）被广泛用于诱导实验性肺损伤^24,25,26，并已被证明可引起肺上皮和内皮通透性障碍。本研究中，我们采用腹腔注射LPS在小鼠中建立急性肺损伤的脓毒症模型。腹腔注射LPS后24小时内，肺组织即出现通透性障碍，并伴有炎性细胞的募集。此外，我们发现支气管肺泡灌洗液（BAL）来源的外泌体含有miRNA-155和miR-146a，且BAL液中的外泌体可诱导受体上皮细胞表达包括IL-6和TNF-α在内的促炎性细胞因子。这些数据首次表明，在该急性脓毒症肺损伤模型中，外泌体miRNA可分泌至BAL液中。

方案

整个实验方案需要2天时间，包括第1天进行脓毒症诱导并从动物体内分离支气管肺泡灌洗液，第2天从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离外泌体。所有实验步骤均已通过亚特兰大退伍军人医疗中心机构动物护理和使用委员会的审查和批准。

1. 小鼠急性脓毒症肺损伤模型

1. 使用6至8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠（体重20 - 22 g）建立动物模型，所有操作均采用无菌技术和无菌器械。将所有手术器械（包括镊子和剪刀）在121 °C条件下高压灭菌20分钟。 
2. 将小鼠随机分为实验组和对照组。将小鼠固定于手术板上，通过腹腔注射给予大肠杆菌脂多糖（Escherichia coli lipopolysaccharide, LPS, 15 mg/kg）。根据每只小鼠的个体体重，将适当剂量的LPS用PBS稀释至每只0.1 mL，使用1 mL注射器配合27 G针头注射LPS溶液；对照组动物注射等体积的PBS。
3. 将小鼠饲养于生物安全二级（BSL2）动物设施中，保持笼具清洁并维持适宜的室温。
4. 24小时后，通过吸入CO₂对小鼠实施安乐死。
5. 选择小鼠颈部正中区域作为手术部位，做一小切口（约5 mm），使用钝头镊子轻轻分离肌肉组织以暴露气管。
6. 使用10 mL无菌注射器配合27 G针头抽取小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）。首先，将针头轻柔插入气管，缓慢注入1 mL无菌PBS，随后用另一支3 mL一次性注射器配合27 G针头抽出BALF。操作完成后，将注射器和针头丢弃至生物危害锐器容器中。
7. 按照Chauret et al.²⁷先前所述方法，使用二氧化氯处理手术器械，随后将所有器械在121 °C条件下高压灭菌20分钟。

2.  外泌体分离——连续超速离心法及表征

1. 用15 mL圆锥形管收集小鼠支气管肺泡灌洗液。为获取肺泡细胞，将样品在4 °C条件下以1,000 g离心10分钟。
2. 将上清液转移至新的15 mL圆锥形管中，然后在4 °C条件下以4,000 x g离心30分钟，以去除细胞碎片。
3. 将上清液收集到超速离心管中，在4 °C条件下以10,000 x g离心60分钟，以去除较大的细胞颗粒。
4. 将上清液转移至新的圆锥形管中，然后通过0.2 µm注射器滤器过滤样品，以去除残留的较大颗粒。
5. 将样品收集到超速离心管中，并平衡管重。在4°C条件下以140,000 x g离心2小时，使外泌体沉淀。
   注意：外泌体的大小通常在20–200 nm之间。0.2 µm滤器用于去除大于200 nm的较大颗粒。
6. 小心弃去上清液。用100 µL PBS或裂解液溶解沉淀，将外泌体样品转移至1.5 mL离心管中，并于-80 °C保存备用。
   注意：建议使用透射电子显微镜验证所分离的外泌体。
7. 按照标准的透射电镜（TEM）样品处理流程²⁸进行操作。使用透射电子显微镜分析外泌体样品并拍摄图像，标尺为200 nm。

3. miRNA 的制备及 miRNA 定量逆转录 PCR（q-RT-PCR）操作

注意：建议采用miRNA-q-RT-PCR分析miRNA的表达水平。

1. 按照标准的miRNA分离方案操作，并确保在单链反转录中使用等量的纯化RNA²⁴。
2. 按照标准的实时PCR方案检测支气管肺泡灌洗液中外泌体microRNA的水平。使用针对miR-155、miR-146a和U6 SnRNA的特异性实时PCR引物。使用定量PCR仪器进行PCR反应，并将表达量以U6 snRNA作为内参进行归一化。
   注意：每组包含三个重复样本²⁴。

4. 外泌体标记与纯化

1. 在1.5 mL聚丙烯管中，用100 µL悬浮液重悬外泌体沉淀；另取一管加入100 µL悬浮液，并加入0.4 µL外泌体染料。
2. 迅速将外泌体溶液加入染料溶液中，通过移液充分混匀。室温避光孵育5分钟。
3. 将一个外泌体离心柱放入1.5 mL洗脱管中。将混合溶液转移至外泌体离心柱中央。
4. 室温下以800 × g离心2分钟。
5. 弃去离心柱，将洗脱后的样品储存于-20 °C，待用。

5. 受体细胞摄取外泌体的验证

1. 在8孔培养板中接种1 × 10⁴ 个 MLE 12 细胞/孔，在37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞。
2. 向细胞中加入10 µL荧光标记的外泌体，在37 °C孵育1小时。
3. 移除培养基，用PBS洗涤细胞，然后在室温下用1%多聚甲醛固定10分钟。
4. 用含DAPI的封片剂封片。
5. 通过荧光显微镜分析样品并采集图像，放大倍数为40倍。

6. 外泌体与受体细胞相互作用的验证

1. 在含有适当培养基的12孔培养板中接种2 × 10⁵ 个MLE12细胞/孔，于37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞。
2. 向MLE12细胞中加入20 µg来自小鼠支气管肺泡灌洗液的外泌体，并为每个实验组设置重复样本。
3. 24小时后，用PBS洗涤细胞，每孔加入600 µL裂解缓冲液，轻轻摇动培养板，用移液器将裂解样品收集至1.5 mL离心管中。
4. 按照标准的总RNA提取和cDNA反转录操作流程，完成单链cDNA的反转录²⁹。
5. 按照标准的实时PCR操作流程检测受体细胞中mRNA的表达水平²⁹。 使用针对TNF-α、IL-6和ZO-1的特异性实时PCR引物，用定量PCR仪进行PCR扩增反应，并以GAPDH作为内参对照对表达值进行标准化。
   注意：每组包含三个重复样本。

结果

为诱导脓毒症性肺损伤，小鼠接受腹腔注射脂多糖（LPS，15 mg/kg）。LPS给药后24小时内，肺部出现中性粒细胞浸润，如图1A所示。采集小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF），随后分离并纯化外泌体。通过透射电子显微镜确认BALF外泌体的形态（图1B）。

通过q-RT-PCR检测纯化的外泌体中选择性促炎性miRNA miRNA-155和miR-146a的表达。与PBS处理的对照组小鼠相比，LPS处理小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）外泌体中miR-155和miR-146a的表达水平显著升高（miR-155，1 ± 0.16 vs 11.6 ± 0.6；miR-146a，1 ± 0.12 vs 13.5 ± 1.186）（图2）。

讨论

疾病的小鼠模型常用于评估特定基因的生理功能，并降低实验成本²。此处描述的急性脓毒症性肺损伤模拟了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中观察到的炎症反应。该模型适用于研究分子发病机制、生物标志物的开发以及潜在新疗法的测试⁵。

共培养系统在研究生物分子（如RNA、DNA、脂质和蛋白质）在体外系统中转移的潜在机制时，对于体内研究具有重要意义^23,30。其中一些平台在解析复杂疾病机制以及开发相关疗法方面具有重要价值^22,23。如本研究所示，灌洗液来源的细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）释放的外泌体可通过外泌体转移影响结构上皮细胞的完整性。

外泌体的病理生物学效应在人类疾病的诊断和治疗中正逐渐成为关键...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂多糖	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
mirVana miRNA 提取试剂盒	赛默飞世尔科技	449774
TaqMan 基因表达预混液	赛默飞世尔科技	4369016
mmu-miR-155 (002571) 引物	赛默飞世尔科技	4427975
has-miR-146a (000468) 引物	赛默飞世尔科技	4427975
U6snRNA 引物	赛默飞世尔科技	4427975
TNF-α(Mm00443258_m1) 引物	赛默飞世尔科技	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1)   引物	赛默飞世尔科技	4331182
ZO-1（Mm00493699_m1）  引物	赛默飞世尔科技	4331182
最低必需培养基（MEM）	赛默飞世尔科技	11095-072
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	赛默飞世尔科技	25300054
使用PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒（Mini Kit）将外泌体标记PKH67	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
外泌体离心柱（MW3000）	赛默飞世尔科技	4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP 超速离心机	贝克曼库尔特	L-100XP
超透明离心管	贝克曼库尔特	344058
Applied Biosystems 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统	赛默飞世尔科技
透射电子显微镜（TEM）	日本电子株式会社	120 kV 透射电子显微镜
奥林巴斯 BX41 显微镜	奥林巴斯	BX41