经腹腔注射LPS的小鼠在支气管肺泡灌洗（BAL）液中分泌含有miRNA的外泌体。利用共培养系统，我们发现BAL液中释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达，并增加促炎性细胞因子的表达，从而加剧肺损伤。
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摘要
摘要
急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一组异质性肺部疾病，其发病率和死亡率仍然较高。尽管ALI的分子发病机制正在逐步明确，但由于该疾病具有复杂的特性，目前尚未开发出有效的分子疗法。本文采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性脓毒症肺损伤模型，以阐明外泌体在炎症反应中的作用。利用该模型，我们发现经腹腔注射LPS的小鼠会从肺部分泌含有miRNA和细胞因子的外泌体进入支气管肺泡灌洗（BAL）液中，这些分子可调控炎症反应。此外，通过共培养模型系统，我们证实巨噬细胞释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达。这些结果提示：1）天然免疫细胞与结构细胞之间通过外泌体介导的信号传递相互作用，参与了炎症反应及结构屏障的破坏；2）靶向这些miRNA可能为治疗ALI和ARDS提供一种全新的策略。
引言
急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是非心源性肺水肿引起的严重低氧血症性呼吸衰竭的危及生命的形式，全球每年约影响100万人1。ARDS的病因包括由感染或误吸导致的肺部直接损伤以及多种间接损伤。在过去十年中，人们对ARDS的分子发病机制有了更深入的理解，但目前尚未开发出针对ARDS的特异性靶向治疗方法2,3。
已开发出多种急性肺损伤的动物模型，这些模型为将实验性治疗手段转化为人类研究提供了桥梁4,5。常用的模型包括局部注射油酸、细菌、脂多糖（LPS）和博来霉素。其他方法包括缺血-再灌注、盲肠结扎穿孔、机械通气引起的牵拉损伤、高氧暴露，以及细菌和LPS的全身给药5。这些模型为检验临床假设和开发潜在治疗方法提供了有用的生物系统。为了模拟人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS），动物模型应能重现肺部上皮细胞和内皮细胞的炎症与急性损伤，并伴有肺屏障功能障碍。
外泌体是直径为20 - 200 nm的膜性囊泡，其分子内容物包含蛋白质、DNA、RNA和脂质，可通过分子成分的转移介导组织微环境中细胞间的....
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方案
整个实验方案需要2天时间，包括第1天进行脓毒症诱导并从动物体内分离支气管肺泡灌洗液，第2天从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离外泌体。所有实验步骤均已通过亚特兰大退伍军人医疗中心机构动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. 小鼠急性脓毒症肺损伤模型
- 使用6至8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠（体重20 - 22 g）建立动物模型，所有操作均采用无菌技术和无菌器械。将所有手术器械（包括镊子和剪刀）在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
- 将小鼠随机分为实验组和对照组。将小鼠固定于手术板上，通过腹腔注射给予大肠杆菌脂多糖（Escherichia coli lipopolysaccharide, LPS, 15 mg/kg）。根据每只小鼠的个体体重，将适当剂量的LPS用PBS稀释至每只0.1 mL，使用1 mL注射器配合27 G针头注射LPS溶液；对照组动物注射等体积的PBS。
- 将小鼠饲养于生物安全二级（BSL2）动物设施中，保持笼具清洁并维持适宜的室温。
- 24小时后，通过吸入CO2对小鼠实施安乐死。
- 选择小鼠颈部正中区域作为手术部位，做一小切口（约5 mm），使用钝头镊子轻轻分离肌肉组织以暴露气管。
- 使用10 mL无菌注射器配合27 G针头抽取小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）。首先，将针头轻柔插入气管，缓慢注入1 ....
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结果
为诱导脓毒症性肺损伤，小鼠接受腹腔注射脂多糖（LPS，15 mg/kg）。LPS给药后24小时内，肺部出现中性粒细胞浸润，如图1A所示。采集小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF），随后分离并纯化外泌体。通过透射电子显微镜确认BALF外泌体的形态（图1B）。
通过q-RT-PCR检测纯化的外泌体中选择性促炎性miRNA miRNA-155和miR-146a的表达。与PBS处理的对照组小鼠相比，LPS处理小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）外泌体中miR-155和miR-146a的表达水平显著升高（miR-155，1 ± 0.16 vs 11.6 ± 0.6；miR-146a，1 ± 0.12 vs 13.5 ± 1.186）（图2）。
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讨论
疾病的小鼠模型常用于评估特定基因的生理功能，并降低实验成本2。此处描述的急性脓毒症性肺损伤模拟了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中观察到的炎症反应。该模型适用于研究分子发病机制、生物标志物的开发以及潜在新疗法的测试5。
共培养系统在研究生物分子（如RNA、DNA、脂质和蛋白质）在体外系统中转移的潜在机制时，对于体内研究具有重要意义23,30。其中一些平台在解析复杂疾病机制以及开发相关疗法方面具有重要价值22,23。如本研究所示，灌洗液来源的细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）释放的外泌体可通过外泌体转移影响结构上皮细胞的完整性。
外泌体的病理生物学效应在人类疾病的诊断和治疗中正逐渐成为关键.......
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披露
本研究由美国退伍军人事务部优秀研究基金 2I01BX001786-06A1 资助，项目负责人为 RS。
致谢
作者声明无利益冲突。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA 提取试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 449774 | |
| TaqMan 基因表达预混液 | 赛默飞世尔科技 | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) 引物 | 赛默飞世尔科技 | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) 引物 | 赛默飞世尔科技 | 4427975 | |
| U6snRNA 引物 | 赛默飞世尔科技 | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1) 引物 | 赛默飞世尔科技 | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1) 引物 | 赛默飞世尔科技 | 4331182 | |
| ZO-1（Mm00493699_m1） 引物 | 赛默飞世尔科技 | 4331182 | |
| 最低必需培养基（MEM） | 赛默飞世尔科技 | 11095-072 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | 赛默飞世尔科技 | 25300054 | |
| 使用PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒（Mini Kit）将外泌体标记PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| 外泌体离心柱（MW3000） | 赛默飞世尔科技 | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | L-100XP | |
| 超透明离心管 | 贝克曼库尔特 | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 透射电子显微镜（TEM） | 日本电子株式会社 | 120 kV 透射电子显微镜 | |
| 奥林巴斯 BX41 显微镜 | 奥林巴斯 | BX41 |
参考文献
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.
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重印与许可
