需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

新鲜与冷冻胃肠道标本的亚细胞组分分离

9.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57740

⸱

2018年7月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute, 2Endocrinology and Diabetes Research Group, Biocruces Health Research Institute, UPV-EHU, CIBERDEM

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单的细胞分馏方案，用于分离人新鲜及冷冻肠道活检组织中的胞质蛋白和核蛋白。

摘要

本方案的目的是将通过内窥镜获取的人类肠道组织分馏为细胞核和细胞质组分，以分析特定蛋白质或蛋白质复合物在不同组织状态（即健康与疾病）下的定位情况。该方法适用于新鲜及冷冻肠道组织样本的分馏，操作简便，所有实验室均可开展，且耗时较少。

引言

蛋白质几乎参与细胞内的所有生物学功能，其结构、数量或位置的任何变化都可能导致致病情况。组织样本分馏方法有助于降低与疾病相关蛋白质分析的复杂性。一些研究利用蛋白质定位信息或富集特定细胞区室中的蛋白质，因此建立一种可重复地分离完整蛋白质的方案，对于回答特定生物学问题具有重要意义。确定蛋白质的亚细胞定位，并监测其在基础状态和疾病状态下的区室重新分布或相互作用，将有助于识别与疾病相关的功能差异1，2。因此，本方法旨在对新鲜或冷冻的肠道组织活检样本进行可重复的分馏，将其分离为细胞质和细胞核两个亚细胞组分。

在内镜检查过程中常规获取肠道活检样本3（图1），这些样本可有效用于蛋白质定量或免疫共沉淀研究。由于来自肠上皮的组织样本含有可能直接参与疾病发病机制的蛋白质4，因此肠道活检样本是成功鉴定肠道疾病特异性蛋白质的宝贵来源。将患者组织样本连同临床信息一起冷冻保存，可为蛋白质分析提供有用的资源，而利用有限量的冷冻组织获得细胞区室信息的关键在于简单且可重复的样本制备方法5。

目前市面上有多种可用于分离细胞组分的商业试剂盒，但这些试剂盒通常比本文所述方案更昂贵且耗时更长。以往也曾采用基于多步梯度离心和连续梯度离心的方案来分离不同组织中的多种细胞器6,7。然而，维持连续梯度的稳定性通常较为困难。此前已有基于膜结构顺序裂解的类似方案报道，但这些方法通常需要使用两种以上的缓冲液，且操作时间更长8。

在进行组织样本分馏时，需注意组织样本中存在细胞间及细胞与基质间的相互作用，这些相互作用在培养细胞中不存在，但在进行蛋白质提取时至关重要。在不影响蛋白质质量的前提下，有效分离细胞与细胞外基质，是肠道组织蛋白质提取的关键因素9。在本方案中，首先破坏细胞间和细胞与基质间的连接，使细胞释放，从而允许缓冲液充分接触单个细胞。为避免在分馏前发生蛋白质区室间的混合，必须在不破坏细胞完整性或核膜完整性的前提下完成这些连接的解离。

由于肠黏膜中含有多种蛋白酶10，因此在蛋白质提取过程中控制蛋白质降解至关重要。为最大限度减少潜在的蛋白质降解，必须在蛋白质提取缓冲液中加入多种蛋白酶抑制剂。此外，如果提取物将用于功能测定，则必须避免蛋白质变性或蛋白水解，因为这会导致蛋白质活性丧失11。为此，本实验全程在 4 °C 下进行，并在使用前向缓冲液中新鲜添加苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为 0.1 mM，以进一步抑制蛋白水解。

细胞分级分离的第一步是组织破碎和细胞裂解。如前所述，其目的是在尽可能减少损伤的情况下将细胞分散并打开。肠道组织样本必须进行匀浆处理，并裂解细胞以最大程度破坏细胞膜。在本方案中，我们使用电动研磨棒混合器破碎肠道组织，通过高速涡旋作用在数秒内完成匀浆。匀浆后，将组织细胞在低渗缓冲液中孵育，使细胞膜破裂而细胞核保持完整，随后加入非变性去污剂（壬基酚聚氧乙烯醚）并短暂涡旋，以分离细胞核与胞质组分。去除胞质后，通过振荡将细胞核膜破裂进入高渗缓冲液中。

本文介绍的方法适用于对在内镜检查过程中获取的新鲜或冷冻肠道活检组织（重量介于2至10 mg之间）进行亚细胞分级分离。该方案操作简便、可重复性强，可在一小时之内使用常规实验室设备和试剂完成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究经克鲁塞斯大学医院伦理委员会批准，并在获得所有受试者或其监护人的知情同意后进行分析。

1. 活检样本采集

注意：患者远端十二指肠的活检样本是在常规诊断性内镜检查过程中获取的，所获取的活检组织重量通常在 2 至 10 mg 之间。活检组织是一种由多种细胞类型组成的复杂组织，包括上皮细胞、免疫细胞和内皮细胞。临床胃肠病医生依据既定的临床指南进行内镜操作。

  1. 内镜检查后立即将活检组织置于无菌滤纸上。
  2. 使用镊子将活检组织转移至1.5 mL离心管中，用PBS浸泡后放入冻存管中。
  3. 将离心管置于冰上，直至送达实验室。
    1. 立即开始处理新鲜活检组织。
  4. 对于冷冻活检组织，需将含有组织的离心管进行速冻，并储存在液氮中直至使用。
    注意：在加入冷补充缓冲液1之前，必须始终保持样本处于冷冻状态。

2. 缓冲液的配制

注意：开始之前，按如下说明补充缓冲液。

  1. 向低渗缓冲液1和高渗缓冲液2（表1）中加入1 mM DTT（终浓度）以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（终浓度1×）。
    1. 每份样品准备1.5 mL缓冲液1和150 µL缓冲液2。DTT可防止样品氧化。
  2. 向已添加补剂的缓冲液1中加入1%去垢剂（壬基酚聚醚，nonyl phenoxypolyethoxylethanol），使其终浓度为0.1%，配制核洗缓冲液。每份样品准备1 mL核洗缓冲液。

3. 活检组织匀浆化

  1. 新鲜活检组织
    1. 将一次性研杵放入电动混合器中。确保研杵能够触及管底。
    2. 用移液器吸头将活检组织从冻存管中取出，并放入1.5 mL离心管中。
    3. 向1.5 mL离心管中加入200 µL添加补充剂的缓冲液1。
    4. 使用研杵充分匀浆活检组织，直至组织完全破碎，并将样品置于冰上保存。
    5. 待所有活检组织均完成匀浆后，继续进行第4步。
      注意：每次处理不同活检样本时，必须更换一次性研杵。
  2. 冷冻活检组织
    警告：操作液氮时需格外小心；液氮接触皮肤或眼睛可能导致严重冻伤。处理液氮时务必始终保护手部和眼睛。
    1. 将部分液氮倒入容器中，用于存放从液氮罐中取出的冻存管。
    2. 从液氮罐中找到目标活检样本，将冻存管放入盛有液氮的容器中。对所有活检样本重复此步骤。
    3. 将活检组织从冻存管转移至1.5 mL离心管。
      注意：活检组织会附着在冷冻的管壁上。使用无菌移液器吸头轻轻推动组织，使其脱离管壁。
    4. 加入200 µL添加补充剂的缓冲液1。
    5. 使用研杵和研钵匀浆组织，直至组织完全破碎，整个操作过程需保持温度在4 °C。
      注意：在加入缓冲液前，切勿让活检组织提前解冻。

4. 细胞质分离

  1. 将匀浆后的活检组织在冰上孵育10分钟。
  2. 向每个样品中加入10 µL 1%的去垢剂（壬基苯氧基聚乙氧基乙醇），使终浓度为0.05%。
    注意：由于温和的去垢剂会破坏细胞膜，细胞将通过渗透裂解而膨胀并破裂。
  3. 冰上孵育5分钟。
  4. 涡旋混匀片刻，在 4 ˚C 下以 400 × g 离心 2 分钟。
  5. 涡旋后，移除上清液并转移至新的洁净1.5 mL离心管中，此即为胞质组分；切勿弃去沉淀。

5. 细胞核分离

  1. 用200 µL核洗涤缓冲液重悬前一步骤中的沉淀。
  2. 在400 × g、4 °C条件下离心2分钟。
  3. 弃去上清液，并重复洗涤步骤两次。
    注意：洗涤可去除核组分中的胞质污染。
  4. 第三次洗涤后，将沉淀重悬于100 µL缓冲液2中。
  5. 在4 ˚C下剧烈振荡样品30分钟。或者，将样品置于冰上孵育，并每5分钟涡旋一次。
  6. 振荡后，在最大转速（> 12,000 × g）、4 °C条件下离心10分钟。
  7. 涡旋后，将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中。此即为核组分。

6. 蛋白质定量

注意：使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质检测试剂盒对蛋白质进行定量。各组分中的蛋白质浓度范围为 0.5 至 5 µg/µL，在核组分中浓度较低（参见表 2中由 2 mg 活检样本所得的蛋白质浓度）。

  1. 使用以下牛血清白蛋白（BSA）含量（µg）12制备标准曲线：0-0.5-1-2-3-4-5-6。
  2. 准备所需试剂，使每个样品使用100 µL最终BCA混合液。
  3. 将每种蛋白质组分各2 µL移入96孔板中，加入BCA混合液，并按照制造商说明进行读数操作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图1 显示一段肠活检切片的苏木精-伊红染色结果，可见完整的绒毛和隐窝结构。

使用本方案进行细胞核与细胞质分馏的代表性结果如图2和图3所示。在图2所示实验中，一份新鲜（Fh）和一份冷冻（Fz）的活检组织同时按照本方案进行分馏，并对每份样品取20 μg进行Western blot分析。表2列出了各组分及活检组织中的蛋白浓度，新鲜与冷冻组织之间的蛋白浓度差异不大。从2 mg活检组织中提取的蛋白产量在细胞质组分中约为3–4 µg/µL，在细胞核组分中约为1.5 µg/µL。为检测各组分纯度，使用HSP90和微管蛋白（tubulin）作为细胞质对照，HDAC1和H3作为细胞核对照13。可见HSP9...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方案用于肠道活检组织的细胞核与细胞质组分分离。所获得的纯化蛋白未发生变性，不仅可用于蛋白质印迹分析（如图 2和3所示），还可用于需要天然折叠蛋白的实验，例如免疫沉淀、电泳迁移率变动分析（EMSA）或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

该方法依赖于组织的机械匀浆结合渗透裂解，以破坏细胞膜而不影响核膜。其结果是实现细胞质蛋白和核蛋白的有效分离，可用于后续分析。在操作过程中，必须通过添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂来控制蛋白质的降解。此外，如果提取的蛋白质将用于后续功能检测，则还必须避免样品发生变性或蛋白水解。所有操作应在 4 °C 下进行，且缓冲液中也应加入 PMSF。

本方案中描述的操作步骤简单且经济实惠，样品处理时间极短。本方案不受处理时间过长和使用昂贵的组分分离试剂盒等问题的限制。

新鲜和冷冻的组织活检均可用于本方案，其中冷冻活检可获得较为纯净且可重复的组分分离结...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Ander Lopez和Miren Telletxea在视频录制与编辑方面提供的协助。ACR由Ikerbasque基金会项目及马德里乳糜泻协会（ACM）的研究项目资助。JRB由ISCIII-PI16/00258项目资助，并由欧洲联盟区域发展基金（ERDF）/欧洲社会基金（ESF）“迈向欧洲之路”计划共同资助。IS由巴斯克卫生部研究项目资助（项目编号：2015111068）。IRG和AJM分别获得巴斯克大学（UPV/EHU）和巴斯克教育部的博士前奖学金资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPESSigma AldrichH4034-1kg
KClSigma AldrichP9333-1kg
EDTASigma AldrichE9884-100G
NaClSigma Aldrich5588886-1kg
DTTSigma Aldrich10197777001
PMSFThermo Scientific36978
蛋白酶和磷酸酶抑制剂Thermo ScientificA32959
NP-40 Sigma AldrichCA-630去垢剂
BCA 法检测试剂盒Thermo Scientific23227蛋白质定量试剂盒
一次性塑料研磨棒Sigma AldrichZ359947-100EA
达恩斯玻璃匀浆器VWR431-0100
微量离心机Eppendorf5415-R
振荡器IKAMS3 basic

参考文献

  1. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
  2. Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
  3. Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
  4. Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
  5. Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
  6. Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
  7. Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
  8. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  9. Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
  10. Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
  11. Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
  12. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
  13. McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
  14. Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

HSP90
新鲜与冷冻胃肠道标本的亚细胞组分分离
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。