本文以中国台湾地区最常见的地方性突变 Ala97Ser 为例，介绍一种用于确诊遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的点突变检测方案。
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摘要
摘要
基因检测是遗传性转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性的最可靠检测方法，在大多数转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）病例中均应进行。ATTR是一种罕见但致命的疾病，具有异质性表型，因此诊断有时会被延误。随着对ATTR早期表现的关注日益增加、认识不断扩展，以及新型治疗方法的出现，开展包括转甲状腺素蛋白（TTR）基因检测在内的适当诊断检查，以明确ATTR的类型和变异形式，对于改善预后至关重要。采用聚合酶链式反应（PCR）方法进行基因分析，相较于Southern印迹等传统方法，能够更快速、更安全地确认TTR点突变的存在。本文展示了ATTR Ala97Ser突变的基因确诊过程，该突变为在中国台湾地区最常见的地方性突变。本方案包含四个主要步骤：采集全血标本、DNA提取、通过PCR对全部四个TTR外显子进行基因分析，以及DNA测序。
引言
转甲状腺素蛋白（TTR）淀粉样变性（ATTR）是遗传性系统性淀粉样变性中最常见的类型1，可由转甲状腺素蛋白（TTR）基因的常染色体显性遗传突变引起2。TTR突变会破坏四聚体蛋白结构的稳定性，导致其解离为单体，进而重组成淀粉样纤维2。全球已报道超过100种致淀粉样变性的TTR突变1。采用聚合酶链式反应（PCR）方法进行基因分析可确认TTR点突变的存在，相较于Southern印迹法，其优势包括无需操作放射性标记探针3。PCR是一种 快速、简便、经济且可靠的技術，已广泛应用于现代科学的众多领域4。
由于该疾病具有表型异质性，其进行性且致命的早期诊断颇具挑战。随着对ATTR早期表现的关注日益增加以及认识不断深入，加之新兴治疗方法的出现5，开展包括TTR基因检测在内的恰当诊断检查对于改善预后至关重要。此外，不同的突变与不同的外显率、发病年龄、进展模式、疾病严重程度、中位生存期、肝移植疗效或TTR稳定剂的效果2,6，以及神经系统和心脏受累程度的差异密切相关，这些因素对遗传咨询具有重要意义7,8,9。此外，高精度的基因检测是唯一能够区分两种不同类型ATTR的方法：遗传性（突变型）和野生型（非突变型，即老年系统性淀粉样变性，SSA）7。明确ATTR类型至关重要，因为不同类型的治疗方法差异显著2。因此，逐步描述TTR基因检测的操作流程变得愈发必要。
将以 Ala97Ser 为例说明检测突变的分子方法，该突变是中国台湾最常见的地方性突变。DNA 提取步骤的改进减少了所用三种溶液的用量，同时仍能获得足量的 DNA。本方案中分析了所有四个 TTR 外显子，而包含 5' 上游区、3' 下游区、启动子、内含子和非翻译区（UTR）的区域未进行测序。
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方案
实验室进行的检测均依照1988年《临床实验室改进修正案》（CLIA）的要求，以及长庚纪念医院及大学机构审查委员会批准的规范（许可证编号：100-4470A3 和 104-2462A3）执行。所有患者均签署了知情同意书。
1. 血液标本采集
- 将全血采集至市售的EDTA抗凝管中。轻柔混匀，并将血液样本置于4 °C保存直至处理。
2. 从外周血中提取DNA
使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA（参见材料表）。
- 向4.0 mL血液样本中加入10 mL溶液1，冰上孵育10分钟。
- 在4 °C条件下以2,000 × g离心5分钟，小心移除并弃去上清液。将沉淀物重悬于3 mL溶液1中。
- 再次在4 °C条件下以2,000 × g离心5分钟，并弃去上清液。将沉淀物重悬于3 mL溶液2中。
- 加入10 µL蛋白酶原储备液（225 mg/mL），使终浓度为100 µg/mL，充分混匀。37 °C过夜孵育。
- 将离心管置于冰上冷却10分钟。向样本中加入0.8 mL溶液3，颠倒混匀3–5次。将样本置于冰上5分钟。
- 在4 °C条件下以3,000 × g离心15分钟。小心将上清液转移至一个新的15 mL无菌锥形离心管中。
- 加入6 µL RNase储备液（10 mg/mL），使终浓度为20 µg/mL。37 °C孵育15分钟。
- 加入2.5 mL异丙醇，通过轻轻颠倒数次彻底混匀以沉淀DNA（将形成白色絮状丝状物）。使用宽口移液器将DNA沉淀转移至新的1.5 mL离心管中。
- 在4 °C条件下以12,000 × g离心3分钟，小心弃去上清液。加入500 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。
- 在4 °C条件下以12,000 × g离心1分钟，弃去上清液。在室温下将DNA沉淀空气干燥。加入100 µL ddH2O，65 °C孵育15分钟以重悬DNA。
3. 基因组DNA定量
使用分光光度计（参见材料表）检测基因组DNA的含量和质量。
- 登录连接到分光光度计的计算机，打开软件。
- 初始化分光光度计：
- 在分光光度计软件中点击 "Nucleic Acid"。
- 使用一次性纸巾和纯水清洁样品台。
- 对分光光度计进行空白校准：
- 在样品台上加入 2 µL 纯水。
- 放下分光光度计的上臂，点击 "Blank" 进行校准。
- 校准完成后，抬起上臂，并用纸巾将样品台擦干。
- 测量样品：
- 在“Sample Type”中点击 "DNA-50"。
- 在样品台上加入 2 µL DNA 样品。
- 放下上臂，点击 "Measure"，以测定样品的 A260/A280 比值及其浓度。
- 每次测量之间，使用纸巾和纯水清洁样品台。
- 点击 "Print Screen" 以保存数据。
4. 突变的遗传学分析
使用PCR扩增目标DNA4。采用DNA聚合酶试剂盒（见材料表），在25 µL反应体系中进行PCR反应。表1列出了TTR基因内含子引物。
| 基因 | 引物序列 |
| Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ |
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ |
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ |
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ |
表1. TTR基因内含子引物。（NCBI参考序列：NC_000018.10）
- 将 表2 中的试剂加入一个 0.2 mL 的 PCR 管中。
| 组分 | 体积 (µL) | 终浓度 |
| 10x 缓冲液 | 2.5 | 1x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1.5 mM |
| 360 GC 增强剂 | 1 | - |
| 360 DNA 聚合酶 | 0.2 | 2 U/反应 |
| dNTP 混合液 (每种 25 mM) | 2 | 每种 2 mM |
| 引物 F (10 µM) | 1 | 0.4 µM |
| 引物 R (10 µM) | 1 | 0.4 µM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR 级水 | 13.8 | - |
| 总体积 | 25 | - |
表2. PCR反应条件。
- 轻轻混匀，并在台式离心机上短暂离心，以使所有组分沉降至管底。将管子放入热循环仪中。
- 进行30个循环的PCR反应。每个循环包括：94 °C下变性30秒，58 °C下引物退火30秒，以及72 °C下聚合酶延伸45秒（见表3）。
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 | 循环 |
| 初始变性 | 95 | 5 分钟 | 1 |
| DNA 变性步骤 | 94 | 30 秒 | 30 个循环 |
| 引物退火步骤 | 58 | 30 秒 | 30 个循环 |
| 聚合酶延伸步骤 | 72 | 45 秒 | 30 个循环 |
| 终延伸步骤 | 72 | 10 分钟 | 1 |
| PCR 循环结束 | 4 | 无限期 |
表3. 扩增PCR产物的循环条件。
- 通过凝胶电泳观察验证PCR产物：
- 制备1.2%琼脂糖凝胶：
- 将1.2 g琼脂糖粉末与100 mL 0.5×TBE缓冲液混合于可微波加热的烧瓶中，微波加热2分钟，直至琼脂糖完全溶解。将琼脂糖混合物冷却至55 °C。
- 向琼脂糖混合物中加入2 µL溴化乙锭溶液（10 mg/mL），轻轻混匀。将琼脂糖混合物倒入凝胶托盘中，厚度约为5–7 mm，插入梳子。静置使其凝固（至少30分钟），然后小心移除梳子。
- 上样并进行琼脂糖凝胶电泳：
- 将凝胶及托盘放入电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液至完全浸没凝胶。
- 将2 µL 100 bp DNA Marker（参见材料表）小心加入凝胶的一个泳道中作为分子量标准。将染料/样品混合物（5 µL PCR产物与1 µL 6× 上样染料混合）加入其余泳道。
- 打开电源，以100 V电压电泳25分钟。
- 从电泳槽中取出凝胶，使用成像系统在紫外光下观察DNA条带。
- 制备1.2%琼脂糖凝胶：
5. DNA测序
- 使用商业试剂盒纯化PCR产物，并通过商业服务或自动测序仪进行测序（参见材料表）。
- 将核苷酸序列提交至NCBI BLAST服务器，以将核苷酸查询序列与核苷酸数据库进行比对10。结果显示后，进行序列比对并鉴定预期的突变。
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结果
两名患者和一名健康个体的琼脂糖凝胶电泳结果显示了预期大小的条带，包括TTR基因第4外显子的454 bp PCR产物（图1）。
图1．凝胶电泳显示PCR扩增的TTR基因。 正常：健康个体。泳道M：100 bp DNA Ladder作为分子大小标记。泳道1：246 bp（外显子1）。泳道2：292 bp（外显子2）。泳道3：299 bp（外显子3）。泳道4：454 bp（外显子4）。
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讨论
本方案中有两个关键步骤。首先，为了获得足够数量的白细胞，应避免使用血液稀释的标本11。其次，使用合适的PCR引物是获得可靠结果的基础12。我们使用Primer-BLAST在线工具设计引物4,13，应覆盖转甲状腺素蛋白（TTR）四个外显子两侧各至少40个碱基对的区域。此外，我们还在NCBI上运行BLAST以验证引物的特异性。
在DNA提取步骤中进行了若干修改。首先，所用三种溶液的用量有所减少。该修改同样能够获得足够的DNA量，同时节省试剂。其次，在DNA沉淀过程中可选用异丙醇或100%乙醇作为两种替代方案14,15。与乙醇相比，异丙醇可在室温下沉淀DNA，从而减少盐类的共沉淀15。此外，为了最大化DNA得率，在...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢吴欣芳女士在实验中提供的帮助。本研究得到了台湾长庚医学研究计划（CMRPG3C0371、CMRPG3C0372、CMRPG3C0373）以及IRB 100-4470A3、104-2462A3的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA处理管 | BD | ||
| DNA提取试剂盒 | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| 精密实验擦拭纸 | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA聚合酶试剂盒 | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR基因内含子引物 | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| PCR扩增仪 | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| 电泳槽 | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA分子量标准 | Protech | PT-M1-100 | |
| 染料 | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| 自动测序仪 | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
参考文献
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