本文以中国台湾地区最常见的地方性突变 Ala97Ser 为例，介绍一种用于确诊遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的点突变检测方案。
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本文内容
摘要
摘要
基因检测是遗传性转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性的最可靠检测方法，在大多数转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）病例中均应进行。ATTR是一种罕见但致命的疾病，具有异质性表型，因此诊断有时会被延误。随着对ATTR早期表现的关注日益增加、认识不断扩展，以及新型治疗方法的出现，开展包括转甲状腺素蛋白（TTR）基因检测在内的适当诊断检查，以明确ATTR的类型和变异形式，对于改善预后至关重要。采用聚合酶链式反应（PCR）方法进行基因分析，相较于Southern印迹等传统方法，能够更快速、更安全地确认TTR点突变的存在。本文展示了ATTR Ala97Ser突变的基因确诊过程，该突变为在中国台湾地区最常见的地方性突变。本方案包含四个主要步骤：采集全血标本、DNA提取、通过PCR对全部四个TTR外显子进行基因分析，以及DNA测序。
引言
转甲状腺素蛋白（TTR）淀粉样变性（ATTR）是遗传性系统性淀粉样变性中最常见的类型1，可由转甲状腺素蛋白（TTR）基因的常染色体显性遗传突变引起2。TTR突变会破坏四聚体蛋白结构的稳定性，导致其解离为单体，进而重组成淀粉样纤维2。全球已报道超过100种致淀粉样变性的TTR突变1。采用聚合酶链式反应（PCR）方法进行基因分析可确认TTR点突变的存在，相较于Southern印迹法，其优势包括无需操作放射性标记探针3。PCR是一种 快速、简便、经济且可靠的技術，已广泛应用于现代科学的众多领域4。
由于该疾病具有表型异质性，其进行性且致命的早期诊断颇具挑战。随着对ATTR早期表现的关注日益增加以及认识不断深入，加之新兴治疗方法的出现5，开展包括TTR基因检测在内的恰当诊断检查对于改善预后至关重要。此外，不同的突变与不同的外显率、发病年龄、进展模式、疾病严重程度、中位生存期、肝移植疗效或TTR稳定剂的效果2,6，以及神经系统和心....
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方案
实验室进行的检测均依照1988年《临床实验室改进修正案》（CLIA）的要求，以及长庚纪念医院及大学机构审查委员会批准的规范（许可证编号：100-4470A3 和 104-2462A3）执行。所有患者均签署了知情同意书。
1. 血液标本采集
- 将全血采集至市售的EDTA抗凝管中。轻柔混匀，并将血液样本置于4 °C保存直至处理。
2. 从外周血中提取DNA
使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA（参见材料表）。
- 向4.0 mL血液样本中加入10 mL溶液1，冰上孵育10分钟。
- 在4 °C条件下以2,000 × g离心5分钟，小心移除并弃去上清液。将沉淀物重悬于3 mL溶液1中。
- 再次在4 °C条件下以2,000 × g离心5分钟，并弃去上清液。将沉淀物重悬于3 mL溶液2中。
- 加入10 µL蛋白酶原储备液（225 mg/mL），使终浓度为100 µg/mL，充分混匀。37 °C过夜孵育。
- 将离心管置于冰上冷却10分钟。向样本中加入0.8 mL溶液3，颠倒混匀3–5次。将样本置于冰上5分钟。
- 在4 °C条件下以3,000 × g离心15分钟。小心将上清液转移至一个新的15 mL无菌锥....
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结果
两名患者和一名健康个体的琼脂糖凝胶电泳结果显示了预期大小的条带，包括TTR基因第4外显子的454 bp PCR产物（图1）。
图1．凝胶电泳显示PCR扩增的TTR基因。 正常：健康个体。泳道M：100 bp DNA Ladder作为分子大小标记。泳道1：246 bp（外显子1）。泳道2：292 bp（外显子2）。泳道3：299 bp（外显子3）。泳道4：454 bp（外显子4）。
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讨论
本方案中有两个关键步骤。首先，为了获得足够数量的白细胞，应避免使用血液稀释的标本11。其次，使用合适的PCR引物是获得可靠结果的基础12。我们使用Primer-BLAST在线工具设计引物4,13，应覆盖转甲状腺素蛋白（TTR）四个外显子两侧各至少40个碱基对的区域。此外，我们还在NCBI上运行BLAST以验证引物的特异性。
在DNA提取步骤中进行了若干修改。首先，所用三种溶液的用量有所减少。该修改同样能够获得足够的DNA量，同时节省试剂。其次，在DNA沉淀过程中可选用异丙醇或100%乙醇作为两种替代方案14,15。与乙醇相比，异丙醇可在室温下沉淀DNA，从而减少盐类的共沉淀15。此外，为了最大化DNA得率，在.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢吴欣芳女士在实验中提供的帮助。本研究得到了台湾长庚医学研究计划（CMRPG3C0371、CMRPG3C0372、CMRPG3C0373）以及IRB 100-4470A3、104-2462A3的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA处理管 | BD | ||
| DNA提取试剂盒 | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| 精密实验擦拭纸 | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA聚合酶试剂盒 | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR基因内含子引物 | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| PCR扩增仪 | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| 电泳槽 | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA分子量标准 | Protech | PT-M1-100 | |
| 染料 | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| 自动测序仪 | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
参考文献
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264
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