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方法文章

利用单细胞记录研究猕猴背侧视觉通路中的物体表征

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DOI：

10.3791/57745

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2018年8月1日

 ,  , 
1Laboratorium voor Neuro-en Psychofysiologie, Katholieke Universiteit Leuven, 2The Leuven Brain Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细的研究方案，用于分析参与视觉运动转换的顶叶-额叶神经元对物体的选择性。

摘要

先前的研究表明，猕猴大脑顶叶-额叶区域的神经元对真实物体、由视差定义的曲面以及真实物体的图像（无论是否包含视差信息）具有高度选择性，这种选择性与腹侧视觉通路中所描述的特性相似。此外，顶叶-额叶区域被认为能够将视觉物体信息转化为适当的运动输出，例如在抓握过程中手部的预先成形。为了更深入地表征参与视觉-运动转换的皮层网络中神经元对物体的选择性，我们提供了一系列测试方法，旨在分析顶叶-额叶区域神经元的视觉物体选择性。

引言

人类和非人灵长类动物都具有执行复杂运动行为的能力，包括抓握物体。为了成功完成这些任务，我们的大脑需要将物体的内在属性转化为运动指令。这一转化过程依赖于位于顶叶和腹侧前运动皮层的一系列复杂的背侧皮层区域1,2,3（图1）。

通过在猴子和人类中进行的病灶研究4,5，我们了解到背侧视觉通路——起源于初级视觉皮层并投射至后顶叶皮层——参与空间视觉以及运动行为的规划。然而，背侧通路中的大多数脑区并非专门负责某一种特定的信息处理。例如，位于背侧视觉通路末端阶段的前内侧顶叶区（AIP）包含多种神经元，其不仅在抓握动作期间放电6,7,8，也在对物体进行视觉观察时放电7,8,9,10。

与AIP类似，位于腹侧运动前区皮层（PMv）的F5区域的神经元在视觉注视和抓握物体时也会产生反应，这可能对将视觉信息转化为运动动作具有重要意义11。该区域的前部（亚区F5a）包含对三维（3D，由视差定义）图像选择性响应的神经元12,13，而位于凸面部的亚区（F5c）则包含具有镜像特性的神经元1,3，这些神经元在动物执行或观察动作时均会放电。最后，F5区域的后部（F5p）是一个与手部相关的区域，其中大部分为视觉-运动神经元，对三维物体的观察和抓握均有响应14,15。紧邻F5的45B区位于弓状沟下支，也可能参与物体形状处理16,17和抓握行为18。

在顶叶和额叶皮层中测试物体选择性具有挑战性，因为难以确定这些神经元响应的特征以及这些神经元的感受野范围。例如，若一个神经元对盘子有反应而对圆锥体无反应，那么驱动这种选择性的究竟是物体的哪种特征：二维轮廓、三维结构、深度方向，还是多种不同特征的组合？为了确定在物体注视和抓握过程中有反应的神经元所依赖的关键物体特征，有必要采用多种视觉测试方法，利用物体图像及其简化版本的图像进行研究。

AIP和F5中相当一部分神经元不仅在动物看到物体时产生反应，而且在黑暗中抓握该物体时也会产生反应（即， 在缺乏视觉信息的情况下，此类神经元可能不会对无法抓握的物体图像产生反应。因此，这些区域神经元反应的视觉与运动成分密切相关，这使得研究这些区域中的神经元物体表征变得困难。由于视觉-运动神经元只能通过真实物体进行测试，若要确定哪些特征对这些神经元至关重要，就需要一个能够灵活地在视野内不同位置和不同朝向呈现多种物体的系统。后者只能借助能够在视觉空间中于不同位置呈现不同物体的机器人系统来实现。

本文旨在为对顶额叶神经元研究感兴趣的科研人员提供一份实验指南。在接下来的章节中，我们将介绍本实验室用于分析清醒猕猴（Macaca mulatta）抓握动作及视觉物体反应的通用实验方案。

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方案

所有技术操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》和欧盟指令2010/63/EU的要求进行，并经鲁汶大学伦理委员会批准。

1. 麻醉清醒猴进行细胞外记录的一般方法

  1. 训练动物执行视觉和运动任务，以解决您的特定研究问题。确保动物能够在同一记录会话期间灵活地在不同任务之间切换，以便对神经元进行充分测试，并更深入地理解驱动神经反应的特征（图 2-3）。 
    1. 训练动物执行视觉引导抓握任务（VGG；在“有光”条件下抓握），以评估反应中的视觉-运动成分。注意：无论选择何种任务，均需在训练阶段开始前至少三天逐步限制液体摄入量。 
      1. 在整个实验过程中固定猴子的头部。
      2. 在最初几次训练中，将记录腔对侧的手保持在静息位置，并协助动物完成伸手抓取物体的动作，每次尝试后给予手动奖励。
      3. 每次试验结束后，将猴子的手放回静息位置。
      4. 每隔几次试验，松开猴子的手，等待数秒，观察动物是否自发启动动作。
      5. 当猴子向物体伸手时，立即给予奖励。
      6. 当伸手阶段已正确掌握后，协助动物抬起（或拉动）物体，并手动给予奖励。
      7. 与步骤 1.1.1.4 和 1.1.1.5 相同，松开猴子的手，等待数秒，观察动物是否自发启动动作。当动作正确执行时给予奖励。
      8. 在操作过程中，根据需要多次纠正伸手动作、手部位置和腕关节朝向。
      9. 重复上述步骤，直至动物能够自动完成整个动作序列。
      10. 加载自动任务程序。当动物在预定时间内完成伸手和抓握动作时，系统将自动给予奖励。
      11. 逐步延长物体的持握时间。
      12. 引入激光，在物体基部投射注视点。随后添加眼动追踪设备，以监测动物在抓握目标物体时的眼球位置。 
    2. 训练动物执行记忆引导抓握任务（MGG），以研究不受刺激视觉成分影响的运动反应成分。
      1. 固定猴子的头部。
      2. 按照 VGG 的相同步骤进行训练，确保动物在整个任务过程中将视线维持在激光注视点上，且眼球位置处于电子定义的窗口范围内。在此任务版本中，光照在注视期结束时关闭。
    3. 训练猴子执行被动注视任务，以研究其视觉反应性和形状选择性。 
      1. 固定猴子的头部。
      2. 使用 CRT 显示器（三维刺激的被动注视）或 LCD 显示器（二维刺激的被动注视）向猴子呈现视觉刺激。
      3. 在屏幕中央呈现一个注视点，叠加在视觉刺激之上。
      4. 每次刺激呈现后奖励动物，并逐步延长注视时间，直至达到任务标准。
  2. 使用无菌器械、铺巾和手术服进行手术。
    1. 使用氯胺酮（15 mg/kg，肌内注射）和盐酸美托咪啶（0.01–0.04 mL/kg，肌内注射）对动物实施麻醉，并定期通过检查动物对刺激的反应、心率、呼吸频率和血压来确认麻醉状态。 
    2. 维持全身麻醉（丙泊酚 10 mg/kg/h，静脉输注），并通过气管插管供氧。使用含羊毛脂的眼膏防止麻醉期间角膜干燥。
    3. 使用 0.5 cc 布托啡诺（0.3 mg/mL，静脉注射）提供镇痛。若术中心率升高，可追加剂量。 
    4. 植入与 MRI 兼容的头部固定装置，使用陶瓷螺钉和牙科丙烯酸树脂固定。所有可存活手术均须在严格无菌条件下进行。为维持无菌区域，使用一次性无菌手套、口罩和无菌器械。 
    5. 根据解剖磁共振成像（MRI；Horsley-Clark 坐标）引导，在目标脑区上方开颅，并将记录腔植入猴子颅骨。使用标准记录腔进行单细胞胞外记录，或使用多电极微驱动装置实现多个神经元的同时记录。
    6. 手术后停止静脉输注丙泊酚，直至自主呼吸恢复。在动物恢复意识前不得离开其身边，且仅在完全康复后方可将其重新引入社交群体。
    7. 根据机构兽医建议提供术后镇痛；例如使用美洛昔康（5 mg/mL，肌内注射）。
    8. 手术后等待 6 周再开始实验。这有助于头部固定装置更好地锚定于颅骨，并确保动物已完全从手术中恢复。
  3. 使用 MRI（用于单细胞胞外记录）和计算机断层扫描（CT；用于多电极记录）定位记录区域。
    1. 将 2% 硫酸铜溶液注入玻璃毛细管，并将其插入记录网格中。
    2. 进行结构 MRI 扫描（层厚：0.6 mm）。 
  4. 监测 神经活动。
    1. 使用阻抗为 0.8 – 1 MΩ 的钨微电极。
    2. 通过 23G 不锈钢引导管和液压微驱动器将电极穿过硬脑膜。 
    3. 用于动作电位鉴别时，将神经信号放大并滤波于 300 至 5,000 Hz 范围内。 
    4. 用于局部场电位（LFP）记录时，将信号放大并滤波于 1 至 170 Hz 范围内。
  5. 监测眼动信号
    1. 在动物眼睛前方调整红外相机，以获得清晰的瞳孔和角膜反射图像。 
    2. 使用基于红外的相机以 500 Hz 的频率采样瞳孔位置。

2. 研究背侧区域的物体选择性 

  1. 执行视觉引导抓握（VGG）。
    1. 根据研究目标选择合适的抓握装置：转盘装置或机器人装置（图3）。 
    2. 对于转盘装置，运行VGG任务：
      1. 让猴子将与记录半球对侧的手置于完全黑暗中的静息位置，以启动序列。 
      2. 经过一段可变时间（试次间间隔：2,000–3,000 ms）后，在物体基部施加一束红激光（注视点）（距离：距猴子眼睛28 cm）。如果动物在电子定义的注视窗口内（±2.5°）保持注视达500 ms，则从上方用光源照亮物体。 
      3. 经过一段可变延迟（300–1500 ms）后，程序控制红激光变暗（视觉“开始”提示），指示猴子将手从静息位置抬起，伸向、抓握并持握物体一段可变时间（持握时间：300–900 ms）。 
      4. 每当动物正确完成整个序列时，给予一滴果汁作为奖励。
    3. 对机器人装置使用类似的试验序列。
      1. 与转盘装置相同，让猴子将与记录半球对侧的手置于完全黑暗中的静息位置，以启动序列。 
      2. 经过一段可变时间（试次间间隔：2,000–3,000 ms）后，点亮物体上的LED（注视点）（从内部发光；距离：距猴子眼睛28 cm）。同样，如果动物在电子定义的注视窗口内（±2.5°）保持注视达500 ms，则从内部用白光源照亮物体。
      3. 经过一段可变延迟（300–1500 ms）后，关闭LED（视觉“开始”提示），指示猴子将手从静息位置抬起，伸向、抓握并持握物体一段可变时间（持握时间：300–900 ms）。 
      4. 每当动物正确完成整个序列时，给予一滴果汁作为奖励。
    4. 在任务过程中量化猴子的表现，特别注意时间参数。测量“开始”信号与手部运动起始之间的时间间隔（反应时间），以及运动起始与物体被提起之间的时间间隔（抓握时间）。
  2. 执行记忆引导抓握（MGG；“在黑暗中抓握”）。使用MGG任务判断神经元属于视觉运动型还是以运动为主导型。 
    ​注意：该序列与VGG所述相似，但物体是在完全黑暗中被抓握的。
    1. 与VGG任务相同，让猴子将与记录半球对侧的手置于完全黑暗中的静息位置，以启动序列。 
    2. 经过一段可变时间（试次间间隔：2,000–3,000 ms）后，施加红激光/LED（注视点）以指示注视点位置（在转盘装置中位于物体基部，在机器人装置中位于物体中心；距离：距猴子眼睛28 cm）。如果动物在电子定义的注视窗口内（±2.5°）保持注视达500 ms，则照亮物体。
    3. 经过固定时间（400 ms）后，关闭光源。 
    4. 在光照关闭后经过一段可变延迟期（300–1500 ms），调暗/关闭注视点（“开始”提示），指示猴子抬起手并伸向、抓握和持握物体（持握时间：300–900 ms）。  
    5. 每当动物正确完成整个序列时，给予一滴果汁作为奖励。 
  3. 执行被动注视任务。与VGG任务相同，根据研究目标选择最合适的装置（转盘或机器人装置）。 
    ​注意：可执行两种不同的被动注视任务：对真实世界物体的被动注视（使用转盘和机器人装置中的待抓握物体）以及对物体的三维/二维图像的被动注视。
    1. 执行对真实世界物体的被动注视。 
      1. 呈现注视点（转盘装置使用投射在物体基部的红色激光，机器人装置使用红色LED）。
      2. 如果动物在电子定义的注视窗口内（±2.5°）保持注视达500 ms，则照亮物体2,000 ms。 
      3. 如果动物在窗口内保持注视达1,000 ms，则给予一滴果汁作为奖励。 
    2. 执行对物体三维/二维图像的被动注视。
      1. 使用显示器（分辨率为1,280 × 1,024像素）在黑色背景（亮度为8 cd/m2）上呈现所有视觉刺激，显示器配备快速衰减P46荧光粉，刷新率为120 Hz（观看距离：86 cm）。
      2. 在三维测试中，通过显示器（CRT显示器）交替呈现左眼和右眼图像，并结合两个铁电液晶快门，以立体方式呈现刺激。将这些快门置于猴子眼睛前方，以60 Hz运行，并与显示器的垂直回扫同步。 
      3. 通过在屏幕中央呈现一个小方块（注视点；0.2° × 0.2°）开始试验。如果眼位在电子定义的1°方形窗口内（远小于真实物体任务中的窗口）保持至少500 ms，则在屏幕上呈现视觉刺激，总持续时间为500 ms。 
      4. 当猴子在刺激消失前保持稳定注视时，给予一滴果汁作为奖励。 
      5. 为了充分研究形状选择性，在被动注视任务中按以下顺序运行一系列全面的二维图像测试。
      6. 运行搜索测试。使用一组广泛的图像（表面图像；图4A）测试细胞的视觉选择性，包括在VGG中抓握的物体的图像。在此及所有后续视觉任务中，比较引发最强反应的图像（称为“偏好图像”）与神经元反应较弱的第二幅图像（称为“非偏好图像”）。如果所研究的神经元也对物体图像产生反应，则进一步寻找驱动该细胞反应的特定刺激成分（轮廓测试、感受野测试和简化测试）。
      7. 运行轮廓测试。从真实物体的原始表面图像（包含纹理、阴影和透视的二维或三维图像）出发，逐步生成同一刺激形状的简化版本（剪影和轮廓；图4B）。每种条件至少收集10次试验，以确定神经元是否更偏好原始表面、剪影或原始形状的轮廓。
      8. 运行感受野（RF）测试。为绘制神经元的感受野，将物体图像呈现在显示器的不同位置（本实验中为35个位置；刺激大小为3°），覆盖中央视觉区域19,20。为了在合理时间内收集所有可能位置上的足够刺激重复次数，缩短刺激持续时间（闪现刺激；刺激持续时间：300 ms，试次间间隔：300 ms）。
      9. 运行简化测试。在感受野中心呈现轮廓片段，进行简化测试，以识别最小有效形状特征（MESF）。在Photoshop中沿主轴裁剪每个原始轮廓形状的轮廓，生成一组刺激图像（图3B）。将MESF定义为能够引发至少为完整轮廓反应70%的反应、且反应幅度无显著减小的最小形状片段8。 
      10. 为进一步准确估计位置依赖性（刺激位置对片段选择性的影响），运行两种不同的测试：一种是将片段置于原始轮廓形状中的原始位置进行简化测试；另一种是将片段置于形状的质心位置进行简化测试。 
      11. 在此阶段，使用MESF重新进行一次感受野定位。

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结果

图5展示了从F5p区域记录到的一个示例神经元对四种物体的反应：两种不同形状——球体和圆板——每种形状又分为两种不同尺寸（6 cm和3 cm）。该神经元不仅对大尺寸球体（最适刺激；左上图）有反应，也对大尺寸圆板有反应（左下图）。相比之下，对较小物体的反应较弱（右上和右下图）。

图6展示了一个在AIP区记录到的神经元示例，该神经元在VGG任务和被动注视任务中均进行了测试。该神经元不仅在抓握过程中有反应（VGG任务，图A），而且在屏幕上呈现物体的二维图像时也有反应（被动注视任务，包括抓握任务中所用物体的图片；图6B）。需要注意的是，在被动注视任务中该神经元的偏好刺激不一定是将要抓握的物体，而可能是动物此前并无抓握经验的另一种二维图像（例如橘子）。

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讨论

对背侧通路进行系统研究，需要谨慎选择行为任务和视觉测试：可根据该区域的具体特性，分别或联合采用视觉与抓握范式。

本文提供了 AIP 和 F5p 在应对部分视觉和运动任务时记录到的神经活动示例，但在其他额叶区域（如 45B 区和 F5a）也可观察到非常相似的反应。

我们提出两种实验装置，用于研究抓握过程中物体的神经表征。使用一个垂直旋转的转盘（图3A可容纳多达六个物体的旋转转盘使我们能够向猴子呈现不同的物体。该旋转转盘可用于呈现不同的目标物体（在形状、大小、体积上各不相同） 等等。），需要采用不同的抓握策略（用力抓握与精细抓握）。

在单细胞记录过程中呈现物体的第二种、更为复杂的方法是使用商用机械臂和夹持器（图3B）。在此情况下，机械臂通过抓取一个物体（图3B）并在完全黑暗中将其移...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Inez Puttemans、Marc De Paep、Sara De Pril、Wouter Depuydt、Astrid Hermans、Piet Kayenbergh、Gerrit Meulemans、Christophe Ulens 和 Stijn Verstraeten 在技术与行政支持方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抓取机器人GIBAS Universal RobotsUR-6-85-5-A配备夹持器的机械臂
转盘电机SiboniRD066/†20 MV6, 35x23 F02用于定制的垂直转盘系统的电机，可实现转盘的旋转
眼动仪SR ResearchEyeLink II以500 Hz采样率工作的红外摄像系统
滤波器Wavetek Rockland852电子滤波器可执行多种信号处理功能，用于去除信号中不需要的频率成分
前置放大器BAK ELECTRONICS, INC.A-1A-1型号前置放大器可降低输入电容和噪声干扰，并可用于检测金属微电极的阻抗
电极FHCUEWLEESE*N4G金属微电极（* = 阻抗，由研究人员选择）
CRT显示器Vision Research GraphicsM21L-67S01CRT显示器配备快速衰减P46荧光粉，工作刷新率为120 Hz
铁电液晶快门Display TechFLC Shutter Panel; LV2500P-OEM快门在猴子前方以60 Hz频率工作，并与显示器的垂直回扫同步

参考文献

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