使用旋转运动量化系统（REQS）测量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的运动水平

摘要

旋转运动定量系统（REQS）可通过旋转诱导黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行运动，同时测量动物所完成的活动量。本文中，我们提供了一步一步的详细方案，介绍如何使用REQS测量经历旋转运动处理的动物的活动水平。

摘要

Drosophila melanogaster 是运动生物学研究中的一个新兴模式生物。迄今为止，已有两种主要的运动系统被报道：Power Tower 和 Treadwheel。然而，尚缺乏一种用于量化运动干预所诱导的额外动物活动量的方法。旋转运动量化系统（Rotating Exercise Quantification System, REQS）填补了这一空白，可为接受旋转运动的动物提供活动量的测量指标。本实验方案详细介绍了如何利用 REQS 评估动物在旋转运动过程中的活动情况，并展示了可生成的数据类型。在此，我们演示了如何使用 REQS 来测量不同性别和品系在运动诱导活动中的差异。REQS 还可用于评估其他多种实验参数（如年龄、饮食或种群规模）对运动诱导活动的影响。此外，该系统还可用于比较不同运动训练方案的效果。重要的是，REQS 为不同品系之间的运动干预提供了标准化的可能性，使研究人员在需要时能够实现各组间相等的活动量。因此，REQS 是使用果蝇模型系统开展运动生物学研究的一项重要新资源，可与现有的运动系统相互补充。

引言

近年来，研究人员开始利用果蝇Drosophila melanogaster来研究运动生物学。D. melanogaster作为遗传学研究模型系统已有100多年的历史^1,2。然而，果蝇的研究贡献不仅限于遗传学，还涉及神经生物学、行为生物学和生理学等多个学科领域³。2009年，首个用于果蝇的运动装置——Power Tower被首次报道⁴。Power Tower利用了果蝇的负向趋地性反应。当受到扰动时，果蝇倾向于向上爬至容器顶部。这一反应已被广泛证实，也是常用的"RING"（快速迭代负向趋地性⁵）实验的基础，该实验用于评估果蝇的攀爬能力及/或身体素质。Power Tower通过连接电机单元的机械臂，反复将果蝇连同其容器抬高数英寸后迅速放下，从而诱发果蝇的负向趋地性反应（Tinkerhess et al. 2012⁶ 提供了展示Power Tower使用方法的视频）。长期使用Power Tower处理可显著增加果蝇的体力活动（奔跑或飞行）量，相较于未处理的对照组果蝇，其在RING实验中的体能表现随时间推移而改善⁴。因此，该研究证明了利用果蝇作为运动生物学模型的可行性。

为了拓展果蝇运动研究可用的工具集，2016年，Mendez 及其同事描述了第二种果蝇运动装置——Treadwheel⁷。与 Power Tower 类似，Treadwheel 利用果蝇的负向趋地性反应。然而，这种反应是通过持续旋转动物饲养舱来诱发的，而不是像 Power Tower 那样通过反复提升和下落饲养舱来实现。该诱导方式更为温和，能够实现一种更偏向耐力训练的运动模式，避免了在 Power Tower 中运动可能造成的身体创伤（参见 Katzenberger, R. J. et al. 2013⁸ 关于反复身体创伤对果蝇健康影响的研究）。与 Power Tower⁴ 相似，在 Treadwheel 上对果蝇进行运动干预可引发多种生理反应，包括体能、甘油三酯水平和体重的变化⁷。因此，目前已有两种互补的方法可供研究运动的果蝇生物学家使用。

功率塔和跑轮的共同局限性在于无法测量运动处理所诱导的活动量。对跑轮拍摄的视频记录进行分析表明，不同黑腹果蝇品系在对运动处理的响应方式上存在显著差异⁷。具体而言，这些品系在受到刺激后动物所进行的额外活动量有所不同⁷。这一观察结果促使我们开发了第三种运动系统——旋转运动量化系统（Rotating Exercise Quantification System, REQS），该系统可让我们在旋转诱导运动过程中测量动物的活动水平⁹。REQS利用一个市售的活动监测装置，将其安装在旋转臂上，通过旋转刺激动物运动，原理与跑轮类似。初步使用REQS的研究证实，遗传背景不同的黑腹果蝇品系以及不同性别个体对旋转刺激的反应可能存在显著差异，因此不同基因型间所诱导的运动量并不相同⁹。因此，REQS现使果蝇生物学家能够准确测量处理所诱导的运动量，为运动研究领域开辟了多种新的研究途径。

本文详细描述了如何使用旋转运动量化系统（REQS）对旋转运动进行定量分析。REQS 可诱导动物进行旋转运动，同时实时测量受处理动物的活动水平。该系统可适应多种运动方案，范围涵盖本文所演示的简单连续运动（如持续2小时运动），到 Mendez 及其同事⁷所述的更复杂的间歇训练方法；通过调节旋转速度（约每分钟1至13转），可实现对刺激强度的调整。根据用于构建 REQS 的活动监测装置的不同，该方法可适用于单只果蝇或大量动物群体的分析。由于具有高度的灵活性，REQS 为果蝇研究人员提供了广泛的研究机会，例如可用于研究不同的运动方案、饮食干预措施或种群密度的影响。

方案

REQS 由一个安装在旋转臂上的果蝇活动监测仪单元（有关来源信息，请参见材料表）组成，该旋转臂由一个电机单元控制（图1）。活动监测仪用于测定在给定时间范围内，穿过检测管中部的激光束阵列被中断的频率。详细的结构图和深入的性能表征请参见我们之前的发表文献⁹。尽管我们的系统使用的是 LAM25H 单元，但 REQS 也可进行改装以适配其他类型的果蝇活动监测仪单元。

1. 测试 REQS 的设置

1. 用CO₂麻醉动物后，将待测果蝇装入玻璃样品管中₂ 或其他选定的方法进行处理，将样本转移至空管中，并盖紧管盖。
2. 将带盖的玻璃样品管插入活动监测仪的插槽中。在装置两侧使用橡胶O形圈（17-18号）和/或橡皮筋固定样品管，确保样品管在旋转过程中不会移动：
   1. 将一个O形圈套入样本管，使其靠近管的中点位置。从前方将样本管插入活动监测仪的插槽中，并居中放置。
   2. 根据需要移动O形圈，并确保在样本管居中后，将O形圈尽可能滑动至靠近活动监测仪单元的位置。通过从后方将第二个O形圈套入玻璃管来固定样本管，并再次将O形圈尽可能移至靠近活动监测仪单元的位置。
3. 通过翻转设备正面的电源开关来启动 REQS 的旋转。使用设备正面的旋钮将旋转速度调节至所需速度（本示例中为 4 rpm（转/分钟））。
   注意：本示例中的转速选择是为了与先前已发表的研究保持一致⁷由于不同的转速会导致动物活动水平的差异，因此在启动一项新研究时，需针对特定的实验设置（基因型、运动持续时间、 等等可能需要。
   注意：必须确保试管正确放置，以免在旋转过程中与 REQS 装置底部发生摩擦。
4. 通过打开DAMSystem308软件，测试与果蝇活动监测仪配套的数据采集系统的连接情况，确保连接指示灯在多次旋转过程中保持绿色。软件将开始把数据记录到文本文件中 "monitorX" （若使用多个显示器，则X为显示器的编号）启动后立即开始。记录频率可在 "偏好设置" 标签；我们通常以5分钟为间隔进行记录。
5. 检查由 DAMSystem308 软件生成的文本文件，以确保数据连接正常工作。连接问题会导致数据缺失，即在 REQS 中所有位置的活动记录为 0 的时间点（参见 代表性结果 和 表2如果出现信号中断，请调整通往旋转电话插孔的数据连接线，因为在旋转过程中，该连接可能会松动或扭曲。我们发现，使用胶带固定连接处有助于防止此问题。

2. 动物准备

注：所有动物均在培养箱中的标准条件下饲养和测试（25 °C，60-70% 湿度，12 小时光照/12 小时黑暗循环），培养基为糖蜜/玉米粉培养基¹⁰。

1. 在计划实验的两周前，设置好具有可控个体密度的培养瓶以收集实验果蝇；通常每个培养瓶中放入7只雄性和10只雌性。在种群健康的情况下，单个培养瓶可在4天内收集到约15只处男雄蝇和15只雌蝇。根据实验所需个体数量调整培养瓶的数量；本实验室常规实验通常每种基因型需要10组，每组10只处男雄蝇和10只雌蝇（即每种基因型共100只雄蝇和100只雌蝇）。
   注意：可根据具体实验问题使用非处女蝇。若对非处女个体进行长期实验，爬行的幼虫可能干扰对活动水平的准确监测。
2. 在设置培养瓶一周后，移除亲代果蝇。
3. 从设置培养瓶后的第10天开始，从培养瓶中收集处女蝇，并按性别分开存放。
4. 收集足够数量的实验个体，并根据需要进行老化处理，本示例中为3天。
   注意：我们通常使用CO₂对果蝇进行麻醉以方便操作。已知CO₂处理后会对果蝇的活动水平产生持续较长时间的影响（例如，参见Bartholomew et al. 2015¹¹）。如果CO₂的影响会干扰后续实验或分析，可采用其他麻醉方法，如冰麻醉。

3. 使用 REQS 进行数据收集

1. 使用 CO₂ 或其他麻醉方法对用于运动量化研究的动物进行麻醉。根据需要将动物分组，并将各组动物装入活动监测仪的空玻璃管中；在此示例中，每根玻璃管中装入10只同龄动物，每种动物类型（性别/基因型）设置10个重复。务必记录每根管中所装入的动物类型。
   注意：对于较长时间的实验，可在样本管中加入食物。在此情况下，必须确保食物固定牢靠，在旋转过程中不会松动脱落。
2. 将玻璃检测管装入 REQS 装置，并用橡胶 O 形圈固定。若同时处理多种性别/基因型的动物，建议采用随机区组设计或对动物在 REQS 中的位置进行随机化，以消除潜在的位置效应。可通过为每个小瓶分配一个随机编号（例如使用基于网页的随机数生成器，例如 https://www.randomizer.org/，或在电子表格中生成）来实现随机化，然后根据随机编号排列小瓶顺序。
3. 将 REQS 装置放入培养箱中，以确保温度、湿度和光照条件恒定。确保数据线和电源线均已正确连接。
4. 让动物从麻醉状态中恢复，并在新环境中适应1小时。
5. 通过启动 REQS 以设定的转速开始旋转，从而开始实验。
   注意：另一种选择是先在旋转开始前收集动物的基础活动数据，随后再记录其对旋转刺激的活动水平变化。
6. 通过打开 DAMsystem308 软件开始数据采集（仅打开软件即自动开始采集数据）。数据将以设定的时间间隔（此处为5分钟）写入文本文件；如有需要，可在 "偏好设置" 选项卡中更改时间间隔设置（参见步骤1.4）。
7. 为确保数据成功传输至计算机，在经过一至两个时间间隔后，打开 DAMsystem308 软件生成的文本文件，确认数据正在被写入。可通过关闭并重新打开该文件查看后续时间点的数据。按所需时长持续采集数据；在此示例中为2小时。
   注意：在检测期间请勿打开培养箱，因为动物对外界干扰极为敏感，可能会表现出活动增加的反应。
8. 运动检测结束后，通过关闭 DAMsystem308 软件终止数据采集，然后关闭 REQS 装置。将动物从玻璃检测管中取出，并清洗检测管。若需在不同年龄阶段进行重复测量，可将动物转移回含食物的小瓶中。
   注意：若在运动处理过程中出现死亡个体，应予以记录，因为死亡果蝇的存在可能影响活动计数。根据我们对 DGRP2 果蝇品系^12,13 的经验，在4 rpm 转速下进行2小时运动未导致任何死亡，但较弱的品系可能反应不同。

4. 数据分析

1. 打开标记为的 .txt 文件 "监测器1" 由 DAMSystem308 软件生成。
2. 检查数据文件中是否存在数据采集过程中可能出现的问题（如遗漏的时间点， 等等。; 表1如有必要，可通过删除记录起始和结束处的数据点来对文件进行消减处理。
3. 使用您选择的统计软件（例如， R），分析收集的数据。若数据呈正态分布，计算描述性统计量并进行方差分析（ANOVA），以检验性别和基因型等因素的影响。若数据不符合正态分布，则采用非参数方法（如Kruskal-Wallis检验）进行组间比较。具体分析方法的选择取决于特定的科学问题和实验设计。

结果

使用 REQS 进行单次运行的输出结果是由 DAMSystem308 软件生成的数据表，默认情况下该文件将被标记为“Monitor1.txt”（示例见补充文件1）。此类数据表的节选如表1所示。每一列包含来自单个检测管的数据，而每一行则表示从实验开始（顶部）到结束（底部）每个时间间隔内测得的活动值。应监控前三个数据点，以防出现数据缺失（如表2中所示的情况），此时必须调整电缆。

图2 展示了比较四组遗传上不同的果蝇品系（DGRP2 品系 371、703、810 和 897）的实验结果^12,13）。针对这四个品系，按照方案部分所述，分别收集了十组各十只未交配的雌雄果蝇的十次重复测量数...

讨论

如代表性结果所示，REQS 能够准确测量运动中的果蝇的活动能力。REQS 具有良好的灵活性，可使研究人员探讨与运动生物学或运动干预相关的多种研究问题。本实验方案中有两个关键步骤需要特别注意。首先，必须测试 REQS 的设置，以确保数据能够从 REQS 正常传输至 DAMSystem308。如果设置不当，在旋转过程中数据线可能缠绕，有时由于磨损，REQS 与 DAMSystem308 之间的连接在旋转接头处会中断（尽管在几乎每天使用 REQS 的情况下，我们在两年内仅更换过一次连接器）。建议提前备好替换部件。其次，环境参数的一致性对实验成功至关重要。果蝇对噪音或振动非常敏感，因此在数据采集期间必须避免任何干扰。理想情况下，实验应在专用的培养箱中进行，且在实验运行期间不应打开或进入该培养箱。关注这两个关键步骤将确保从 REQS 获得高质量的数据。

虽然本文展示了如何利用REQS测量动物群体在2小时连续运动处理期间的活动情况，但REQS具有灵活性，可根据多种运动处理需求调整运动的时间和强度。此外，根据所使用的活动监测单元，该系统可进行调整，用于测量单只果蝇或数量极多的动物群体的活动。同时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇活动监测仪	Trikinetics	LAM25H	REQS 组件
电话线解缠器	Uvital	uv20170719	REQS 组件
试管封口塞（flugs）	Genesee Scientific	49-102	果蝇培养耗材
试管	Genesee Scientific	32-120	果蝇培养耗材
果蝇培养网膜	Carolina Biological Supply	173090	果蝇培养耗材
玉米粉	Pepsico	43375	果蝇培养基
糖蜜	Golden Barrel	BLA-GAL	果蝇培养基
琼脂	Apex Bioresearch	66-103	果蝇培养基
无活性干酵母	Genesee Scientific	62-106	果蝇培养基
Tegosept	Apex Bioresearch	20-258	果蝇培养基
丙酸	Genesee Scientific	20-271	果蝇培养基