神经退行性小鼠模型中年龄依赖性运动障碍的步态分析

摘要

本研究中，我们展示了基于腹侧平面成像的运动学步态分析方法，用于监测小鼠模型（例如，内吞蛋白突变小鼠品系）随年龄增长出现的运动协调细微变化以及神经退行性病变的进展。

摘要

运动行为测试常用于确定啮齿类动物模型的功能相关性，并测试在这些动物中开发的新疗法。具体而言，步态分析能够重现人类患者中观察到的与疾病相关的表型，尤其是在影响运动能力的神经退行性疾病中，如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）等。在早期相关研究中，步态参数的测量工作繁琐，且依赖于难以控制的因素（例如，奔跑速度、持续奔跑状态）。腹侧平面成像（VPI）系统的出现使得大规模开展步态分析成为可能，从而使该方法成为评估啮齿类动物运动行为的有力工具。本文详细介绍如何利用运动学步态分析来研究神经退行性小鼠模型中运动功能障碍随年龄进展的变化过程；以终蛋白（endophilin）水平降低的小鼠品系为例，这类小鼠的神经退行性损伤会随年龄增长而逐渐加重。

引言

神经退行性疾病给患者、家庭和社会带来了沉重负担，随着预期寿命的延长以及全球人口持续老龄化，这一问题将变得更加突出。神经退行性疾病的最常见症状之一是平衡能力和行动能力障碍。因此，对衰老的哺乳动物（例如，啮齿类）模型和/或表现出神经退行性表型的模型进行运动行为特征分析，是验证特定动物模型或旨在改善疾病症状的治疗手段在体内相关性的重要工具。几乎每一种治疗神经退行性疾病的策略，最终都必须在动物模型中进行测试，然后才能启动人类临床试验。因此，建立可靠且可重复的行为学检测方法至关重要，这些方法可用于在衰老过程中持续量化与疾病相关的表型，以确保在体外模型中显示潜力的候选药物，能够在活体动物中有效改善表型。

啮齿类动物运动行为评估的一个方面是运动学步态分析，可通过VPI（也称为腹侧平面视频记录法）来实现^1,2。这一成熟的方法利用对在透明电动跑带上方行走的啮齿类动物腹部进行连续录像，从而获取数据^1,2,3,4。对视频数据的分析可生成所有四肢的"数字足印"，....

方案

本文报道的所有动物实验均依照欧盟动物福利指南（2010/63/EU）进行，并获得下萨克森州消费者保护与食品安全局（LAVES）的批准，注册编号为14/1701。

1. 研究设计

1. 由于动物行为学研究需要周密的规划，在设计实验时请考虑以下参数。
   1. 每组所需的动物数量。
      1. 使用统计学软件（例如，PASS、EDA 或 GPower）计算所需的组大小。
         注：组大小取决于动物间的变异程度以及表型的严重程度。对于运动学步态分析，每组小鼠数量通常为 10 - 20 只。
   2. 实验动物的性别。
      1. 根据动物品系，考虑雌激素水平对实验的影响。
         注：许多行为学研究集中于雄性动物，以避免雌激素水平对实验结果的干扰。这种影响程度因动物背景品系的不同而有所差异。
      2. 若同时使用两种性别的动物，应检验性别因素的影响，并在必要时分别对两组进行评估。
   3. 实验动物的年龄。
      1. 若仅需一个时间点，则使用成年动物（2 月龄或以上）。
      2. 若需研究随年龄增长运动行为的变化，应选择多个时间点。最早的时间点可为 1 月龄，即小鼠断奶后。应以规律的时间间隔对动物进行测试，例如，每 1、....

结果

为了说明运动学步态分析的应用，我们对随年龄增长的野生型 C57BL/6J 小鼠以及若干内吞蛋白突变系小鼠进行了步态分析，所用仪器和软件均为商业化产品（详见材料表）。在此实验装置中，置于透明跑台下方的高速摄像机记录小鼠的奔跑过程（图 1A）。软件通过识别红色足掌与白色或黑色毛发之间的对比度实现追踪。由于实验小鼠毛色为深褐色，我们使用红色指画颜料将所有实验个体的足掌涂成红色。实验在不同的跑步速度下进行测试：慢走（10 cm/s）、奔跑（20 cm/s）和快速奔跑（30 cm/s）。测量了足掌与跑台接触的面积以及接触时间和悬空时间。基于这些数据，计算出反映步态节律（例如，摆动/支撑时间、制动/推进相）或姿势特征（例如，足角、SW）的相关参数（图 1B）。

我们进行步态分析.......

讨论

研究运动协调能力是表征神经退行性疾病模型的一种有效方法，尤其适用于帕金森病（PD）等运动协调功能严重受损的疾病。借助运动学步态分析功能检测方法，我们可以在动物出现运动障碍初期，或在神经退行性病变较轻、表型相对轻微的模型中，识别其步态的细微变化。鉴于各类神经退行性疾病模型的表型范围广泛，涵盖从轻微步态异常到严重运动障碍，该方法可根据动物的年龄和运动能力，有效评估其步态参数。对于运动严重受损的动物，可在平面跑台上以低速行走时进行记录；而对于损伤较轻的模型，则可在高速上下坡跑动时进行记录。这种方法能够在不使动物过度劳累的情况下，揭示神经退行性模型与其同窝对照动物之间的步态差异。

通过本方案，我们展示了VPI方法在监测小鼠衰老过程中运动功能障碍发展方面的适用性。通过对野生型小鼠在多个时间点进行检测，随着其年龄增长，我们能够识别出与年龄相关的步态异常，并表征这些异常随衰老的进展情况。此外，在操作神经退行性疾病小鼠模型时，常遇到的一个问题是，由于存在与运动行为无关的症状（例如， 焦虑、淡漠、学习困难），动物执行即使是跑步这样简单的运动任务的意愿也会降低。本文提出了一些方法改进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA		硬件配套提供 DigiGait 步态成像系统及分析软件
不透明毯子或深色布料			覆盖测试舱，以减少动物的暴露感和应激反应
天平	例如 Satorius		精度为 0.1 g、最大载重至少 100 g 的天平
红色指画颜料	例如 Kreul 或 Staedtler		用于增强足掌与动物’身体之间的对比度
小型画笔			柔软的刷子，用于将指画颜料涂抹到动物足掌上
稀释的洗涤剂			用于清洁
消毒剂，例如 Meliseptol 或 70% 乙醇	例如 B.Braun		用于消毒