本文介绍了一种用于评估口腔修复体基台用钛和氧化锆材料上口腔生物膜形成的实验方案，包括对细菌细胞活性及形态特征的分析。in situ 模型结合强大的显微镜技术，用于口腔生物膜的分析。
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本文内容
摘要
摘要
种植牙及其修复部件容易发生细菌定植和生物膜形成。使用微生物黏附性较低的材料可能有助于降低种植体周围疾病的发病率和进展速度。鉴于口腔环境的复杂性和口腔生物膜的异质性，需要采用显微技术以实现对牙齿和牙科材料表面生物膜的分析。本文介绍了一系列用于比较钛和陶瓷修复基台材料上口腔生物膜形成的实验方案，以及在形态学和细胞水平上分析口腔生物膜的相关方法。本研究所描述的用于评估钛和氧化锆牙科修复基台材料上口腔生物膜形成的in situ模型，能够较好地保存48小时形成的生物膜，从而证明了该方法在技术上的可行性。多光子显微镜可对测试材料表面形成的生物膜具有代表性的区域进行分析。此外，结合荧光染料的使用以及多光子显微镜图像处理，能够在高度异质的微生物群体中分析细菌的活性状态。用于电子显微镜观察的生物样本制备方法有助于生物膜结构的良好保存，获得高分辨率图像，并避免产生伪影。
引言
细菌生物膜是结构与功能上高度有序的微生物群落，其特征是多种微生物物种共同合成一种细胞外的、具有生物活性的聚合物基质1,2。细菌在生物或非生物表面的黏附之前，通常会先形成获得性膜，该膜主要由唾液糖蛋白构成1,3,4。微生物与获得性膜之间最初通过较弱的物理化学作用相互结合，随后细菌黏附素与获得性膜上的糖蛋白受体之间形成更强的特异性结合。随着次级定植菌与已附着细菌表面受体的共聚集，微生物多样性逐步增加，最终形成多物种共存的群落结构1,3,4,5。
口腔微生物群的稳态及其与宿主的共生关系对于维持口腔健康至关重要。口腔生物膜内的生态失衡可能增加龋病和牙周病发生的风险2,5。临床研究表明，牙齿或牙科种植体表面生物膜的积....
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方案
本研究经由里贝朗普雷图牙科学院机构审查委员会批准，志愿者参与者签署了书面知情同意书（编号 2011.1.371.583）。
1. 原位生物膜形成 in situ
- 受试者筛选
- 根据以下纳入标准选择受试者：具有完整牙列且无口腔疾病临床表现的健康个体。
- 根据以下排除标准排除受试者：妊娠期、哺乳期、龋齿、牙周病或在过去3个月内接受过抗生素治疗者，吸烟者，或任何可能影响牙周状况的全身性疾病患者。
- 口内装置的制备
- 使用藻酸盐印模材料记录上颌牙弓形态。
- 将19 mL水加入100 g IV型石膏粉中调拌均匀，随后将石膏倒入藻酸盐印模中，制备上颌牙弓模型。
- 设计并制作可支持测试样本（钛和陶瓷圆片）的丙烯酸树脂口内装置。
- 使用正畸钳#139将直径为0.7 mm的镍铬合金丝弯制成固位卡环，并将其安放在模型上。为将卡环置于上颌前磨牙之间，将每根金属丝的一端弯曲成环状。
- 将环状结构适配至龈乳头区域；在咬合面处施加轻微弧度，以避免干扰邻接点和咬合接触。在卡环末端弯制90°折弯，以便在丙烯酸树脂中获得固位。
- 为将卡环适配至上颌第二磨牙，将金属丝在牙冠颈1....
- 使用正畸钳#139将直径为0.7 mm的镍铬合金丝弯制成固位卡环，并将其安放在模型上。为将卡环置于上颌前磨牙之间，将每根金属丝的一端弯曲成环状。
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结果
48小时后生物膜的定植密度 原位 本研究中，通过多光子显微镜检测钛和氧化锆圆盘上定植区域占样本总扫描面积的比例来表示生物膜生长情况（26.64 mm²）。2). 图2 代表三种测试材料表面的细菌定植密度。在铸造和机加工钛片表面观察到更高的生物膜密度（0.0292 µm2 和 0.0213 µm2，而氧化锆圆盘中的数值则较低0.0099 µm2; p < 0.05；Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 检验。
图3 显示了细菌在氧化锆（图3A、3A' 和 3A"）、.......
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讨论
本研究中描述的实验方案旨在评估钛和氧化锆材料作为修复基台时的生物膜形成情况，包括对细菌细胞活性及形态特征的分析。为实现这一目标，设计了一种生物膜形成的in situ模型，该模型由一种口内装置组成，能够容纳待测材料样本，并使其在动态口腔环境中暴露48小时。志愿者认为该装置佩戴舒适，易于插入、取出和清洁。此外，该装置对发音和美观影响较小，制作简便且成本低廉，并可在不破坏生物膜结构的前提下方便地回收样本。同时，该方法有助于保持细菌细胞及胞外基质的完整性。然而，该模型的局限性在于舌头可能接触样本，以及实验过程中样本盘可能意外脱落。为尽量减少这些局限性，样本盘在口内装置中的位置采用随机分布；此外，样本盘使用无毒热熔胶固定，实验中未发生样本丢失的情况。
由于定植于口腔环境中的细菌种类具有高度异质性，因此需要强大的显微技术来分析其硬表面上的生物膜。相较于传统的或共聚焦显微技术，多光子显微技术具有多项优势，例如固有的三维分辨率、近红外激发带来的优异光学穿透能力、对活细胞成像时显著减少的光漂白和光损伤，以及提供定量信息的能力33
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢里贝朗普雷图医学院显微镜多用户实验室的José Augusto Maulin在EDS和SEM分析中提供的慷慨帮助 ，以及Hermano Teixeira Machado在视频编辑中提供的宝贵技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET 自凝丙烯酸树脂 | Clássico | ||
| 牙科蜡 | Clássico | ||
| 加压罐 | Essencedental | ||
| 600目砂纸 | NORTON | T216 | |
| 1200目砂纸 | NORTON | T401 | |
| 2000目砂纸 | NORTON | T402 | |
| 金相抛光机 | Arotec | ||
| 异丙醇 | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| 热熔胶 | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD 生物膜活性检测试剂盒 | Invitrogen | L10316 | |
| 移液器吸头，10 µL | KASVI | K8-10 | |
| 移液器吸头，1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24孔板 | KASVI | K12-024 | |
| 玻璃底培养皿 | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver 倒置显微镜 | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii 激光器 | Coherent | ||
| 物镜 EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD 传感器 - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| 戊二醛溶液 | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| 二甲胂酸钠缓冲液 | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| 四氧化锇 | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | 用于磷酸盐缓冲液的配制 |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| 分析纯无水乙醇 EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 临界点干燥仪 | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 系列扫描电子显微镜 | JEOL | ||
| SCD 050 溅射镀膜仪 | BAL-TEC |
参考文献
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H.
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重印与许可
