不同材料 dental implant 口腔生物膜形成

摘要

本文介绍了一种用于评估口腔修复体基台用钛和氧化锆材料上口腔生物膜形成的实验方案，包括对细菌细胞活性及形态特征的分析。in situ 模型结合强大的显微镜技术，用于口腔生物膜的分析。

摘要

种植牙及其修复部件容易发生细菌定植和生物膜形成。使用微生物黏附性较低的材料可能有助于降低种植体周围疾病的发病率和进展速度。鉴于口腔环境的复杂性和口腔生物膜的异质性，需要采用显微技术以实现对牙齿和牙科材料表面生物膜的分析。本文介绍了一系列用于比较钛和陶瓷修复基台材料上口腔生物膜形成的实验方案，以及在形态学和细胞水平上分析口腔生物膜的相关方法。本研究所描述的用于评估钛和氧化锆牙科修复基台材料上口腔生物膜形成的in situ模型，能够较好地保存48小时形成的生物膜，从而证明了该方法在技术上的可行性。多光子显微镜可对测试材料表面形成的生物膜具有代表性的区域进行分析。此外，结合荧光染料的使用以及多光子显微镜图像处理，能够在高度异质的微生物群体中分析细菌的活性状态。用于电子显微镜观察的生物样本制备方法有助于生物膜结构的良好保存，获得高分辨率图像，并避免产生伪影。

引言

细菌生物膜是结构与功能上高度有序的微生物群落，其特征是多种微生物物种共同合成一种细胞外的、具有生物活性的聚合物基质^1,2。细菌在生物或非生物表面的黏附之前，通常会先形成获得性膜，该膜主要由唾液糖蛋白构成^1,3,4。微生物与获得性膜之间最初通过较弱的物理化学作用相互结合，随后细菌黏附素与获得性膜上的糖蛋白受体之间形成更强的特异性结合。随着次级定植菌与已附着细菌表面受体的共聚集，微生物多样性逐步增加，最终形成多物种共存的群落结构^1,3,4,5。

口腔微生物群的稳态及其与宿主的共生关系对于维持口腔健康至关重要。口腔生物膜内的生态失衡可能增加龋病和牙周病发生的风险^2,5。临床研究表明，牙齿或牙科种植体表面生物膜的积聚与牙龈炎或种植体周围黏膜炎的发生之间存在因果关系^6,7。炎症过程的进展可导致种植体周围炎，并进而造成种植体丧失⁸。

种植牙及其修复部件容易发生细菌定植和生物膜形成⁹。使用具有特定化学成分和表面形貌、且能减少微生物黏附的材料，可能降低种植体周围疾病的发生率和进展速度^9,10。钛是制造种植体修复基台最常用的材料；然而，陶瓷材料近年来被引入，并因其优异的美学性能和生物相容性而逐渐成为钛的替代选择，受到越来越多的关注^11,12。更重要的是，陶瓷材料被认为具有较低的微生物黏附潜能，这主要归因于其表面粗糙度、润湿性以及表面自由能等特性^10,13。

体外研究已显著推动了对微生物在假体基台表面黏附机制的理解^{9,14,15,16,17}。然而，口腔环境具有动态特性，其温度、pH值和营养供应不断变化，并存在剪切力，这些条件在体外实验方案中难以完全模拟^18,19。为克服这一问题，可采用原位生物膜形成模型，该模型有利于在离体分析时保持生物膜的三维结构^{10,20,21,22,23,24}。

分析口腔基质上形成的生物膜的复杂结构，需要采用能够显示光学致密物质的显微技术²⁵。多光子激光扫描显微技术是进行生物膜结构分析的一种现代方法²⁶。该技术的特点是采用非线性光学原理，照明光源接近红外波长，并以飞秒级脉冲激发²⁷。该方法适用于获取自发荧光材料或荧光标记材料的图像，以及由称为二次谐波生成（Second Harmonic Generation）的非线性光学信号所产生的图像。多光子显微技术的优点之一是在激发光强度最低的情况下，仍可获得较深的成像深度，从而最大限度减少对细胞的损伤²⁷。

通过多光子显微镜对非生物表面的生物膜进行活力分析时，需要使用具有不同光谱特性且能够穿透细菌细胞的荧光核酸染料²⁸。荧光染料SYTO9（绿色荧光）和碘化丙啶（红色荧光）可用于活菌与死菌的可视化区分^28,29,30。碘化丙啶仅能进入细胞膜受损的细菌，而SYTO9则可进入细胞膜完整或受损的细菌。当两种染料同时存在于细胞内时，碘化丙啶对核酸具有更高的亲和力，会置换SYTO9，从而使细胞呈现红色标记^28,30。

鉴于口腔环境的复杂性和口腔生物膜的异质性，需要采用显微技术以实现对牙齿及牙科材料表面生物膜的分析。本文介绍了一系列用于比较钛和陶瓷种植修复基台材料上口腔生物膜形成的实验方案，以及在形态学和细胞水平上进行口腔生物膜分析的相关方法。

方案

本研究经由里贝朗普雷图牙科学院机构审查委员会批准，志愿者参与者签署了书面知情同意书（编号 2011.1.371.583）。

1. 原位生物膜形成 in situ

1. 受试者筛选
   1. 根据以下纳入标准选择受试者：具有完整牙列且无口腔疾病临床表现的健康个体。
   2. 根据以下排除标准排除受试者：妊娠期、哺乳期、龋齿、牙周病或在过去3个月内接受过抗生素治疗者，吸烟者，或任何可能影响牙周状况的全身性疾病患者。
2. 口内装置的制备
   1. 使用藻酸盐印模材料记录上颌牙弓形态。
   2. 将19 mL水加入100 g IV型石膏粉中调拌均匀，随后将石膏倒入藻酸盐印模中，制备上颌牙弓模型。
   3. 设计并制作可支持测试样本（钛和陶瓷圆片）的丙烯酸树脂口内装置。
      1. 使用正畸钳#139将直径为0.7 mm的镍铬合金丝弯制成固位卡环，并将其安放在模型上。为将卡环置于上颌前磨牙之间，将每根金属丝的一端弯曲成环状。
         1. 将环状结构适配至龈乳头区域；在咬合面处施加轻微弧度，以避免干扰邻接点和咬合接触。在卡环末端弯制90°折弯，以便在丙烯酸树脂中获得固位。
         2. 为将卡环适配至上颌第二磨牙，将金属丝在牙冠颈1/3处（前庭面）弯曲，使其贴合牙齿外形（远中面），并在卡环末端弯制90°折弯，以实现丙烯酸树脂内的固位。
            注：为确保口内装置具有足够的固位力和稳定性，固位卡环被放置于牙弓两侧的上颌前磨牙之间以及第二磨牙的远中部位。
      2. 按照制造商说明操作自凝丙烯酸树脂，在塑性阶段将其置于两块玻璃板之间（中间夹有3 mm厚的间隔片），压制成厚度为3 mm的树脂片。
      3. 根据装置设计，将丙烯酸树脂片放置于模型的腭侧区域，并在聚合前使用雕刻刀修剪多余部分。
      4. 使用金属模具[直径10 mm，厚度2 mm（表面积78.5 mm²)]制备蜡质圆片：将熔化的蜡注入模具并等待其凝固。手动将4个蜡圆片嵌入丙烯酸树脂中，其中2个位于前磨牙之间，另2个位于第二磨牙附近。
      5. 将丙烯酸树脂在压力罐中以20 psi压缩空气下聚合20分钟。
      6. 使用电动牙科实验室手机和切削工具完成口内装置的修整，并用磨光橡胶进行抛光处理。
      7. 使用上述设备对装置进行调改，确保其在口腔内正确就位。
3. 钛和氧化锆样本的制备
   注：样本（n = 14）直径为10 mm，厚度为2 mm，表面积为78.5 mm²。
   1. 使用冷却水润滑、粒度递减的砂纸（600、1200 和 2000 目）对样本表面进行抛光处理，时间约为20分钟。
      注：样本抛光的目的是将表面粗糙度标准化至0.2 µm。
   2. 使用液体清洁剂和自来水清洗并消毒样本及口内装置，随后在异丙醇超声清洗仪中处理15分钟，最后用吸水纸巾干燥。
   3. 使用约0.1 mL无毒热熔胶将样本固定于口内装置中（图1）。
   4. 将装载样本的装置安装至受试者口腔内。
      注：装载样本的口内装置应佩戴48小时。在受试者进食和进行口腔清洁时，应取下装置并保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中。

2. 细菌活力的评估

注意：样本量 n = 10。

1. 通过将 3 µL SYTO9（绿色荧光核酸染料）和 3 µL 碘化丙啶（红色荧光核酸染料）加入 1 mL 无菌蒸馏水中，配制染色液。
   注意：溶液需避光配制。
2. 将样品转移至 24 孔板中，并用 PBS 充分洗涤，以去除未贴附的细胞。
3. 加入适量（1 mL）荧光染色液，完全覆盖含生物膜的样品。添加染料时应极为小心，避免破坏生物膜结构。
4. 将样品在室温下避光孵育 20–30 分钟。
5. 用无菌蒸馏水轻轻洗涤生物膜样品，以去除多余的染料。
6. 将样品置于玻璃底培养皿中，进行多光子激光扫描显微镜观察以分析生物膜。
   注意：细菌细胞活性分析使用多光子显微镜系统进行。碘化丙啶的荧光信号采用激发/发射波长为 546/680 nm 的滤光片检测，SYTO9 的检测波长为 477/600 nm。所获取图像的尺寸为 5.16188 × 5.16188 mm，对应每个样品总表面积（78.5 mm²）中的 26.64 mm²，即总面积的 33.94%。图像采集自样品最中心区域，分辨率为 1,024 × 1,024 像素。使用 Fiji 软件³¹ 分别分析红色通道和绿色通道的图像。通过选择工具逐个选中细胞，并测量像素的积分密度来确定荧光强度，同时扣除图像背景信号。

3. 利用能量色散光谱法（EDS）分析样本的化学成分

注意：样本量 n = 3。

1. 选取每种无生物膜的测试材料3个样本，使用配备能量色散光谱仪的扫描电子显微镜，在每个样本的两个不同区域进行化学成分分析，电子束电压为10 kV³²。

4. 通过扫描电子显微镜对细菌生物膜进行形态学分析

注意：样本量 n = 1。

1. 将样品浸入含有2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.0 - 7.3）中固定生物膜，持续24小时。
2. 用PBS缓冲液（pH = 7.6）清洗样品。
3. 用1%四氧化锇对生物膜进行后固定，时间为1小时。
4. 用PBS缓冲液（pH = 7.6）再次清洗样品。
5. 小心地对生物膜样品进行脱水处理，使其依次浸入浓度递增的乙醇溶液（50%、70%、90%、95%和100%）中。
   注意：在100%浓度乙醇中进行3次更换。整个脱水过程约需2小时。
6. 将样品转移至临界点干燥器中，并用二氧化碳（CO₂）进行多次置换，直至样品完全干燥。
7. 从仪器中取出干燥后的样品，并将其安装到扫描电子显微镜样品台上。
8. 在样品表面溅射镀金，镀层厚度为20 nm，时间为120秒。
9. 将镀金后的样品载片放入扫描电子显微镜腔室中。在可变压力条件下，以20 - 30 kV电压和650倍放大倍数，对每个样品的5个不同区域进行成像¹²。

结果

48小时后生物膜的定植密度 原位 本研究中，通过多光子显微镜检测钛和氧化锆圆盘上定植区域占样本总扫描面积的比例来表示生物膜生长情况（26.64 mm²）。²). 图2 代表三种测试材料表面的细菌定植密度。在铸造和机加工钛片表面观察到更高的生物膜密度（0.0292 µm² 和 0.0213 µm²，而氧化锆圆盘中的数值则较低0.0099 µm²; p < 0.05；Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 检验。

图3 显示了细菌在氧化锆（图3A、3A' 和 3A"）、...

讨论

本研究中描述的实验方案旨在评估钛和氧化锆材料作为修复基台时的生物膜形成情况，包括对细菌细胞活性及形态特征的分析。为实现这一目标，设计了一种生物膜形成的in situ模型，该模型由一种口内装置组成，能够容纳待测材料样本，并使其在动态口腔环境中暴露48小时。志愿者认为该装置佩戴舒适，易于插入、取出和清洁。此外，该装置对发音和美观影响较小，制作简便且成本低廉，并可在不破坏生物膜结构的前提下方便地回收样本。同时，该方法有助于保持细菌细胞及胞外基质的完整性。然而，该模型的局限性在于舌头可能接触样本，以及实验过程中样本盘可能意外脱落。为尽量减少这些局限性，样本盘在口内装置中的位置采用随机分布；此外，样本盘使用无毒热熔胶固定，实验中未发生样本丢失的情况。

由于定植于口腔环境中的细菌种类具有高度异质性，因此需要强大的显微技术来分析其硬表面上的生物膜。相较于传统的或共聚焦显微技术，多光子显微技术具有多项优势，例如固有的三维分辨率、近红外激发带来的优异光学穿透能力、对活细胞成像时显著减少的光漂白和光损伤，以及提供定量信息的能力³³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hydrogum 5	Zhermack Dental	C302070
Durone IV	Dentsply	17130500002
NiCr wire	Morelli	55.01.070
JET 自凝丙烯酸树脂	Clássico
牙科蜡	Clássico
加压罐	Essencedental
600目砂纸	NORTON	T216
1200目砂纸	NORTON	T401
2000目砂纸	NORTON	T402
金相抛光机	Arotec
异丙醇	SIGMA-ALDRICH	W292907
热熔胶	TECSIL	PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD 生物膜活性检测试剂盒	Invitrogen	L10316
移液器吸头，10 µL	KASVI	K8-10
移液器吸头，1,000 µL	KASVI	K8-1000B
24孔板	KASVI	K12-024
玻璃底培养皿	Thermo Scientific	150680
AxioObserver 倒置显微镜	ZEISS
Chameleon vision ii 激光器	Coherent
物镜 EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC	ZEISS	440452-9903-000
SDD 传感器 - X-Max 20mm²	Oxford Instruments
戊二醛溶液	SIGMA-ALDRICH	G5882
二甲胂酸钠缓冲液	SIGMA-ALDRICH	97068
四氧化锇	SIGMA-ALDRICH	201030
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH	S9638	用于磷酸盐缓冲液的配制
KH2PO4	SIGMA-ALDRICH	P9791
NaCl	MERK	1.06404
Kcl	SIGMA-ALDRICH	P9333
分析纯无水乙醇 EMSURE	MERK	1.00983
CPD 030 临界点干燥仪	BAL-TEC
JSM-6610 系列扫描电子显微镜	JEOL
SCD 050 溅射镀膜仪	BAL-TEC