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Stentor再生研究方法

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DOI：

10.3791/57759

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2018年6月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco

本文内容

摘要

大型纤毛虫Stentor coeruleus是研究再生和伤口愈合的优良体系。本文介绍了从单个细胞或细胞片段建立Stentor细胞培养、通过切割细胞诱导再生、化学诱导膜带和口器结构再生、细胞再生的成像及分析等实验方法。

摘要

细胞必须能够再生其组成部分，以应对外界干扰并恢复功能。Stentor coeruleus 是一种单细胞纤毛虫，是研究伤口愈合及后续细胞再生的优良模式生物。近年来，Stentor 的基因组已测序完成，并发展出RNAi等现代分子生物学技术。这些工具使得在分子水平上研究单细胞再生成为可能。本实验方案的第一部分介绍了如何从单个细胞或细胞片段建立 Stentor 细胞培养，以及维持 Stentor 培养的一般性指导原则。大量培养 Stentor 细胞可支持生化分析、测序和质谱等重要技术的应用。方案后续部分涵盖了在 Stentor 中诱导再生的不同方法：使用玻璃针手动切割细胞可用于研究大范围细胞结构的再生，而用蔗糖或尿素处理细胞则可用于研究位于细胞前端特定结构的再生。本文还提供了一种对单个再生细胞进行成像的方法，并附有再生过程分期与动态分析的评估标准。整个再生过程被划分为三个阶段。通过可视化细胞群体在各阶段中的动态进展，可揭示再生时间上的异质性。

引言

细胞并非简单的酶袋，而是高度复杂的机器，其组分被精确地调节至合适的尺寸，并以明确定义的位置进行排列。单个细胞的形态发生是细胞生物学和发育生物学中的关键过程，但其分子机制尚不清楚1,2。尽管某些培养细胞呈无定形团块状，单细胞生物却可具有极为复杂的结构，纤毛虫中所见的复杂皮层模式便是典型例证3,4。

或许，结构最为复杂的细胞的典型例子是 Stentor coeruleus一种远缘的大型异毛类纤毛虫 四膜虫 和 草履虫。喇叭虫 长1 mm，表面覆盖有100多条纵向排列的蓝色色素条纹，其间交替分布着由平行排列的微管带组织而成的纤毛列，微管带贯穿整个细胞。细胞呈喇叭状（图1)，其前端具有膜带和口器（OA），后端具有附着于基质的固着器。除了明显的前后极性外，该细胞还表现出独特的手性排列模式，即纤毛列之间的间距沿顺时针方向逐渐增大。这导致最窄的纤毛列与最宽的纤毛列相接处出现不连续区域，该细胞表面区域称为条纹对比位点，当移植到另一个细胞上时，可诱导第二套前端结构的形成5，使其在形式上等同于斯佩曼组织者。因此，发育生物学的所有关键过程在其中均有对应现象 喇叭虫：轴向化、模式形成和诱导。在胚胎中，这些过程由不同细胞之间的命运差异所驱动，但在 喇叭虫，它们必须由单个细胞内不同区域之间的命运差异所驱动。决定细胞内区域差异的因素是什么 喇叭虫 是一个谜。

如果任何部分 喇叭虫 被切断后，细胞的缺失部分可在数小时内再生，形成一个正常的细胞。如果细胞被切成两半，甚至更小的片段，每个片段都会重新组织成一个外观正常但体积更小的细胞，并恢复细胞各部分之间的适当比例。6,7即使微小的片段，1/64th 原始细胞大小的细胞能够再生为一个较小但比例正常的细胞，然后生长至完整大小6. 喇叭虫 因此为利用通常应用于组织或完整生物体水平的手术方法来研究细胞器大小缩放机制和细胞生长调控提供了独特的机会。

其中一个特性是 喇叭虫 使其能够从多种外科手术操作中再生的原因在于，它含有一个单一的结节状大核（图1) 含有约 50,000 个完整基因组拷贝8只要细胞碎片包含至少一个大核节点，就具备完全再生的能力。另一个潜在的特性是 喇叭虫其再生能力源于强大的伤口愈合能力。尽管多种细胞类型均具备伤口修复功能9, 喇叭虫 能够从一系列极端的物理扰动中恢复。一个例子是 喇叭虫 从剧烈扰动中恢复，以及细胞质流动的可视化方法 喇叭虫10 此前已有报道。这些方法可用于研究损伤及其后续再生过程如何影响细胞质的物理状态。

Stentor 因其巨大的体型、非凡的再生能力，以及表现出许多多细胞胚胎中常见的发育现象（如组织者、轴形成和模式形成）而吸引了众多发育生物学家，其中包括20世纪初的托马斯·亨特·摩根（Thomas Hunt Morgan）7。在20世纪50至60年代，显微外科技术揭示了这种单细胞生物体内一系列令人震惊的再生与形态发生过程11。然而，直到最近，Stentor 才被发展为一个分子生物学研究的模式体系。在过去的几年中，Stentor 的基因组已被测序并完成组装8，并建立了通过喂食介导RNA干扰（RNAi）来干扰基因表达的方法12。

近年来，Stentor 才被发展为现代分子生物学的模式生物，其原因之一是由于其细胞周期较长（3至5天），难以培养大量细胞。然而，现代基因组学和蛋白质组学方法所需的材料比以往更少，单个 Stentor 细胞的体积已足以满足这些方法的需求，甚至无需采用专为远小于 Stentor 的单细胞分析而开发的超灵敏技术。本实验方案的第1部分详细描述了从单个 Stentor 细胞建立大规模培养的操作流程。该方法同样适用于通过切割细胞获得的细胞片段来建立大规模培养。第1部分还提供了长期维持健康 Stentor 培养物的指导原则。第2部分介绍了使用玻璃针手动切割细胞以诱导细胞再生的方法。第3部分专注于两种诱导特定细胞结构（膜带和口器）再生的方法：通过蔗糖或尿素处理细胞，可导致这些结构脱落，随后重新再生。第4部分详细说明了对单个再生细胞进行长时间成像的技术。第4部分最后描述了再生过程的各个阶段以及再生动态分析的相关建议。

方案

1. Stentor 的培养以及从单个细胞或细胞片段建立 Stentor 培养物

  1. 准备 莱茵衣藻 用作食物的培养物 喇叭虫.
    1. 获取 莱茵衣藻 来自商业供应商的细胞（材料表).
    2. 建立500 mL液体培养物 莱茵衣藻 采用无菌技术在市售TAP培养基中进行13.
    3. 保持 衣藻 在接近饱和浓度（O.D. 约为 1）的条件下，每周用 TAP 培养基稀释两次，在光照下培养。
      注意：该 衣藻 培养物可在摇床中培养。
    4. 定期检查是否 衣藻 通过取一滴培养物置于载玻片上，盖上盖玻片，并在40倍显微镜下观察，以判断培养状态是否健康。
      注意：请勿使用该培养物 喇叭虫 若其受到细菌污染或如果 衣藻 细胞会聚集成簇。若出现上述任一问题，应重新开始 衣藻 培养。
  2. 获取 喇叭虫 蓝斑 来自商业供应商的细胞（材料表).
  3. 如果 喇叭虫 需要从自然栖息地采集细胞时，可从池塘、湖泊或河流中收集11.
    1. 收集 喇叭虫 从池塘、湖泊或河流中，寻找一处有植被、水流相对平静、阴凉且清澈的区域。
      注意：找到的概率更高 喇叭虫 在浮萍生长的位置。
    2. 收集至少2 L的水于一个易于倾倒的容器中。
    3. 在碎屑和颗粒物沉降到容器底部后，轻轻将少量较小的容器装满，以检查其中是否存在 喇叭虫每次收集后，等待数秒，使大容器中的碎屑沉淀。
    4. 在一个地点完成样本采集后，转移至至少相距10 m的新地点，并在该处重复进行样本采集。
      注意：并非每个池塘都具有 喇叭虫 种群，因此可能需要对多个池塘进行采样。
    5. 将样品带回实验室，将容器中的水分别转移至不同的培养皿中。
    6. 在每个培养皿中，寻找 喇叭虫 在5倍放大倍数下，使用斜射光的体视显微镜下。转移单个 喇叭虫 使用1 mL移液器将细胞加入含有至少100 µL市售巴氏灭菌泉水（PSW）的玻璃点板孔中。
      注意： 喇叭虫 细胞在附着于基质时呈喇叭状图1）。游泳 喇叭虫 细胞的伸展程度低于附着在基质上的细胞（视频 1).
    7. 洗涤 喇叭虫 在PSW中至少洗涤3次。洗涤时，移除孔中约90%的液体，同时保留 喇叭虫 孔中细胞，随后向孔内加入500 µL PSW。
      注意：在操作前 喇叭虫 使用10 µL或更小规格的带滤芯吸头移液器时，用剪刀将吸头尖端剪去约0.5 mm，以避免因大细胞通过过小的吸头开口时产生的剪切力而损伤细胞。
  4. 准备 衣藻 每次喂食前 喇叭虫.
    1. 转移1 mL的 衣藻 培养 参照步骤1.1制备，加入1.5 mL微量离心管中。在2,095 × g下离心3分钟。
    2. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL PSW中。在2,095 × g离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL PSW中。
      注意：因此，需进行洗涤并浓缩 衣藻 将被称为“制备好的” 衣藻” 在以下步骤中。TAP 培养基对 喇叭虫，从而进行洗涤 衣藻 喂食前 喇叭虫 很重要。
  5. 如果一个克隆的 喇叭虫 需要进行培养时，应从单个个体开始培养 喇叭虫 细胞或细胞碎片
    1. 由于单个 喇叭虫 细胞在PSW中生长不良，通过滤膜灭菌法对现有健康培养物中的500 µL培养基进行过滤除菌，制备条件培养基 喇叭虫 培养
    2. 将500 µL培养上清转移至玻璃点板的一个孔中。
    3. 转移一个 喇叭虫 将少量培养基转移至含有条件培养基的玻璃点板孔中。转移时使用尽可能少的培养基。
    4. 喂养每只 喇叭虫 5 µL 已制备的 衣藻 每48小时。当 喇叭虫 分装，计数孔中细胞数量，并加入5 µL预配制的 衣藻 每细胞。
    5. 保持 喇叭虫 在避光处放置，因为细胞对光敏感（例如，可用纸巾覆盖透明塑料盒）。
    6. 交换 喇叭虫 每96小时用新鲜的条件培养基更换孔中的培养基。
      1. 按照步骤1.5.1制备新鲜的条件培养基。
      2. 全部制作 喇叭虫属 通过轻轻吹打孔板中的液体，使细胞从孔底脱落。
      3. 使用1 mL移液器小心吸出孔中的液体，确保所有细胞均保留在孔内。向孔中加入500 µL新鲜的条件培养基。
    7. 当孔中细胞数量超过20个时，将细胞转移至更大的容器中，例如广口玻璃瓶。
      1. 向一个已灭菌的广口玻璃瓶中加入 20 mL PSW。
        注意：玻璃器皿的高压灭菌 喇叭虫 可通过仔细清洗和冲洗来替代。
      2. 用移液器小心地将孔内的培养基上下吹打，使所有细胞从孔底脱落。收集全部 喇叭虫 使用1 mL移液枪头轻轻吹打细胞，并将其轻柔转移至玻璃瓶中。
    8. 不要拧紧罐子上的盖子 喇叭虫 培养物，以充分接触空气。
    9. 每48小时向罐中添加PSW以维持 喇叭虫 密度约为20个细胞/mL。通过肉眼估算细胞密度。
      注意：也可使用1 mL移液器向瓶中通入气泡，使细胞从瓶壁脱落，然后吸取1 mL培养液，并计数移液器吸头中的细胞数量。
    10. 每48小时，加入制备好的培养基 衣藻 到 喇叭虫 培养瓶中的培养物（见步骤1.4）。首先向培养物中加入200 µL制备好的培养基 衣藻随着培养物体积的增加，逐渐增加所准备的培养基量 衣藻 用于喂食，最大容量为 1 mL。
    11. 当培养物体积达到容器容量的约90%时，将培养物转移至更大的容器中。
      1. 用1 mL移液器将培养液在瓶内上下吹打，以使细胞脱落 喇叭虫 从玻璃上
      2. 将罐子中的全部内容物倒入一个2杯容量的玻璃容器中。
      3. 用约 25 mL PSW 将烧杯冲洗至 2 杯容量的玻璃容器中，以收集残留物 喇叭虫.
  6. 在2杯容量的玻璃容器中维持健康的培养物。
    1. 喂养 喇叭虫 2 mL 已制备的培养物 衣藻 每4-5天每100 mL培养液添加一次PSW，以维持培养条件。 喇叭虫 密度约为每毫升20个细胞。
      注：450 mL 是一个 2 杯容量容器所能容纳的最大体积。
    2. 每周一次，在5倍解剖显微镜下检查培养物中的轮虫、真菌及其他生长物。为延长培养物的健康状态，需清除污染的微生物以及形态异常和无色的个体。 喇叭虫 使用1 mL移液器转移细胞。
    3. 当玻璃容器中的培养物接近90%满时，进行分瓶培养。
      1. 向玻璃容器中加入 25 mL PSW。使用 25 mL 移液管反复吹打以使细胞脱落 喇叭虫 从玻璃容器中转移约50%的培养物至一个新的2杯容量的玻璃容器中。
      2. 向两种培养物中各加入25 mL PSW，并按照本实验方案部分所述继续培养这两种培养物。
        注意：由于 喇叭虫 细胞对高温敏感，培养物所处房间的温度应维持在25 °C或更低。 alternatively，可将培养物置于培养箱中。参见 表1 用于故障排除 喇叭虫 培养。

2. 通过切割Stentor细胞诱导再生

  1. 使用拉针仪，按照以下程序从毛细管中制备多根微针：加热温度 - 735，拉制力度 - 100，拉制速度 - 110，拉制时间 - 150，气压 - 400。
  2. 在50 mL PSW中配制4%的甲基纤维素溶液。
    1. 加入1 g甲基纤维素（黏度：1500 cP）至50 mL PSW中。
    2. 4 °C 下孵育至少 8 小时，以促进甲基纤维素的溶解。
    3. 将4%甲基纤维素溶液置于室温保存。
  3. 准备一个玻璃点滴板，用于在完成切割后存放细胞碎片。
    1. 过滤除菌健康培养物的培养基，每孔玻璃斑点板需500 mL。
    2. 将500 mL灭菌培养基转移至每个所需的孔中。
  4. 采集一份健康的 喇叭虫 （具有明确的喇叭形状、鲜艳的蓝绿色以及无大液泡）置于2 µL液滴中，并将其放在盖玻片或载玻片上。加入2 µL的4%甲基纤维素（图2）。让 喇叭虫 切割前应先减速（视频 2).
  5. 尽可能使玻璃针与切割面保持平行，以防止针头折断。
  6. 使用体视解剖显微镜，找到玻璃针尖端，并将其移近细胞图3A）。观察 喇叭虫 接触针头时收缩图3B和C).
    注意：如果细胞的方向难以区分前端与后端，可用针的侧面非常轻柔地旋转细胞。
  7. 轻轻按压收缩部位 喇叭虫 用玻璃针的侧面将细胞切成两部分（图3D 和 E, 视频 3）。将两个片段分开移动，确保它们之间无细胞质连接，以避免片段融合（图 3F）.
  8. 在解剖显微镜下使用斜射照明观察两个片段，检查每个片段是否至少含有一个大核节点。
    注意：细胞存活必须至少含有一个大核节点。在切割过程中或切割后，细胞可能会连同蓝绿色色素一起脱去表膜（透明外壳）。在大多数情况下，这不会影响细胞的长期存活能力。
  9. 将碎片转移至步骤2.3中准备好的玻璃点滴板的孔穴中。
  10. 切割多个细胞，因为部分被切割的细胞无法再生。
  11. 如果在一次实验中进行多次切割，当玻璃针尖严重被物质覆盖时，应予以更换 喇叭虫 残留物或针尖损坏时，可改用干净的硅胶垫轻轻擦拭针头进行清洁。
    注意：玻璃针可用于多次细胞切割实验。
  12. 将含有细胞碎片的玻璃点样板置于湿盒中。
  13. 请参阅方案第4节，了解成像及结果解读的详细信息 喇叭虫 再生结果。

3. 通过蔗糖或尿素处理诱导膜带和口器再生

  1. 利用蔗糖去除膜带和口器结构
    1. 制备一个 PSW 中含 25% 蔗糖的溶液
    2. 向一个带扣盖的微量离心管中加入500 µL含25%蔗糖的PSW溶液。
    3. 准备3个带 snap-cap 的微量离心管，每管加入1 mL PSW，用于蔗糖处理后洗涤细胞。
    4. 收集 30 - 60 喇叭虫 使用1 mL移液器将1 mL培养基中的细胞转移至另一个微量离心管中（图 4，箭头 A）。
    5. 用200 µL移液器单次吸取，将离心管中的所有细胞收集至终体积125 µL。转移至含有500 µL 25%蔗糖溶液（步骤3.1.2中配制）的离心管中，得到625 µL 20%蔗糖溶液图4，箭头B）。启动秒表。
    6. 孵育 喇叭虫 在20%蔗糖溶液中轻轻弹击并旋转离心管1分钟。
    7. 用单次吸取收集所有细胞（调节移液器至最大200 µL容量，以便更易收集）。
    8. 将细胞保留在移液枪头中，直至秒表显示2 min 蔗糖处理
    9. 弹出 喇叭虫 加入步骤 3.1.3 中准备的其中一个微量离心管中 (图 4，箭头C）。在管架中快速弹旋试管。
    10. 用步骤 3.1.3 中配制的 PSW，在剩余的两个微量离心管中各清洗细胞一次，共清洗两次。 (图4，箭头 D 和 E）。
      注意：在洗涤步骤之间，单次采样细胞收集技术并不重要。
    11. 请参阅方案第4节，了解成像及结果解读的详细信息 喇叭虫 再生动力学图4，箭头 F 和 G）。
  2. 使用尿素去除膜带和口器结构
    1. 配制含4%尿素的PSW溶液。
    2. 向一个带扣盖的微量离心管中加入 300 µL 含 4% 尿素的 PSW 溶液。
    3. 准备3个带扣盖的微量离心管，每管中加入1 mL PSW，用于尿素处理后洗涤细胞。
    4. 收集 30 - 60 喇叭虫 使用1 mL移液器将1 mL培养基中的细胞转移至另一个微量离心管中图4，箭头 A）。
    5. 使用1 mL移液器一次性吸取试管中的全部细胞，终体积为300 µL。将细胞转移至另一含有300 µL 4%尿素溶液（按步骤3.2.2配制）的试管中，得到600 µL的2%尿素溶液（图 4，箭头B）。启动秒表。
    6. 孵育 喇叭虫 在该2%尿素溶液中，将微量离心管在管架中振荡并快速旋转1分钟。
    7. 收集单次抽取中的所有细胞。
    8. 将细胞保留在移液器吸头中，直至秒表显示尿素处理时间为2 min。
    9. 推出 喇叭虫 加入到第3.2.3步准备的其中一个微量离心管中（图4，箭头C）。在试管架中轻弹并快速旋转试管。
    10. 用步骤 3.2.3 中配制的 PSW，在剩余的两个微量离心管中各清洗细胞一次，共清洗两次图4，箭头 D 和 E）。
      注意：在洗涤步骤之间，单次采样细胞收集技术并不重要。
    11. 请参阅方案第4节，了解成像及结果解读的详细信息 喇叭虫 再生动力学图4，箭头 F 和 G）。

4. 细胞再生的成像与分析

  1. 若使用直立显微镜，采用悬滴法对单个细胞的再生过程进行成像。
    1. 在玻璃点板的一个孔中加入 100 µL PSW。
    2. 使用 10 或 20 µL 移液器，将 1 个 Stentor 细胞连同其培养基（即其所在培养液）约 4 µL 分离出来，并将液滴滴加至 22 × 22 mm2 盖玻片中央（图 5）。
      注意：若细胞存在以下情况，则不应用于成像：1）状态不佳（形态异常或液泡化严重）；2）仍保留有动基列带或口器结构（化学处理实验中）。
    3. 在先前液滴周围，再添加 4 个含 Stentor 的培养基液滴，各液滴之间需留出足够间距。
    4. 将带有液滴的盖玻片翻转，轻轻覆盖在步骤 4.1 中已加入 PSW 的玻璃点板孔上。
    5. 注意：孔中的 PSW 可减少液滴蒸发（图 5）。
    6. 按照步骤 4.1.1 至 4.1.4 准备其余待成像细胞。
    7. 在显微镜下以所需的时间分辨率对再生中的细胞进行成像。也可使用解剖体视显微镜观察再生过程。
      注意：细胞切割或经蔗糖、尿素处理后，再生过程立即开始。然而，新的口器结构通常在再生开始约 3 小时后才可见。
  2. 对每个时间点，将每个细胞归入三个再生阶段中的一个。可通过将每个细胞与各阶段的代表性图像进行比较来完成（图 4 和 图 6）。
    1. 将尚未形成动基列带的细胞归为第 1 阶段（图 6A）。
    2. 将具有动基列带的细胞归为第 2 阶段。
      注意：动基列带通常在处理后 3–6 小时出现（图 4，图 6B）。在该阶段末期，动基列带后端会出现额外弯曲，紧随其后将形成口原基。
    3. 将具有口原基的细胞归为第 3 阶段。
      注意：口原基是一种内陷结构，通常在处理后 6–8 小时出现在动基列带的后端（图 4，图 6C 和 6D）。当细胞前端出现动基列带并恢复典型的喇叭状细胞形态时，再生完成（图 4，图 6E）。大多数 Stentor 细胞在再生开始后 8–9 小时内可完全再生。
  3. 以堆叠柱状图形式绘制每个时间点各再生阶段细胞所占百分比（图 7）。
    注意：此类图表可用于可视化细胞群体中的再生动态。

结果

Stentor 的培养已通过使用本方案第1节的方法，从单个细胞或细胞片段中可靠地建立并维持。一个大型健康培养物的代表性示例如视频1所示。

使用第3.1步中所述的蔗糖处理方法启动Stentor再生，并结合第4节中讨论的成像与分析方法（图7），测定了再生过程的时间进程。该图显示，细胞群体达到任一特定阶段所需的时间存在约一小时的分布范围。此类分析可实现对再生细胞群体中再生过程时间异质性的研究。

以下是迄今为止在数十次蔗糖处理后观察到的再生时间总结（图4 和 图6）。第1阶段是当 喇叭虫 细胞呈泪滴状，无任何膜带结构（此阶段在蔗糖洗脱后立即开始），持续3 - 6小时。第2阶段为膜带出现并逐渐生长（蔗糖处理后3 - 6小时），持续3 - 4小时。第3阶段为在膜带后端出现口部原基（蔗糖处理后6 - 8小时），且两种结构均向细胞前端移动，此阶段持续1 - 2小时。当膜带与口器结构均迁移至细胞前端时，表明再生过程已完成。细胞已具备典型特征 喇叭虫 喇叭状。蔗糖处理后8-9小时，细胞完全再生。

草履虫示意图，标注：纤毛带、口器、液泡、大核、固着器。
图 1. Stentor 的显微图像。 纤毛带和口器位于细胞前端。固着器位于细胞后端。Stentor 的大核呈结节状。营养充足的 Stentor 含有绿色食物液泡，其中主要为 Chlamydomonas。比例尺为 0.5 mm。请点击此处查看此图的放大版本。

用于显微分析的玻璃载片上斜口虫样本液滴的解剖显微镜装置。
图 2. Stentor 切割装置。 细胞切割操作通过在商用体视解剖显微镜下观察细胞的同时，手动操控玻璃针完成。使用滤纸的目的是提供白色背景，以便更清晰地观察细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜图像；显微镜方格中的细胞分裂阶段；实验观察。
图3. 视频3的截图，展示如何使用玻璃针切割Stentor。（A）玻璃针即将接触Stentor前的瞬间。（B）Stentor被玻璃针与载玻片轻轻挤压的状态。（C）Stentor受针头施加的力而收缩的反应。（D）用玻璃针侧面轻压细胞，正在切割Stentor。（E）Stentor已被切为两部分但尚未分离。（F）两个Stentor片段。比例尺为0.25 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

喇叭虫再生过程示意图；蔗糖/尿素刺激；逐步细胞清洗；显微成像。
图4. 实验方案第3节和第4节的示意图。 本图示展示了进行蔗糖或尿素处理及观察细胞再生过程的操作流程。底部面板所示时间从第一次清洗（Wash 1）开始计时。请点击此处查看该图的放大版本。

用于在盖玻片下对液滴进行分析的体视显微镜装置，配有9孔斑点板。
图 5. 使用正置显微镜进行成像和/或直接观察再生过程的实验装置。 每个从盖玻片悬垂的 4 µL 液滴中均含有一个正在进行再生的细胞。玻璃斑点板孔中的水可减缓液滴的蒸发。该装置可实现对多个细胞再生过程的平行观察。 请点击此处查看该图的放大版本。

植物细胞的显微分析，显示细胞结构变化的图像系列，显微镜研究。
图6. Stentor 在纤毛带和口器再生各阶段的显微图像。（A）第1阶段的特征是细胞呈泪滴状，且无纤毛带。（B）第2阶段的特征是出现纤毛带，这是一种基于纤毛并持续摆动的结构。在图B至D中，纤毛带以白色虚线标出。（C和D）第3阶段的特征是出现口原基（以箭头标示）。口原基看起来像是纤毛带后端的一个内陷结构。随后，口原基将向前移动至细胞前端，发育为口器。（E）当细胞恢复为典型的Stentor喇叭状形态，并且口器（以箭头标示）在细胞前端明显扩大时，再生过程完成。比例尺为0.25 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞周期阶段与蔗糖冲击后时间的关系；柱状图；细胞阶段分布分析。
图7. 堆叠箱形图，显示蔗糖处理后随时间推移，处于再生各阶段的细胞比例的变化情况。 该图显示了再生细胞群体中各再生阶段在时间上的异质性。“Reg. end”表示再生完成。细胞数量：28。 请点击此处查看该图的放大版本。

烧杯中的酵母细胞悬液；微生物培养；发酵过程；生物学实验装置。
视频 1. 健康的 Stentor 培养物示例。 通常情况下，如果培养物浓度达到如此程度，建议进行分瓶培养。请点击此处观看视频。（右键可下载。）

含有悬浮颗粒的液滴；显微镜图像展示表面张力和杂质。
视频 2. 使用甲基纤维素减缓 Stentor 的运动。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

在细金属丝上进行液滴微流控实验；用于流体动力学研究的示意图。
视频 3. 切割 Stentor。 在体视解剖显微镜下，可通过将玻璃针压入细胞，手动将单个细胞切割成多个部分。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

培养问题可能的补救措施可能的预防
培养物被轮虫或其他大型生物过度污染。尽可能去除 喇叭虫 尽可能将细胞转移至新的培养皿中，然后用缓冲液洗涤细胞三次。洗涤 喇叭虫 收到时务必彻底检查，即使是从商业供应商处购买的。
培养物被真菌或其他微生物严重污染。确定一个干扰最少的角落 喇叭虫 在该区域，尽可能多地移除培养基，但不要移除过多细胞 喇叭虫 并加入新的PSW。轻轻但彻底地混合，以均匀分散入侵的生物体。跳过下一次喂食以及 喇叭虫 会吃掉它们。定期观察培养情况，并通过更换为新鲜的 PSW 培养基去除小型污染物。
喇叭虫 相互重叠放置。将培养物分装，使浓度低于20个细胞/毫升。更频繁地进行分瓶培养。
喇叭虫 细胞正在交配。每4天喂食一次，而不是每5天。
培养物中含有大量深色废弃物。尽可能去除深色物质， 喇叭虫 尽可能去除废液，但不要移除细胞。如果 喇叭虫 附着在深色物质上的，用移液器上下吹打以释放 喇叭虫 细胞及其代谢废物，然后在不移除细胞的情况下弃去含有废物的培养基。或者，移除这些 喇叭虫 并相应减少喂食量。喂养 喇叭虫 每100 mL培养液减少1 mL食物。
不健康形态（空泡化/肿胀或呈圆形） 喇叭虫尽可能多地移除培养基，但不要移除过多细胞 喇叭虫 细胞并添加新的 PSW。定期更换培养基。

表1. Stentor 培养问题排查指南。

讨论

培养Stentor存在诸多挑战。首先，由于当Stentor浓度超过20个细胞/mL时，培养物会变得不健康，因此若要开展需要大量细胞的实验，就必须维持大量Stentor培养物。其次，可能污染Stentor培养物的生物体通常比Stentor分裂更快，容易占据主导地位并压倒培养物（常见污染物为轮虫）。因此，必须定期在显微镜下检查培养物，并清除污染物。有时需要从受污染的培养物中人工挑取少量存活细胞，重新建立新的培养物，这增加了维持健康Stentor培养所需的时间。第三，将单个细胞扩增为400 mL的培养物至少需要一个月时间，因为Stentor的细胞周期为3–5 天。第四，与其他模式纤毛虫不同，Stentor极少形成包囊，也无法冷冻保存。

培养过程中的一个重要方面 喇叭虫 是选择合适的食物生物。多种培养方法 喇叭虫 此前已有描述。其中一种方法建议使用脱脂牛奶培养细菌，随后这些细菌会以之为食 喇叭虫该技术在培养中是有效的 喇叭虫；然而，基因组学技术的应用需要纯样品，以避免来自未定义食物生物的基因组读段造成干扰。采用本方案， 喇叭虫 可以大规模培养，并且由于其食物， 衣藻，已进行测序，因此可以检测并控制来自食物生物体的基因组污染。由于未知原因，Tartar 不得不通过返回其最初发现地点来补充其样本库存 喇叭虫 此前。采用本方案，我们已能够持续 喇叭虫 多年。

再生实验 喇叭虫 通常较为直接，但需注意一些关键细节。关于第2节，切割 喇叭虫 将细胞一分为二可在数分钟内掌握。掌握更高级的显微外科操作 喇叭虫 可能需要一周的练习。在进行蔗糖或尿素处理（第3节）时，如果成像开始时大多数细胞仍保留其膜带结构，下次进行蔗糖处理时可将孵育时间增加10–30秒。蔗糖处理的孵育时间不得超过3分钟，否则将导致细胞死亡。

成像 喇叭虫 再生研究需要能够对大型细胞进行长时间成像的方法。第4节详述的成像方法仅适用于正置显微镜。若仅有倒置显微镜可用，则可将细胞置于载玻片或盖玻片上的小型腔室中。一种方法是使用凡士林构建腔室，并加盖另一片盖玻片以防止蒸发。或者，可采用 腔室 单个细胞 可通过打孔制成 使用所需尺寸的打孔器在1 x 1 cm的区域上打孔2 硅胶垫片的方形材料表，将间隔片置于盖玻片上，将细胞放入腔室，再用另一张盖玻片覆盖腔室。成像时，如果 喇叭虫 未处于正确方向以观察再生各阶段特征时，可轻敲培养皿使细胞收缩。观察细胞伸展过程以确定其再生阶段（完全伸展约需45秒）。若细胞仍处于不适宜方向，可重复轻敲。图中所示的图像来自 图1 和 图6 由体视变倍显微镜拍摄；然而，所详述的所有实验均可使用5X解剖体视显微镜完成。

除了培养和成像Stentor之外，另一个挑战是再生过程的追踪，特别是确定各个阶段所需的时间。如果再生中的细胞方向理想，口原基区域清晰可见，则阶段鉴定仅需数秒钟。然而，有时Stentor细胞所处的方向不利于明确判断其再生阶段，因此需要更长时间进行识别。对单个再生细胞进行分期所耗费的大量时间可能会延迟所有再生细胞的定量分析，从而降低分期的时间精确度，并迫使观察者等待细胞移动至新方向后再重新成像。因此，该实验既耗时又费力。基于这些原因，开发能够自动检测Stentor细胞并为视频显微数据中的再生阶段进行判定的方法将极具价值。这类方法还将有助于提高实验的可重复性、扩大样本量，并消除人为偏差。

高灵敏度基因组学和蛋白质组学方法的出现，使得单细胞研究逐渐成为可能。Stentor细胞体积巨大，是进行概念验证实验的理想对象。要实现此类实验，培养Stentor是基础，因此本文所述方法将在更先进单细胞技术的进一步发展中发挥重要作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 GM113602（WFM）和美国国家科学基金会（NSF）资助项目1144247（AL）支持。我们感谢Mark Slabodnick和Natalie Kirkland的贡献。 感谢各位在开发部分实验方案初版过程中所做的工作以及富有启发性的讨论。感谢Karina Perlaza和Greyson Lewis对稿件的审阅与建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Stentor coeruleus 活体培养物Carolina Biological Supply131598
Chlamydomonas reinhardtii 琼脂培养物Carolina Biological Supply152040
巴氏灭菌泉水，1 夸脱瓶装Carolina Biological Supply132458
甲基纤维素，1500 cPMillipore SigmaM0387
Pyrex 玻璃点滴板Fisher Scientific13748B
广口玻璃瓶，带螺旋盖，60 mLCarolina Biological Supply715740
2 杯容量玻璃容器，带玻璃盖Pyrex1095600
CultureWell 硅胶片材料Grace Bio Labs664475
Kimwipes 擦镜纸Kimberly Clark34155
Posi-Click 1.7 mL 微量离心管DenvilleC2170
盖玻片Fisher finest12-548-B
TAP 生长培养基，适用于 Chlamydomonas 培养ThermoFisherA1379801
硅胶间隔垫，CultureWell 硅胶片，厚 0.25 mm，尺寸 13 cm × 18 cmGrace Bio Labs664475
凡士林，白色石油 jellySpectrumP1037
硼硅酸盐玻璃毛细管。
外径：1.2 mm，内径：0.9 mm，长度：10 cm		Sutter InstrumentB120-90-10
拉针仪 P-87Sutter Instrument
Stemi 2000 体视显微镜Zeiss
Axiozoom V16 体视变倍显微镜Zeiss

参考文献

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