激光捕获显微切割分离新鲜冷冻人体肠神经节的优化

Summary

该协议的目的是获得高完整性的 RNA 样本从无固定的, 新鲜切除的人肠道组织, 利用激光捕获显微切割 (LCM) 分离。该协议包括制备人体肠道组织、cryosectioning、乙醇染色和脱水、LCM 和 RNA 提取的闪光冷冻样品。

Abstract

该方法的目的是通过激光捕获显微切割 (LCM) 从未固定的、新鲜切除的人肠道组织采集的肠神经节获得高完整性的 RNA 样本。我们已经确定了工作流程中的五个步骤, 对于从肠神经节获取 rna 分离的关键, 它的质量和数量足以为 rna--首先, 在准备肠道组织时, 每个样品必须有所有多余的液体去除的印迹之前, 使浆膜尽可能多地在底部的大基模具。然后在干冰和2丁烷的泥浆上迅速冻结样品。第二, 当切片的组织, 重要的是放置 cryomolds, 使肠道部分平行的全平面的肌间丛丛, 从而产生最大的肠道神经节每张幻灯片的面积。第三, 在 LCM 过程中, 聚乙烯 napthalate (笔) 膜幻灯片在收集肠神经节时, 可以提供最大的速度和灵活性来勾勒出肠道神经节的非均匀形状。第四, 对于不同的肠道神经节可视化, 与乙醇相容的染料, 如甲酚紫罗兰, 提供优良的保存相对于水染料的 RNA 完整性。最后, 为了从捕获的神经节中提取 rna, 我们观察了商业 rna 提取试剂盒中产生的 rna 数量和质量的差异, 同时消除了 DNA 污染。这些因素在当前协议中的优化极大地加速了工作流, 产生了异常的 RNA 质量和数量的肠神经节样本。

Introduction

本方法旨在利用激光捕获显微切割技术从人体肠道组织获得高质量的肠道神经节 RNA 样品。此处描述的协议已经过优化, 以提供足够的 rna 质量和 rna 排序 (rna 序列) 的产量, 并打算用于与新鲜切除, 无固定, 闪光冷冻人类肠道组织。

功能性胃肠道和肠道运动障碍影响美国每四人之一。肠神经系统, 也称为第二脑¹, 往往是这些疾病的中心, 因为它在肠道动态平衡和运动中起着关键的作用。对肠道运动的操纵一般限于手术切除 aganglionic/noncontractile 组织, 慢性饮食修饰和/或药物。令人惊讶的是, 成人的完整转录仍然是排序, 大大限制了我们的能力, 以鉴定在体内的分子, 可以被靶向药用或用于干细胞治疗。

从人肠道神经节中分离 RNA 的方法相对较少。第一种方法, 细胞离解², 需要高的孵化温度和长时间的潜伏期;这两种都是已知的促进 RNA 降解和改变转录^2,3。另一种方法, LCM, 更可靠地保存转录和保护 RNA 完整性。虽然一些研究已经使用 LCM 收集神经节从新鲜冷冻人类肠道组织^4,

Protocol

此处描述的所有协议都已由范德比尔特大学机构审查委员会批准。

1. 组织到达前的准备工作

1. 获得适当的 IRB 批准, 并与人体器官捐赠机构协调, 从捐赠者那里获得新切除的无固定肠道组织, 以满足研究所需的所有研究标准。
   注: 本协议可适用于小鼠和其他啮齿动物模型使用。
   1. 在每肠段切除后立即, 用冷冻 PBS 或组织贮存培养基彻底冲洗腔体, 以除去残留的腔内材料或粪便。
   2. 在适当的生物危害容器中冲洗和丢弃废物后, 将组织浸入足够数量的组织储存培养基中 (如肠道组织体积的3-5 倍), 并贮存在单独标记的水密塑料中。容器, 浸没在冰或冷藏, 直到使用)。
   3. 从收集时间起18-26 小时内处理组织, 以防止大量 RNA 降解。
      注意: 根据肠道和储藏的清洁程度, 可以延长我们建议的时间限制。
2. 如本议定书所示, 事先准备好人体组织收集所需的所有材料 (请参阅材料表以了解详细的产品信息)。确保所有所需的个人防护设备始终佩戴。
3. 准备干冰桶连同干冰泥浆, 如图 1所示。
   1. 粉碎足够的干冰, 以填补4标准圆形冰桶和一个长方形的冰桶。一个标准的桶应该有小 (11 x 21 cm) 实验室组织放置在干冰表面。如果可能, 使用新的, 未开封的实....

Results

我们已经对现有的协议进行了几项改进, 通过 LCM 能够相对快速地从人体肠道样本收集肠道神经节, 达到 RNA 序列的标准。首先, 我们优化了在 2 MB (图 1B) 放置在干冰泥浆表面的大型基模中肠道组织段的快速冻结。最佳的成功在 cryosectioning 和随后 LCM 是通过放置肠段平在一个基地模子, 面对黏膜边上升 (图 1 b-1 c) 获得。确保基础模具尽可能平坦的基础上, 因为任何曲率将使它更难以获得一个大断面的肌间丛丛。这种方法导致的组织, 容易切片 8-µm 厚度 (图 1E), 并允许完全消除 TFM 从染色过程。我们发现, TFM 干扰染色过程, 从而掩盖了肠道神经节的鉴别。定位组织在这个方向也避免切片通过粘膜, 其中有高含量的 RNases¹², 虽然从我们的经验来看, 乙醇污.......

Discussion

这个过程使许多肠道神经节的有效收集成为 rna 的来源在这里, 我们加速了现有协议中概述的过程, 同时最大限度地保留了 RNA 完整性。由于这一程序中的所有步骤都是相互依存的, 因此必须在研究开始时消除所有的问题, 并尽可能以同样的方式编写所有的样本, 以获得可靠的 RNA--

从程序的开始, 如果时间间隔 (冷缺血时间) 在器官捐赠时组织的收集和接收组织在实验室中的处理时间过长, RNA 完整性可能会受到负面影响。考虑到这一问题, 我们感到惊讶的是, 即使在24小时的冷缺血时间之后, 还可以从肠道标本中提取高质量的 RNA。当肠道样品在冷藏液中冷藏保存妥当时, 对组织完整性和 RNA 质量有极好的保护作用。我们要求器官收集小组在收集时将肠道组织冲洗, 以限制肠道对消化酶、RNases 和其他可能影响 RNA 质量的分子的接触。我们发现, 当肠道标本没有完全冲洗, 这可以大大减少样品的玲。

使用我们的优化程序, 以制备肠道组织样本, 我们可以避免嵌入样品在 TFM。由于 TFM 与乙醇和二甲苯相互作用, 形成一种暗褐色沉淀, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma	HT501128-4L
2-甲基丁烷	Fisher	O3551-4
3 mL 注射器	BD	309628
50 mL 锥形管，聚丙烯	康宁	05-526B
基模 37x24x5mm，一次性	电子显微镜科学	5025511
Belzer UW 冷藏解决方案	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM 瓶盖	Arcturus、ThermoFisher	LCM0211
保鲜膜、压榨膜n 密封	很高兴	不适用
甲酚紫醋酸酯	Acros 有机物	AC405760025
砧板	电子显微镜科学	63308
乙醇，190 级	Pharmco-AAPER	111000190
乙醇，200 级	Pharmco-AAPER	111000200
玻璃显微镜载玻片	Fisher	12-550-343
手套，加长袖口	Microflex
手术一次性	Kimberly-Clark 手术服	19-088-2116
托盘，20 L（大型聚丙烯灭菌盘）	Nalgene	1335920B
Kimwipes （大）	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes （小）	Kimberly-Clark	34133
激光捕获显微切割系统 （ArcturusXT）	ThermoFisher	N.A.
Leica 低温恒温器卡盘，大号，  40 mm	东南病理学仪器服务	N.A.
光学显微镜	奥林巴斯	CX43
显微镜物镜 （20X）	奥林巴斯 UPlanFl 20X/0.50， ∞/0.17	N.A.
显微镜物镜 （10X）	奥林巴斯 UPlanFl 10X/0.25， ∞/-	N.A.
分子筛	Acros Organics	AC197255000
无核酸酶水	Ambion	AM9937
PicoPure RNA 提取试剂盒	Applied Biosystems	12204-01
颗粒杵	Kimble Kontes	4621973
PEN 膜 LCM 载玻片	Arcturus，ThermoFisher	LCM022
不含 RNase 的试管，1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA 提取试剂盒 "A" （PicoPure）	Applied Biosystems	12204-01
RNA 提取试剂盒 "B" （RNeasy 微量试剂盒）	Qiagen	74004
RNA 提取方法 "C" （TRIzol）	Invitrogen	15596-026
RNA 提取试剂盒 "D" （RNeasy PLUS 迷你试剂盒）	Qiagen	74134
防溅罩，一次性面罩	Fisher	17-310
剪刀，外科手术，14.5 cm "锐利"	精细科学工具	14002-14
针头过滤器，醋酸纤维素 （0.2 μm）	Nalgene	190-2520
组织冷冻培养基	通用数据 医疗保健	TFM-5
二甲苯	Fisher	X3P1GAL