优化激光显微切割技术以分离新鲜冷冻人组织中的肠神经节

摘要

本实验方案的目的是利用激光显微切割技术（LCM），从未经固定、新鲜切除的人类肠道组织中分离肠神经节，并获得高完整性的RNA样本。该方案包括制备速冻的人类肠道组织样本、冷冻切片、乙醇染色与脱水、激光显微切割以及RNA提取等步骤。

摘要

本方法旨在利用激光显微切割技术（LCM），从未固定的新鲜切除的人类肠道组织中分离的肠神经节获取高完整性的RNA样本。我们已确定工作流程中的五个关键步骤，以确保从肠神经节中提取的RNA在质量和数量上均足以满足RNA测序的要求。第一，在制备肠道组织时，每个样本必须在将浆膜尽可能展平于大号底模底部之前，通过吸水纸彻底去除所有多余液体。随后，将样本迅速置于干冰与2-甲基丁烷混合物上进行速冻。第二，在组织切片过程中，应正确放置冷冻模具，使肠道切片与肌间神经丛的完整平面平行，从而在每张切片上获得最大面积的肠神经节暴露。第三，在激光显微切割过程中，采用聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片可更快速、灵活地勾勒出肠神经节不规则的外形，便于高效收集。第四，为了在组织切片中清晰识别肠神经节，相较于水溶性染料，使用乙醇兼容性染料（如焦宁 Violet）能更好地保持RNA的完整性。最后，在从捕获的神经节中提取RNA时，我们发现不同商业RNA提取试剂盒在RNA产量和质量方面存在差异，其中某些试剂盒不仅能显著提高RNA的得率和纯度，还可有效去除DNA污染。在本方案中对上述各因素进行优化，可极大加快实验流程，并获得RNA质量和数量均极为优异的肠神经节样本。

引言

本方法旨在利用激光捕获显微切割技术（LCM）从人肠道组织中获取高质量的肠神经节RNA样本。本文所述方案已优化，可获得适用于RNA测序（RNA-seq）的足够质量和产量的RNA，适用于新鲜切除、未经固定、速冻的人肠道组织。

功能性胃肠道疾病和肠道运动障碍影响着美国四分之一的人口。肠神经系统（ENS）通常被称为“第二大脑¹”，在这些疾病中常处于核心地位，因为它在维持肠道稳态和运动功能中发挥着关键作用。目前对肠道运动的干预手段通常仅限于手术切除无神经节或无收缩功能的组织、长期饮食调整和/或药物治疗。令人意外的是，成年个体肠神经系统的完整转录组至今尚未完成测序，这极大地限制了我们识别肠神经系统中可用于药物靶向或干细胞治疗的分子的能力。

目前从人肠神经节中分离RNA的方法相对较少。第一种方法是细胞解离²，该方法需要较高的孵育温度和较长的孵育时间；而这两个因素均已被证实会促进RNA降解并改变转录组^2,3。另一种替代方法——激光显微切割（LCM），能更可靠地保持转录组的完整性，并保护RNA的完整性。尽管已有若干研究采用LCM从新鲜冷冻的人类肠道组织中收集神经节^4,

方案

本文所述所有方案均已获得范德比尔特大学机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 组织样本到达前的准备工作

1. 获得适当的机构审查委员会（IRB）批准，并与人体器官捐献机构协调，获取符合研究所需全部标准的供体新鲜切除、未固定的肠道组织。
   ​注意：本方案可适用于小鼠及其他啮齿类动物模型。
   1. 每个肠段切除后，立即用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）或组织保存液彻底冲洗肠腔，以清除残留的腔内容物或粪便。
   2. 冲洗后，将废液排入适当的生物危害容器中并丢弃，随后将组织浸入足量的组织保存液中（如组织体积的3-5倍），置于单独标记且密封的塑料容器内，保持冰上或冷藏保存直至使用。
   3. 在组织采集后18-26小时内完成处理，以防止RNA显著降解。
      注意：根据肠段的清洁程度和保存条件，可能可以适当延长建议的时间限制。
2. 按照本方案提前准备好人体组织采集所需的所有材料（详见材料表中更详细的产品信息）。确保始终穿戴所有必要的个人防护装备。
3. 按照图1所示准备干冰桶及干冰浆。
   1. 粉碎足量干冰，填满4个标准圆形冰桶和1个矩形冰桶。其中一个标准冰桶表面应放置小尺寸（11 x 21 cm）的实验室用纸巾。如有可能，使用全新....

结果

我们对现有方案进行了多项改进，能够利用激光显微切割技术（LCM）从人肠道样本中相对快速地采集肠神经节，并满足RNA测序（RNA-Seq）的质量标准。首先，我们优化了将肠道组织片段快速冷冻的方法：将大号底模置于盛有干冰与2-甲基丁烷（2-MB）混合物的容器表面进行冷冻（图1B）。在冷冻切片及后续激光显微切割过程中，最成功的做法是将肠道片段平放于底模内，黏膜面朝上（图1B-1C）。应确保底模底部尽可能平整，任何弯曲都会显著增加获取完整肌间神经丛横截面的难度。采用此方法可轻松切出厚度为8 µm的组织切片（图1E），并可完全省去染色过程中的组织固定剂（TFM）。我们发现TFM会干扰染色过程，从而影响肠神经节的识别。将组织以该方向放置还可避免切到富含RNase的黏膜层¹²；尽管根据我们的经验，使用乙醇类染液在很大程度.......

讨论

该方法能够高效收集大量肠神经节，作为提取RNA用于RNA测序的来源。本文在最大限度保持RNA完整性的前提下，优化并加快了现有方案中的各个步骤。由于本实验流程中所有步骤相互关联，因此必须从研究初期即排除所有问题，并尽可能使所有样本的处理条件保持一致，以获得可靠的RNA测序结果。

从实验开始时起，如果器官捐献后组织采集与实验室接收处理之间的时间间隔（冷缺血时间）过长，RNA的完整性可能受到不利影响。鉴于这一问题，我们惊讶地发现，即使冷缺血时间长达24小时，仍能从肠道样本中提取出高质量的RNA。当肠道样本在低温保存液中被妥善冷藏和储存时，组织完整性和RNA质量可得到极好的保护。我们要求器官采集团队在采集时立即对肠道组织进行灌洗，以限制肠道暴露于消化酶、RNase及其他可能在此期间影响RNA质量的分子。我们发现，若肠道标本未完全灌洗，会显著降低样本的RIN值。

通过采用我们优化的肠道组织样本制备流程，能够避免将样本包埋在TFM中。由于TFM会与乙醇和二甲苯反应生成深棕色沉淀物，干扰肠神经节的观察，因此我们倾向于在样本中排除TFM的使用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma	HT501128-4L
2-甲基丁烷	Fisher	O3551-4
3 mL注射器	BD	309628
50 mL 圆底离心管，聚丙烯材质	康宁	05-526B
一次性底模 37x24x5mm	电子显微镜科学公司	5025511
Belzer UW  冷储存液	生命之桥	N.A.
CapSure 宏激光显微切割帽	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
保鲜膜，按压’n 封口	格拉德	N.A.
乙酸焦油紫	Acros Organics	AC405760025
砧板	电子显微镜科学公司	63308
乙醇，190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
乙醇，200度	Pharmco-AAPER	111000200
玻璃显微镜载玻片	Fisher	12-550-343
手套，加长袖口	Microflex	19010144
一次性外科手术服	Kimberly-Clark	19-088-2116
托盘，20 L（大型聚丙烯灭菌盘）	Nalgene	1335920B
Kimwipes（大号）	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes（小号）	Kimberly-Clark	34133
激光捕获显微切割系统（ArcturusXT）	ThermoFisher	N.A.
徕卡冷冻切片机样本头，大型  40 mm	东南病理仪器服务	N.A.
光学显微镜	Olympus	CX43
显微镜物镜（20X）	奥林巴斯 UPlanFl 20X/0.50 ∞/0.17	N.A.
显微镜物镜（10X）	奥林巴斯 UPlanFl 10X/0.25 ∞/-	N.A.
分子筛	Acros Organics	AC197255000
无核酸酶水	Ambion	AM9937
PicoPure RNA 提取试剂盒	应用生物系统公司	12204-01
研钵与研杵	Kimble Kontes	4621973
PEN膜LCM切片	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
无RNase离心管，1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA提取试剂盒 "A" (PicoPure)	应用生物系统公司	12204-01
RNA提取试剂盒 "B" (RNeasy  微型试剂盒	Qiagen	74004
RNA提取方法 "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA提取试剂盒 "D" （RNeasy PLUS Mini试剂盒）	Qiagen	74134
防溅面罩，一次性面罩	Fisher	17-310
手术剪，14.5 cm "锐-锐"	Fine Science Tools	14002-14
注射器滤器，醋酸纤维素（0.2 μm)	Nalgene	190-2520
组织冷冻介质	通用医疗健康数据	TFM-5
二甲苯	Fisher	X3P1GAL