本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。
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方法文章
利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
心脏所经历的血流动力学力影响心脏发育，尤其是小梁化过程，后者由心肌层分支出的突起形成网状结构。Notch信号通路中的遗传程序缺陷与左心室致密化不全心肌病或左心发育不全综合征等心室缺陷相关。通过本方案可确定，由剪切应力驱动的小梁化过程与Notch信号通路之间存在关联。利用光片荧光显微镜，实现了对斑马鱼心脏发育过程的可视化观察。本文评估了血流动力学力是否通过Notch信号通路调控小梁化的起始，从而影响收缩功能。为进行剪切应力的定性与定量分析，在斑马鱼心脏形态发生过程中获取了四维（三维+时间）图像，并结合四维同步技术整合光片荧光显微镜，捕捉了心室的运动过程。通过显微注射gata1a-吗啉代寡核苷酸（MO）降低血液黏度，以减少剪切应力，从而下调Notch信号通路并抑制小梁化。共注射Nrg1 mRNA与gata1a MO可恢复Notch相关基因的表达，使小梁化得以重建。为证实剪切应力驱动的Notch信号通路对小梁化的影响，进一步通过tnnt2a-MO抑制心肌细胞收缩，以降低血流动力学力，从而下调Notch靶基因，形成无小梁结构的心肌。最后，通过对内皮细胞施加脉动流，验证了剪切应力响应性Notch基因的表达模式。因此，四维光片显微镜揭示了血流动力学力在Notch信号通路与小梁化中的作用，对致密化不全性心肌病具有临床相关意义。
引言
生物力学力（如血流动力学剪切应力）深度参与心脏形态发生过程。在血流动力学剪切力的作用下，心肌脊和心肌沟以波浪状的小梁网络形式发育，并与房室（AV）瓣膜处剪切应力的方向一致1。心脏小梁化对于增强心肌收缩功能和增加心肌质量至关重要2。Notch信号通路的突变会导致人类及其他脊椎动物出现先天性心脏病3。例如，gata1a4 和 tnnt2a5 的吗啉代寡核苷酸（MO）已被证明可减少红细胞生成，而促红细胞生成素mRNA（EPO）6 和异丙肾上腺素（ISO）7 则分别增加红细胞数量和心率，从而提高血管壁剪切应力（WSS）。此外，作为Notch信号通路下游的ErbB2信号可促进心肌细胞增殖与分化，产生收缩力，进而激活Notch信号通路8,9。研究表明，剪切应力调控由Notch信号介导的小梁化过程，以推动心室发育。目前已有大量研究致力于进一步阐明导致先天性心脏病（CHD）的遗传编程事件10....
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方案
以下方法均按照德克萨斯大学阿灵顿分校（UTA）和加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物护理与使用委员会（IACUC）的规程进行。实验分组使用了转基因品系Tg(cmlc2:gfp)、wea (weak atrium) 或 clo (cloche) 突变体，包括：（a）野生型（WT）对照组，（b）gata1a MO 注射组，以及（c）tnnt2a MO 注射组（表 1）。
| 模型 | 名称 | 修饰基因 | 表型 | 参考文献 |
| 对照 | 野生型 | 无 | N/A | |
| Tg(cmlc2:gfp) | 心肌肌球蛋.... |
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结果
本研究采用光片荧光显微镜（LSFM）获取高分辨率的二维和三维图像。如图1A和1B所示，照明物镜将光片投射到样品上。由于光片非常薄，仅能照亮一个平面。检测物镜与照明物镜垂直放置，并聚焦于被照亮的平面（图1B）。随后，来自照明物镜的光片从左至右扫描样品（图1C）。这种扫描方式可减少光漂白和光毒性，并具有较低的信噪比。
LSFM 被应用于 Tg(cmlc2a:gfp) 胚胎以可视化完整的心脏结构34 通过快速扫描（> 30 秒，体素分辨率为 0.65 × 0.65 × 1 µm由于采用单平面照明，背景噪声显著降低 (图1.......
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讨论
在本实验方案中，我们证明了4D成像可用于追踪小梁网络在生物力学力变化下的发育过程。具体而言，内皮细胞所经历的剪切应力会启动Notch信号级联反应，从而促进心肌小梁的形成。在本研究中，我们证明了以下三点：（1）gata1a MO注射减少了造血作用，从而降低了管壁剪切应力；（2）tnnt2a MO注射抑制了心室的收缩功能，进而降低管壁剪切应力；（3）wea突变体缺乏心房收缩，导致作用于心室的血流动力学力下降。通过降低心脏壁上的剪切应力，我们利用qRT-PCR定量分析了Notch信号，发现当壁面剪切应力（WSS）降低时，Notch信号也随之减弱。为进一步验证我们的假设，缺乏心内膜的clo突变体未能形成心肌小梁；而在存在ADAM10的情况下，对内皮细胞施加脉动性剪切应力的实验表明，剪切应力可激活Notch信号通路。
其他成像技术（如共聚焦显微镜）可用于对样品进行三维成像14。然而，该技术及其他类似技术存在诸多局限性。例如，共聚焦成像难以深入穿透样品，轴向分辨率较低，且扫描.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢斯坦福大学的 William Talbot 提供人源 Nrg1 cDNA，感谢加州大学圣地亚哥分校的 Deborah Yelon 提供 wea 突变体。作者还感谢 Cynthia Chen 在图像采集方面提供的帮助。本研究获得了以下资助：NIH HL118650（授予 T.K. Hsiai）、HL083015（授予 T.K. Hsiai）、HD069305（授予 N.C. Chi 和 T.K. Hsiai）、HL111437（授予 T.K. Hsiai 和 N.C. Chi）、HL129727（授予 T.K. Hsiai）、T32HL007895（授予 R.R. Sevag Packard）、HL134613（授予 V. Messerschmidt）以及德克萨斯大学系统 STARS 项目资金（授予 J. Lee）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Clontech Hifi PCR 预混液 | Takara | 639298 | PCR 预混液 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4 |
| 人 Nrg1 cDNA | 由美国加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学 William Talbot 惠赠 | N/A | 用于小梁结构挽救实验 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1 |
| CFX Connect™ 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | 1855201 | PCR 仪 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2 |
| pCS2+ | GE Health | 用于合成 mRNA 的质粒 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5 | |
| Nucleospin 核酸纯化试剂盒 | Clontech | 740609.25 | DNA 纯化 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2 |
| T4 DNA 连接酶 | Clontech | 2011A | PCR 连接反应溶液 1.1.2.5 |
| Stellar 感受态细胞 | Clontech | 636763 | E. coli 转化用细胞 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2 |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Life Technologies | 11668027 | 转染试剂 1.1.4 |
| mMessage SP6 体外转录试剂盒 | Invitrogen | AM1340 | 用于合成 mRNA 的试剂盒 1.1.6.3 |
| Aurum 总 RNA 小量提取试剂盒 | Bio-Rad | 7326820 | RNA 纯化 1.1.6.4, 3.1.2 |
| GeneTools 4.3.8 | GeneTools | N/A | 引物设计软件 1.2.1, 3.1.3 |
| EPO cDNA | Creative Biogene | CDFH006026 | 增加壁面剪切应力（WSS） 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7 |
| AG1478 | Sigma-Aldrich | T4182 | ErbB 抑制剂 1.3.1 |
| E3 培养基 | 用于胚胎培养 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5 | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | γ-分泌酶抑制剂 1.3.2 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | 用于胚胎封片 2.1.1.1 |
| ORCA-Flash4.0 LT 数字 CMOS 相机 | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | 用于图像采集 2.1.1.2, 2.1.1.3 |
| Amira 软件 | FEI Software | N/A | 用于将图像可视化并分析为三维（3D）和四维（4D） 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8 |
| 三卡因甲磺酸盐 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | 用于人道地麻醉或处死胚胎 3.1.1 |
| iScript cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 | cDNA 合成 3.1.2 |
| Eppendorf 5424 微型离心机 | Eppendorf | 05-400-005 | 微型离心机 4.1.1.3 |
| GI254023X | Sigma-Aldrich | 260264-93-5 | ADAM10 抑制剂 4.1.2, 4.1.3 |
| 异丙肾上腺素盐酸盐 | Sigma-Aldrich | I5627 | 异丙肾上腺素可增加壁面剪切应力（WSS） 5.1.5 |
| MATLAB | Mathworks | N/A | 心脏力学分析 |
参考文献
- Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
- Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
