本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。
本文内容
摘要
摘要
利用小鼠模型模拟人类肾脏疾病正变得越来越普遍。我们的研究重点是评估糖尿病肾病以及足细胞特异性 VEGF-A 基因敲除小鼠的肾小球功能；因此，本方案详细描述了我们实验室用于评估这些肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检测流程，从而能够从单只小鼠中获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。与文献中报道的其他评估肾小球功能的方法相比，本文所述方法可从多个方面全面评估肾小球表型。采用该方法，研究人员可确定模型的肾脏表型，并阐明表型形成的机制。在探索这些模型中潜在治疗途径时，有关疾病机制的此类关键信息至关重要。该方法可通过测定尿白蛋白/肌酐比值和单个肾小球水通透性，对肾小球滤过屏障进行详细的功能评估，同时结合过碘酸-希夫（Periodic Acid Schiff）染色和电子显微镜技术进行结构和超微结构分析。此外，对 mRNA 和蛋白水平上表达异常基因的分析，有助于深入解析肾小球功能的分子机制。本方案概述了一套通用且可灵活调整的方法，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型研究。
引言
利用小鼠模型模拟人类肾脏疾病正变得越来越普遍。这类小鼠模型包括自发性模型，如自发性高血压大鼠（SHR）1、链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠和小鼠2以及db/db 2型糖尿病小鼠3；基因工程模型，如足细胞特异性的原发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）模型4、足细胞特异性血管内皮生长因子A（VEGF-A）敲除（VEGF-A KO）模型5和Alport综合征模型6；以及获得性模型，如5/6肾切除模型7和单侧输尿管梗阻（UUO）模型8。为了评估这些模型中肾小球功能的不同方面，已有多种技术可供使用。本文方法学论文的目的是展示在肾脏疾病小鼠模型中应进行的一套全面检测流程，以充分评估肾小球功能。
采用该方法的原理在于，能够从多个方面全面评估肾小球表型，包括评估肾小球对蛋白质和水的通透性、肾小球结构异常，以及对维持正常肾小球功能至关重要的mRNA和蛋白质表达/剪接的变化。通过使用该方法，研究人员能够确定模型的肾脏表型，并阐明表型形成的机制。这些信息对于理解疾病机制至关重要，而在利用这些模型探索潜在治疗途径时，必须掌握此类机制信息。
在文献中，常会遇到以尿液中白蛋白水平升高来确定表型的肾小球疾病小鼠模型。然而，有证据表明，仅用单一方法评估肾小球功能并不总是有效的；测定尿白蛋白排泄率或尿白蛋白肌酐比值（uACR）仅能提供关于整体肾功能的信息，而无法反映单个肾小球的情况。既往研究已表明，同一肾脏中不同肾小球的通透性可能存在差异5,9,10。此外，对单个肾小球通透性的评估是检测肾小球功能更为敏感的方法；测量单个肾小球水通透性（LpA/Vi）的技术已被证明比测定uACR对肾小球功能变化更为敏感9。该检测方法在对蛋白尿具有抵抗性的小鼠模型中尤为有益，例如c57BL/6背景的小鼠模型11。本方法学论文的优势在于，同时考察了肾脏整体对白蛋白的通透性以及单个肾小球对水的通透性。
肾小球结构异常的检测通常需采用一系列染色方法，如过碘酸-雪夫（Periodic Acid Schiff, PAS）染色、三色染色和银染法。这些方法可使训练有素的肾脏病理学家通过评分系统评估肾脏疾病的严重程度。尽管上述方法均较为可靠，但在急性肾损伤模型中，并不总是能观察到肾小球大体结构的改变12。本方法建议，在实施上述肾脏组织学技术的同时，还应通过透射电子显微镜（electron microscopy, EM）评估肾小球的超微结构。在普通光学显微镜下，染色后的肾小球可能看起来相对正常；然而，通过电子显微镜观察，可分析肾小球基底膜（GBM）厚度、足细胞足突融合情况、内皮细胞窗孔结构以及足细胞下腔隙覆盖程度的细微变化。因此，为明确肾小球功能障碍的机制，同时评估肾小球的超微结构与显微结构至关重要。
除了评估肾小球结构异常外，还应检测 mRNA 和蛋白质表达及剪接的变化，以及蛋白质的活化（例如，磷酸化），以进一步阐明肾小球疾病的发病机制。在研究肾小球疾病时，或例如在肾小球细胞中特异性敲除或过表达某个基因时（如足细胞特异性 VEGF-A 基因敲除小鼠5），重要的是仅在肾小球细胞内检测蛋白质和 mRNA 的变化，而非整个肾脏。本方案描述了一种从小鼠肾脏皮质中分离肾小球，再从中提取蛋白质和 RNA 的方法。这使得能够特异性分析疾病模型中肾小球内蛋白质和 mRNA 的异常调控。
本方案描述了一种针对肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检查方法，可从单只小鼠中获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。这些方法可用于对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，并适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。
方案
所有实验均按照英国法律法规及当地伦理委员会批准进行。动物研究已获布里斯托大学研究伦理委员会批准。
1. 尿白蛋白肌酐比（uACR）
注意：尿白蛋白肌酐比值（uACR）用于评估肾小球滤过屏障（GFB）对白蛋白的通透性。尿液中出现白蛋白表明肾小球滤过屏障通透性增加，通过与肌酐比值可校正尿流速变化带来的影响。白蛋白尿是慢性肾脏病的常见标志物。
- 在实验基线期以及直至实验终点的规律时间间隔（每周一次至每月一次）收集尿液。
- 准备好小鼠代谢笼，加入水和强化饮食。将雄性小鼠（6–8周龄）单独放入代谢笼中，在安静房间内放置6小时。
- 将小鼠放回常规饲养笼，并从空的代谢笼中收集尿液。所需尿液量至少为50 µL。
注意：若小鼠在规定时间内未排尿，可在另一天于较温暖的房间中重复操作。 - 以500 × g离心尿液10分钟。收集上清液，并保留沉淀物以评估足细胞丢失情况。短期储存时将尿液置于-20 °C保存。
- 根据白蛋白尿的严重程度，将尿液用含1%牛血清白蛋白（BSA）的1× Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.5）稀释至1:500至1:10000。
注意：最终体积应>400 µL。需优化以确定每个时间点的最佳稀释倍数。 - 按照试剂盒说明书，使用小鼠白蛋白酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量尿液白蛋白浓度。
- 简要而言，在室温下用100 µL抗小鼠白蛋白一抗（10 µg/mL溶于0.5 M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）包被适用于蛋白结合的ELISA板，孵育1小时。
- 用含0.05% Tween的1× TBS（pH 8.0）洗涤5次，每孔加入200 µL封闭液（含1% BSA的1× TBS，pH 8.0），室温孵育过夜。
- 洗涤5次后，每孔加入100 µL标准品（系列稀释：2000 µg/mL至15.63 µg/mL，溶于含1% BSA的1× TBS，pH 8.0）、空白对照及稀释后的样本，每样本设三个复孔。室温孵育1小时后，洗涤5次。
- 每孔加入100 µL HRP标记的检测抗体（10 ng/mL溶于含1% BSA的1× TBS，pH 8.0），室温孵育1小时。
- 洗涤5次后，每孔加入100 µL酶底物溶液。避光显色15分钟，随后加入100 µL 0.18 M硫酸（H2SO4）终止反应。
警告：H2SO4具有腐蚀性。
- 在450 nm波长下读取吸光度，测定各样本的白蛋白浓度。利用标准曲线定量各样本中的白蛋白含量。若技术重复间的变异系数（CV）大于5%，则需对这些样本重复检测。
- 也可采用电泳法评估尿液白蛋白浓度。向15 µL尿液中加入5 µL 4×蛋白上样缓冲液。95 °C加热10分钟后，上样至4–12% Tris预制胶。
- 以100 V电压电泳，并按照试剂盒说明书用考马斯亮蓝染色过夜。
- 凝胶成像后，采用密度测定法评估相对于对照组的白蛋白浓度变化倍数。
注意：若预期应出现白蛋白条带但未观察到，应检测尿液蛋白浓度，并调整上样尿液量。
- 将原始尿液样本用dH2O按1:1、1:5和1:10比例稀释。
注意：最终体积应>70 µL。需优化以确定各样本的最佳稀释比例。 - 根据试剂盒说明书，使用化学比色法测定尿肌酐浓度。简要步骤：将20 µL肌酐标准品、空白对照或稀释后尿液分别加入96孔板，每样本设三个复孔。
- 在加入酸溶液前后，于490 nm波长下读取吸光度以确定各样本的肌酐浓度（警告：酸溶液具腐蚀性，避免接触皮肤）。
注意：吸光度差值与各样本中肌酐浓度成正比。根据标准品生成标准曲线。若技术重复间的变异系数（CV）大于5%，则需对这些样本重复检测。 - 计算尿白蛋白/肌酐比值（uACR，单位：µg/mg）。为便于图形展示，将数据标准化为每只小鼠的基线值。
2. 组织和血液采集
注意：肾脏和肾小球组织可用于评估肾病的结构、蛋白质和 mRNA 表达标志物。血液可用于评估肾功能标志物，例如肌酐，其在肾病中可能上调，表明肾小球滤过能力下降。
- 配制以下溶液：新鲜的2.5%戊二醛溶于0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3），4%多聚甲醛溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS），哺乳动物林格氏溶液（115 mM氯化钠（NaCl），10 mM醋酸钠（CH3COONa)、1.2 mM 磷酸钠（Na2HPO4)，25 毫摩尔碳酸氢钠（NaHCO₃）3)，1.2 毫摩尔每升硫酸镁（MgSO₄）4)，1 mM 氯化钙（CaCl2)，5.5 mM D(+)-葡萄糖，pH 7.4）含1% BSA，以及1×PBS。
警告：2.5% 戊二醛：有毒，可致敏，具刺激性；需在通风橱中使用。0.1 M 二甲胂酸钠：有毒，需在通风橱中使用。4% 多聚甲醛：固定剂，需在通风橱中使用 - 准备以下材料：异氟烷、小型乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血管、23–25G针头、5 mL EDTA抗凝注射器、10 mL玻璃瓶、10 mL塑料瓶、0.5 mL塑料管、一次性组织模具、干冰、液氮2，小鼠手术工具和最佳切割介质（OCT）
- 将小鼠置于深度麻醉状态，麻醉效果通过足垫针刺无反应来确认，可使用异氟烷麻醉舱，或等效的终末麻醉方式，如注射用麻醉剂（戊巴比妥钠，50 mg/kg 腹腔注射 [IP]；Avertin，240 mg/kg IP），或二氧化碳（CO₂）2) 暴露（75% CO225% O2).
- 通过心脏穿刺左心室处死小鼠，并尽可能收集血液。转移至EDTA包被的采血管中，可在4小时内保存。如 preferred，可通过颈椎脱位处死小鼠，注意避免颈静脉破裂。
- 通过腹部取出肾脏，并用预冷的1x PBS洗涤。
- 为了观察皮质肾小球，取一段肾脏皮质组织，切除一端，切成1 mm大小3 组织块。为观察深层近髓肾小球，可采用相同技术处理髓质组织，将其置于5 mL 2.5%戊二醛溶液中，放入玻璃电镜管内，4 °C保存。
警告：2.5% 戊二醛溶液：有毒，可致敏，具刺激性；须在通风橱中使用
注意：为获得最佳效果，建议在1个月内完成处理。 - 进行组织学分析时，取肾脏上三分之一部分，以确保包含皮质和近髓肾小球，置于4 °C条件下用5 mL 4%多聚甲醛固定24小时。随后转移至5 mL 70%乙醇中24小时，再进行石蜡包埋。
警告：4% PFA：固定剂，需在通风橱中使用 - 进行免疫荧光实验时，取三分之一的肾脏组织，以确保包含皮质和髓质肾小球，将其放入组织模具中并包埋于OCT包埋剂中。置于干冰上速冻后，于-80 °C保存。
- 对于蛋白质和RNA，放置3个2毫米的样本3 将肾皮质组织块放入0.5 mL塑料管中，液氮速冻2-80 °C保存。如需长期保存组织用于RNA提取，将组织置于5倍体积的RNA稳定化溶液中，于-80 °C保存。
- 为分离肾小球，将剩余的肾脏组织切碎后置于含有1% BSA的5 mL哺乳动物林格液中，冰上保存。立即准备进行肾小球筛分。
3. 血浆肌酐
注意：血浆肌酐在肾病中可能升高，表明肾小球滤过能力下降。也可检测血尿素氮（BUN）水平，但本方案中未描述其具体操作步骤。
- 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心血液样本 15 分钟。
- 收集血浆，短期可在此时储存于 -20 °C。
- 使用化学肌酐检测试剂盒，按照方案 1.11 中尿液肌酐检测的上述说明，定量血浆肌酐浓度。
- 在加入酸溶液前后，于 490 nm 吸光度下读取酶标板，以确定每个样本的肌酐浓度。
注意：这些吸光度值之间的差值与每个样本中的肌酐浓度成正比。根据标准品生成标准曲线。如果技术重复样本的变异系数（CV）大于 5%，则需对该样本重新进行检测。
4. 肾小球的分离
注意：可分离肾小球以评估单个肾小球的通透性 离体以及肾小球疾病特异性蛋白和mRNA标志物的表达。
- 将置于含1% BSA的哺乳动物林格液中的肾组织取出，采用标准筛分法分离肾小球13简而言之，将70 µm（底部）、100 µm、125 µm、175 µm、250 µm 和 425 µm（顶部）的筛网依次堆叠在玻璃烧杯上。
- 使用注射器推杆将肾脏组织在425 µm筛网上研磨，并用含1% BSA的冰冻哺乳动物林格氏液将组织匀浆推过筛网。当肾脏组织碎片被推过后，移去上方的筛网，依次对下一个筛网重复相同操作。重复此过程，直至仅剩100 µm和70 µm筛网。
- 将被100 µm和70 µm筛网截留的肾小球收集物转移至含有1% BSA的10 mL新鲜哺乳动物林格液中，置于冰上。
注意：如果每毫升林格氏液中的肾小球数量较少，可减少从最后两个筛子收集肾小球时所用的林格氏液体积。 - 将含有肾小球的溶液取出5 mL，分装至两个独立的离心管中（每管2.5 mL），在4 °C下以1,000 × g离心10分钟。弃去上清液，将肾小球在液氮中速冻2 -80 °C 保存，用于日后提取蛋白质和 RNA。
- 将含有肾小球的剩余溶液置于37 °C水浴中，以测定肾小球LpA/Vi 离体 在取出肾脏后3小时内完成。
5. 肾小球水通透性（LpA/Vi）
注意：肾小球的 LpA/Vi 检测方法能够实现 离体 以快速且可重复的方式测量单个肾小球的通透性。肾小球L的增加pA/Vi 提示肾小球滤过屏障（GFB）受损，提示可能存在肾脏疾病。
- 建立肾小球LpA/Vi 如 Salmon 所述的装置 等10请参阅 图1 有关设置的详细示意图。
- 配制以下溶液：含1% BSA的哺乳动物林格液（pH 7.4）和含8% BSA的哺乳动物林格液（pH 7.4）。将两种溶液均预热至37 °C。
- 使用玻璃毛细管（光密度：1.2 mm）拉制微移液管。在显微镜下切割微移液管，制备出直径为5–8 µm的开口尖端。
- 使用肾小球LpA/Vi 使用吸力将无鲍曼囊和肾小管碎片的完整单个肾小球捕获至微移液管上。Salmon 中提供了肿瘤计量测定法的详细总结 等10简而言之，一旦肾小球被吸入微吸管并固定，即在显微镜下开始录制肾小球的视频。
- 首先，用1% BSA Ringer's溶液灌流肾小球并平衡30秒，随后更换为浓缩的8% BSA Ringer's溶液灌流10秒。然后将灌流液重新换回1% BSA Ringer's溶液，并停止记录。
- 冲洗掉肾小球，并对每只小鼠重复此过程以收集10–15个肾小球。确保灌流液流速保持一致且不过快（10 mL/min），以免破坏肾小球结构。
- 测量肾小球初始收缩速率以计算肾小球水通透性（LpA）归一化至肾小球体积（Vi有关分析的详细信息，可参见 Salmon 等10.
6. 过碘酸雪夫（PAS）染色
注意：PAS 染色将突出显示肾小球毛细血管袢的基底膜和肾小管上皮。该染色可实现对肾小球细胞、系膜基质及其可能扩张情况，以及肾小球基底膜（即增厚和不规则性）潜在变化的详细观察。
- 使用切片机将经PFA固定、石蜡包埋的肾皮质切成5 µm厚度的切片，置于多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，于37 °C干燥1小时。确保切片无皱褶或孔洞，以免在显微镜下观察时形态失真。
- 脱蜡：将载玻片先后浸入二甲苯（注意：具刺激性；应在通风橱中操作）中各3分钟，重复两次；再依次浸入100%乙醇中各3分钟，重复两次，随后分别浸入95%、70%和50%乙醇中各3分钟，所有步骤均在室温下进行。最后将载玻片在去离子水（dH2O）中充分水化。
- 将载玻片浸入高碘酸溶液（注意：具刺激性；应在通风橱中操作）（1 g/dL）中孵育5分钟，然后在多次更换的去离子水（dH2O）中冲洗。使用盛有100 mL去离子水（dH2O）的容器，于室温下操作。
注意：高碘酸溶液具有刺激性，需在通风橱中使用 - 将载玻片置于希夫试剂（盐酸副品红6 g/L，亚硫酸氢钠4%溶于0.25 mol/L盐酸中）中，室温孵育15分钟。随后用流动自来水冲洗载玻片5分钟。
- 用苏木精复染3秒，然后用流动自来水彻底冲洗载玻片15分钟。
注意：苏木精染色时间可能需要根据实际情况进行优化，以确定最佳染色时长 - 按照步骤6.2中脱蜡流程的逆向步骤进行脱水。最后以二甲苯结束脱水过程。
- 将载玻片自然晾干，并使用基于二甲苯的封片介质封片。
- 在光学显微镜下以400倍 放大倍数成像，评估肾小球结构。需评估以下指标：肾小球基底膜（GBM）增厚及不规则性、毛细血管袢塌陷、纤维化组织、硬化、细胞增殖（内皮细胞、足细胞、系膜细胞或炎性细胞浸润肾小球簇）。
注意：为全面评估肾小球病理生理变化，还应检查肾脏其他部位的病变，例如肾小管中的病变
7. 透射电子显微镜（TEM）
注意：透射电镜（TEM）可用于观察肾脏的超微结构异常，例如肾小球基底膜（GBM）、足细胞足突和内皮细胞窗孔，这些结构在光镜下无法看到。这在肾损伤表现不明显的模型中尤为重要即，无白蛋白尿及主要结构异常。
- 取2.5%戊二醛固定的切碎肾脏组织，用1%四氧化锇后固定1小时。用50 mL 0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.3）洗涤，再用50 mL去离子水（dH2O）洗涤（每次15分钟，共3次）。
警告：2.5%戊二醛：有毒，致敏物，刺激物；需在通风柜中操作。0.1 M焦砷酸钠（sodium cacodylate）：有毒，需在通风柜中操作。 - 用乙醇脱水，并包埋于Araldite树脂中。
- 切片厚度为50–100 nm，用3%（水溶液）醋酸铀染色，再用Reynolds铅柠檬酸溶液染色。
- 在肾小球多个区域以940倍、1250倍和6200倍拍摄数字显微照片，确保能够识别足细胞、肾小球内皮细胞（GEnCs）、肾小球基底膜（GBM）及系膜区。
- 使用ImageJ软件对盲法处理的肾小球进行分析。通过在已知距离的两点间画线，为每张6200倍显微照片设定标尺。进入“分析”菜单，选择“设定标尺”，此时线段长度将以像素显示。输入已知距离及单位。使用以下列出的方案测量各参数。
注意：每只小鼠的分析大约需要1天时间。为获得足够的统计效力，应采用来自3只小鼠的各3个肾小球的平均测量值。- 对于GBM厚度，在6200倍显微照片上叠加固定的数字网格（10 × 10），在网格线与GBM相交处测量其厚度。使用直线工具，从内皮细胞基底膜至足细胞足突基底膜，沿垂直于内皮细胞膜切线的方向进行测量。每个肾小球取10个独立测量值，计算其平均值。
- 对于内皮窗孔数量，测量6200倍显微照片中GBM的长度，并计算单位长度GBM上的内皮窗孔数目。每个肾小球至少取4张显微照片取平均值。
- 对于足细胞足突宽度，在6200倍显微照片上叠加固定的数字网格（10 × 10），测量穿过网格线的足细胞足突宽度。在足突与GBM接触处最宽的位置进行测量，确保测量线垂直于足细胞基底膜的切线方向。每个肾小球取10个独立测量值，计算其平均值。
- 对于足细胞裂孔宽度，在6200倍显微照片上叠加固定的数字网格（10 × 10），测量穿过网格线的足细胞裂孔隔膜宽度。该位置为相邻足突最接近处，位于每个足突最宽部分，从一个足细胞膜到另一个足细胞膜之间；确保测量线垂直于足细胞基底膜的切线方向。每个肾小球取10个独立测量值，计算其平均值。
- 对于足细胞足突数量，测量6200倍显微照片中GBM的长度，并计算单位长度GBM上的足细胞足突数目。每个肾小球至少取4张显微照片取平均值。
- 关于足细胞下间隙覆盖率的测量，请参见Neal et al.14中的详细方法。
- 利用940倍显微照片，肉眼观察肾小球是否存在异常结构、沉积物和浸润物。
8. 足细胞和内皮细胞标志物的免疫荧光染色
注意：免疫染色可实现蛋白质表达模式的可视化，例如肾小球疾病中可能塌陷的毛细血管环状内皮结构。
- 将含有冷冻肾脏的OCT模具置于-20 °C环境中2小时，待其充分冷却后再进行切片。确保肾脏的切面紧贴OCT模具底部，以获得方向准确的组织切片。
- 使用冷冻切片机将组织切成5 µm厚度，并贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上。
注意：确保组织切片无皱褶或孔洞，以免影响形态结构。 - 从冷冻切片机中取出切片后，将载玻片置于4% PFA中固定10分钟。在含有100 mL去离子水的容器中洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。2O.
注意：4% PFA：固定剂，需在通风橱中使用 - 用疏水笔在组织切片周围画圈，以减少抗体使用量。切勿让切片干燥。
- 在封闭液（含3% BSA和5%正常血清的1×PBS）中室温孵育1小时。
- 用移液器吸除封闭液，将切片与一抗（Nephrin、podocin 或 PECAM-1）在 1:250 稀释度（溶于含 3% BSA 的 1×PBS）下孵育。将载玻片置于湿盒中，4 °C 过夜孵育。若无湿盒，可在加有抗体的载玻片上轻轻覆盖一小条封口膜。次日取出时应小心操作，避免破坏组织切片。
- 将载玻片在1×PBS中洗涤，每次5分钟，共洗3次。
- 在室温避光条件下，用适当稀释的荧光二抗（1:1000，溶于含3% BSA的1×PBS中）孵育2小时。
- 将载玻片在1×PBS中洗涤，每次5分钟，共洗涤3次。使用含DAPI的荧光封片剂封片。
- 使用荧光显微镜在400倍下观察图像切片 放大以观察肾小球。确保操作者设盲，以避免偏倚。
- 使用 ImageJ 分析染色强度（归一化至肾小球面积）以及染色模式， 即毛细血管袢数量经肾小球面积标准化后的数值，以盲法进行评估。
9. 蛋白质提取与蛋白质印迹
注意：蛋白质印迹法可用于评估已知在肾脏疾病中表达失调的蛋白质。例如，足蛋白（podocin）和肾病蛋白（nephrin）表达水平的降低提示足细胞丢失。
- 从肾皮质和过筛后的肾小球中提取蛋白质；两种组织的提取方案相同，裂解缓冲液体积根据组织量进行调整。
- 将肾脏/肾小球置于冰上解冻，然后加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液（150 mM NaCl，1% NP-40，50 mM Tris pH 8）。样品匀浆30秒。
- 将匀浆样品置于冰上孵育30分钟，期间定期涡旋振荡。
- 在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心 15 分钟。
- 将上清液转移至预冷的新离心管中，置于冰上。
注意：预计每份样品可回收约 1 mg 蛋白质。 - 使用标准的4x Laemmli缓冲液对蛋白质进行变性处理。将混合物在95–100 °C下煮沸5分钟。
- 评估肾小球细胞标志物蛋白（Nephrin、Podocin、PECAM-1）的表达 等等）以及利用蛋白质印迹法（标准方法；Mahmood 和 Yang）检测已知或假定在疾病模型的肾脏/肾小球中发生改变的蛋白质的磷酸化水平和表达情况15).
注意：该实验方案将根据目标蛋白的大小和丰度而有所不同。
10. RNA 提取与聚合酶链式反应（PCR）
注意：mRNA 表达分析可帮助我们确定基因在肾脏疾病中的调控方式，例如基因表达的变化和选择性剪接。
- 肾脏皮质仍处于冷冻状态时，使用研钵和研杵加入 3 mL 苯酚试剂充分研磨。若使用肾小球提取物，则加入 1 mL 苯酚试剂，并将样品匀浆 30 秒。
注意：TRIzol 试剂具有刺激性；请在通风橱中操作 - 采用 Chomczynski 和 Sacchi16 所述方法进行 RNA 提取。
备注：也可选用市售的 RNA 提取试剂盒作为该方法的替代方案。 - 使用现有多种方法之一评估所获得 RNA 的浓度和质量。此时将 RNA 分装并储存在 -80 °C 环境中。避免反复冻融。
备注：若初次使用该方法，建议在进入下一步前通过琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量，以确认存在清晰的 28S 和 18S 核糖体条带。采用此方法预计可回收 2 至 5 µg 的 RNA。 - 取 1 µg RNA 进行 DNase 处理（用无 RNase 水补至 10 µL，加入 1 µL DNase 和 1 µL DNase 缓冲液），37 °C 反应 1 小时。加入 1 µL DNase 终止液，在 65 °C 孵育 10 分钟以终止反应。
- 加入 0.5 µL 的 oligo (dT) 和随机引物。70 °C 孵育 10 分钟。
- 立即置于冰上淬灭反应，持续 5 分钟。
- 加入以下组分：MMLV 逆转录酶（400 U；在 RT - 对照样品中用 DEPC H2O 替代），MMLV 缓冲液（1x），dNTP 混合物（0.5 mM），以及核糖核酸酶抑制剂（40 U）；用 DEPC 水定容至 50 µL。
- 将反应体系在 37 °C 孵育 1 小时，随后在 95 °C 孵育 5 分钟以灭活酶活性。
备注：为获得更高产量的 cDNA，可在 37 °C 孵育长达 3 小时。 - 使用现有多种方法评估 cDNA 的浓度和质量。
- 采用 PCR 检测在肾小球疾病模型中假定发生异常调控的基因的 mRNA 表达水平及剪接模式。具体实验方案将根据目标基因的不同而有所调整。
结果
采用代谢笼收集野生型（WT）、可诱导的足细胞特异性VEGF-A基因敲除（VEGF-A KO）以及VEGF-A KO × Neph-VEGF165b小鼠（在足细胞中持续过表达人源VEGF-A165b亚型的VEGF-A KO小鼠）的尿液。在诱导VEGF-A基因敲除后的第0、4、10和14周检测尿白蛋白/肌酐比值，结果显示，与WT littermate对照组相比，VEGF-A KO小鼠在第10周时已出现进行性白蛋白尿。各组绝对数值见图2A，每只小鼠相对于基线值的归一化数据见图2B。然而，在VEGF-A KO × Neph-VEGF-A165b小鼠中未观察到白蛋白尿（图2），表明VEGF-A165b在此白蛋白尿模型中具有保护作用5。
通过从野生型（WT）、VEGF-A基因敲除（KO）以及VEGF-A与Neph-VEGF-A165b转基因小鼠的肾脏中分离出的单个肾小球，测量了肾小球的LpAVi值。图3A展示了捕获肾小球以及在用8% BSA灌流时观察到的收缩现象的示例。该收缩程度被用于计算每个肾小球的LpA/Vi值（图3B）。在VEGF-KO诱导14周后，VEGF-A KO小鼠的肾小球LpA/Vi值较野生型对照组肾小球显著升高。尽管在VEGF-A与Neph-VEGF-A165b双转基因小鼠中该值有所降低，但在14周时VEGF-A165b的过表达仍未能完全阻止肾小球LpA/Vi值的升高5。
VEGF-A基因敲除诱导14周后对肾皮质切片进行PAS染色，结果显示VEGF-A基因敲除组及VEGF-A X Neph-VEGF-A组均未出现任何肾小球结构异常165b 小鼠（图4A）。然而，通过电镜分析肾小球超微结构发现，VEGF-A基因敲除小鼠的肾小球基底膜增厚、内皮细胞窗孔数量减少、足细胞足突覆盖面积降低，以及足细胞裂孔平均宽度增加（图 4C-4F）。足细胞足突的平均宽度和裂孔数量保持不变（图3B 和 3G）。VEGF-A 的过表达165在VEGF-A基因敲除小鼠中，b可防止肾小球基底膜和裂孔宽度的改变（图 4C 和 4F）。然而，VEGF-A165b 对窗孔数量和 SPS 覆盖率的改变无影响（图 4D 和 4E)5.
对从滤过肾小球中提取的RNA进行RT-PCR分析显示，人源VEGF-A165b mRNA仅存在于VEGF-A基因敲除×Neph-VEGF-A165b转基因小鼠中（图5A）。从滤过肾小球中提取蛋白并经Western blot检测蛋白水平时发现，VEGF-A基因敲除小鼠肾小球中VEGFR-2的蛋白表达降低，而VEGF-A165b的过表达可阻止该下调（图5B和5C）5。
图1. 肾小球通透性（LpA）实验装置示意图。 (A) 肾小球被吸附在(B) 固定于支架上的微移液管上，并通过夹具固定在载物台上以保持稳定。(C) 矩形显微载片。(D) 带有摄像机的显微镜4X物镜。(E) 预热至37 °C的1% BSA溶液。(F) 预热至37 °C的8% BSA溶液。(G) 连接两条灌注液管路的远程三通阀，可实现灌注液的快速更换。(H) 灌注液流向微载片的路径，随后灌注液将包围肾小球。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 尿白蛋白肌酐比值。（A） 在野生型（WT）、VEGF-A基因敲除（KO）以及VEGF-A × Neph-VEGF-A165b小鼠中，诱导VEGF-A基因敲除后第0、4、10和14周的uACR值。（B） 将相同uACR值归一化至每只小鼠的基线值（第0周）。与野生型 littermate 对照组相比，VEGF-A基因敲除小鼠在第10周和第14周时uACR显著升高，而在VEGF-A × Neph-VEGF-A165b小鼠中该升高被抑制（*p <0.05；双因素方差分析，对组间比较进行校正；每时间点n=4–12只小鼠；误差线：均值标准误[SEM]）。本图经Stevens et al5修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3. 肾小球水通透性的测量。（A） 通过负压吸引将肾小球捕获在微移液管上；灌流液从1% BSA（Ai）切换至8% BSA（Aii），并观察肾小球的收缩情况。（B） 利用切换8% BSA前后所采集的数据测定肾小球的LpA/Vi值。（C） 与野生型对照组相比，VEGF-A基因敲除小鼠在诱导VEGF-A基因敲除后14周时表现出显著升高的肾小球LpA/Vi值。而在VEGF-A X Neph-VEGF-A165b小鼠中，该变化未被显著抑制（*p <0.05；单因素方差分析，Bonferroni法进行两两比较校正；n = 4 - 9只小鼠，15 - 30个肾小球；误差棒：标准误）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 肾小球结构分析。（A） 肾皮质PAS染色显示，野生型（WT）、VEGF-A基因敲除（KO）以及VEGF-A X Neph-VEGF-A165b小鼠的肾小球均未见明显结构异常（Ai - iii）。电镜（EM）结果显示，VEGF-A KO小鼠肾小球存在超微结构异常（Aiv - vi）。（B） 各组间足细胞足突宽度（FPW）平均值无显著变化。（C） VEGF-A KO小鼠肾小球基底膜（GBM）增厚，而VEGF-A165b可防止该变化。（D） VEGF-A KO小鼠肾小球窗孔数量减少，VEGF-A165b未能逆转此现象。（E） VEGF-A KO小鼠肾小球足细胞足突覆盖面积（SPS）减少，VEGF-A165b亦未能改善。（F） VEGF-A KO小鼠肾小球裂孔平均宽度增加，而VEGF-A165b可防止该增宽。（G） 三组间裂孔数量无显著差异（*p <0.05；单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正；n = 3只小鼠，共9个肾小球；误差棒：标准误SEM）。本图经Stevens et al5修改。 请点击此处查看本图的放大版本。
图5. 标志物的mRNA和蛋白表达。(A) RT-PCR 结果显示人 VEGF-A165b mRNA 表达仅在 VEGF-A 基因敲除 × Neph-VEGF-A 转基因小鼠的滤过肾小球中明显可见165b 小鼠。 （B） Western blotting 结果显示，VEGF-A 基因敲除肾小球中 VEGFR-2 蛋白表达下调，而在 VEGF-A 基因敲除 × Neph-VEGF-A 转基因小鼠中该下调现象被阻止165b 肾小球（*p <0.05；单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正；n = 3–6只小鼠；误差线：标准误）。该图已根据Stevens修改 等5. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本方案描述了一种针对肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检查方法，可从单只小鼠中获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。每种方法中的关键步骤均可实现对肾小球功能的详细功能、结构和机制分析，包括整体肾脏通透性评估（尿白蛋白/肌酐比值uACR和血浆肌酐测定）、单个肾小球通透性检测（肾小球LpA/Vi）、结构改变检查（PAS染色、三色蓝染色和电镜EM）、蛋白质定位分析（免疫荧光IF）以及肾小球基因表达检测（RT-PCR和Western blotting）。这些方法对于在肾脏疾病小鼠模型中全面评估肾小球功能至关重要。
在评估肾小球滤过屏障（GFB）通透性时，许多研究选择使用传统的尿白蛋白肌酐比（uACR）或24小时白蛋白排泄率作为有效的评估指标17,18。尽管这些方法能够整体评估GFB的通透性，但无法实现对单个肾小球通透性的分别测定，也无法反映不同肾小球之间的差异。先前的研究发现，测定肾小球LpA/Vi是检测GFB通透性变化更为敏感的指标5,9。事实上，本文展示的代表性结果表明，在诱导VEGF-A基因敲除（KO）14周后，VEGF-A KO × Neph-VEGF-A165b小鼠的uACR显著低于VEGF-A KO小鼠；然而，这一结果并未在肾小球LpA/Vi的测定中得到体现，在后者中VEGF-A165b并未显著阻止GFB通透性的升高（图1 和 图2）5。这表明使用多种检测方法同时评估肾脏整体通透性及单个肾小球通透性的重要性。此外，肾小球LpA/Vi肿瘤计量测定法提示，同一肾脏内不同肾小球的通透性可能存在显著差异，尤其是在疾病模型中5,10,19。测量肾小球LpA/Vi的一个局限性在于，该操作仅能在实验终点进行；因此，需要定期检测uACR以判断合适的实验终点。
除了评估功能表型外，本方法还建议对结构和超微结构表型进行评估。这可以通过一系列染色方法实现，例如PAS染色、三色染色和银染色，每种染色用于评估肾小球形态的不同方面。在肾小球疾病的急性模型中（小鼠模型通常属于此类），除非由经过训练的肾脏病理学家进行判读，否则使用这些染色方法往往难以检测到明显的结构异常。因此，建议进行电镜（EM）检查以评估肾小球滤过屏障（GFB）的超微结构，从而实现对基底膜（GBM）、内皮细胞窗孔的大小与数量以及足细胞特征等参数的定量测量。此类测量操作所需培训较少，可帮助研究人员确定疾病模型中受影响的细胞类型或结构。在代表性结果所示的示例中，VEGF-A基因敲除（KO）小鼠表现为轻度肾小球疾病模型，因此PAS染色未发现明显结构异常。然而，在观察肾小球超微结构时发现，足细胞特异性VEGF-A基因敲除确实引起了GBM、足细胞及内皮细胞的改变5。遗憾的是，本方法中所述用于电镜的肾脏制备步骤无法检测内皮细胞糖萼，而糖萼已被证实对GFB通透性具有重要影响19。为了准确测量糖萼厚度，应按照Oltean et al19所述方法，使用含1%阿新蓝的2.5%戊二醛对肾脏进行灌注固定，以标记内皮细胞糖萼。
在评估完功能和结构表型后，可进一步特异性地分析肾小球内不同基因和信号通路的表达/活化模式。先前的超微结构评估可提供有关受累细胞类型或肾小球结构的信息，从而提示应检测足细胞特异性还是内皮细胞特异性的基因或通路。例如，在VEGF-A基因敲除小鼠的代表性结果中，观察到内皮窗孔数量减少（图3D）；因此，进一步检测了肾小球中已知参与VEGF-A通路的内皮标志物蛋白表达情况，即VEGFR-2（图4B）5。除了检测肾小球内蛋白的表达水平外，还可通过免疫荧光（IF）技术观察其定位。在Zhang et al20 的一项研究中，通过免疫荧光共定位显示GLUT1与podocin在足细胞中共表达，从而证实了GLUT1在足细胞中的特异性过表达。
与文献中报道的其他评估肾小球功能的方法相比，本文所述方法用于评估肾小球疾病小鼠模型的肾功能，能够从多个方面全面评价肾小球表型。通过该方法，研究人员可确定模型的肾脏表型，并阐明表型产生的机制。在探索这些模型中潜在治疗途径时，了解疾病的机制至关重要。该方法可便捷地应用于未来对肾小球功能的研究，无论是在疾病表型评估还是潜在治疗手段的探索中均具有广泛适用性。
综上所述，这一通用且可调整的实验方案描述了针对肾小球疾病小鼠模型的完整肾脏检查流程，能够从单只小鼠获取大量关于肾脏及肾小球功能的信息。该方法可实现对肾小球功能的详细功能学、结构学和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由英国心脏基金会、理查德·布莱特VEGF研究信托基金以及英国医学研究理事会（MRC）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 代谢笼 | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
| Tris缓冲盐水（10倍浓缩液） | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 小鼠白蛋白ELISA定量试剂盒 | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
| TMB ELISA底物溶液 | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano 或同等产品 | |
| RNA later稳定溶液 | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
| 4-15%预制蛋白凝胶 | BIORAD | 4568084 | |
| 4x Laemmli上样缓冲液 | BIORAD | 161-0747 | |
| Mini Trans-Blot转印槽 | BIORAD | 1703930 | |
| 10x Tris电泳缓冲液 | BIORAD | 1610732 | |
| 考马斯亮蓝染料 | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| 肌酐检测配套试剂（Creatinine Companion） | Exocell | 1012 Strip Plate | |
| 戊二醛溶液 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| 二甲胂酸钠 | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 10x磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| 磷酸钠 | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| D(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| EDTA血液采集管 | BD | 367835 | |
| 23-25G针头 | BD | PMC0735 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 10 ml玻璃小瓶 | Thomas Scientific | 0914X10 | |
| Falcon 10 ml聚丙烯管 | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
| 0.5 ml离心管 | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
| 一次性组织包埋模具 | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
| 小鼠外科解剖工具包 | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
| 最佳切片温度介质（OCT） | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
| 4%多聚甲醛 | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
| 肾小球通透性测定装置 | 布里斯托大学自制——无商业化产品 | LpA装置引用文献：Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
| 不锈钢筛网 | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
| 过碘酸-雪夫（PAS）染色系统 | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| 二甲苯 | MerckMillipore | 108298 | |
| 防脱载玻片 | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
| 封片剂 | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
| 四氧化锇溶液 | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Aradite树脂 | Agar Scientific | CY212 | |
| 醋酸铀 | Agar Scientific | AGR1260A | |
| 柠檬酸铅 | Agar Scientific | AGR1210 | |
| 冷冻切片机 | ThermoFisher Scientific | 例如 957000H | |
| 疏水笔 | Abcam | ab2601 | |
| Nephrin（1243-1256）抗体 | Acris | BP5030 | |
| 抗Podocin抗体 | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
| 抗CD31抗体 | BD Biosciences | 550274 | |
| Alexa Fluor二抗 | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Labs | H-1200 | |
| NP40细胞裂解缓冲液 | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
| 10x转移缓冲液 | BIORAD | 1610734 | |
| PVDF膜 | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
| HRP标记二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 用于Western blot的ECF底物 | Fisher | 10713387 | |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| DNase I | New England Biolabs | M0303S | |
| M-MLV逆转录酶 | New England Biolabs | M053S | |
| 寡聚dT引物 | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
| 随机引物 | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| DEPC处理水 | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
| 荧光显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Image J图像分析软件 | Image J | ||
| PCR扩增仪 | ThermoFisher Scientific | ||
| 透射电子显微镜（TEM） | Britannica |
参考文献
- Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).
- Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).
- Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).
- Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).
- Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).
- Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).
- Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).
- Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).
- Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).
- Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).
- Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
- Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15 (6), R277(2011).
- Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).
- Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).
- Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).
重印与许可
