量化成年斑马鱼模型中 Vibrio cholerae 的定植与腹泻

摘要

斑马鱼是一种天然的 霍乱弧菌 宿主，并可用于重现和研究从定植到传播的整个感染周期。在此，我们演示如何评估 V. cholerae 定植水平及量化斑马鱼腹泻程度

摘要

Vibrio cholerae 最为人所知的是引起人类霍乱疾病的病原体。在人体宿主之外，V. cholerae 主要存在于水生环境中，并与多种较高等的水生生物相互作用。已知脊椎鱼类是其自然环境中的宿主，可能是自然界中 V. cholerae 的潜在储存库。V. cholerae 和通常被称为斑马鱼的硬骨鱼类 Danio rerio 均起源于印度次大陆，提示二者在水生环境中存在长期的相互作用。斑马鱼是研究生物学多个方面的理想模式生物，包括传染病。斑马鱼在水中暴露后可被 V. cholerae 快速且容易地定植。V. cholerae 在肠道内的定植会导致腹泻的发生以及大量复制后的 V. cholerae 随粪便排出。这些排出的细菌可进一步感染新的鱼类宿主。本文将演示如何评估 V. cholerae 在斑马鱼肠道中的定植情况，以及如何量化 V. cholerae 引起的斑马鱼腹泻。该定植模型对于研究特定基因是否在宿主定植和/或环境存活中发挥重要作用的研究人员具有重要价值。而斑马鱼腹泻的量化方法则对任何致力于探索斑马鱼作为模式系统研究肠道病原体的研究人员均具有应用意义。

引言

Vibrio cholerae 是一种存在于水环境中的革兰氏阴性细菌，可引起人类霍乱以及零星发生的腹泻^1,2。V. cholerae 广泛分布于全球多个地区的自然环境中，常与其他水生生物共存。这些共存的生物包括浮游生物、昆虫卵块、贝类以及脊椎鱼类^3,4,5,6,7。已有多个研究从不同地理区域的鱼类肠道中分离出 V. cholerae^7,8,9,10。鱼类体内存在 V. cholerae 表明，鱼类可能作为该菌的环境储存宿主。此外，鱼类还可能参与将疾病传播给人类，并促进 V. cholerae 菌株的地理扩散⁶

方案

本文所述所有方法均已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。该方法最初由 Runft et al.¹² 描述。

1. 肠道定植水平的测定

注意：在斑马鱼模型中，肠道定植是最有用的指标，可用于比较不同霍乱弧菌（V. cholerae）菌株的相对适应性，或评估突变或基因敲除的影响。

1. 斑马鱼浸浴接种
   注意：这种暴露方式类似于自然感染过程。
   1. 制备 V. cholerae
      1. 接种单个菌落至5 mL的溶菌肉汤（LB）中 V. cholerae 从LB平板上挑取单菌落，置于37 °C、180 rpm振荡条件下培养6–8小时（过夜培养）。
      2. 在250 mL锥形瓶中加入25 mL新鲜的高压灭菌LB培养基，并接种50 µL上述过夜培养物。在37 °C、150 rpm振荡条件下培养16–18 h。
      3. 在600 nm处测定光密度（OD）₆₀₀) 将过夜培养物按1/10稀释后取样，以估算每毫升中的细菌数量（OD₆₀₀ = 1 约为 10⁹ CFU/mL
      4. 以....

结果

V. cholerae 对斑马鱼肠道的定植

为了提供我们通常观察到的定植水平示例，我们在一个含有若干条斑马鱼的烧杯中，向200 mL水中接种了5 × 10⁶ CFU的流行性埃尔托型V. cholerae菌株N16961。感染6小时后，将鱼用新鲜水清洗，并按实验方案所述转移至含有200 mL灭菌感染用水的烧杯中。转移后18小时（即初次感染后24小时），处死斑马鱼并取出其肠道，以测定定植水平。通常在感染后24小时（hpi）可观察到每条鱼肠道中约有10⁵至10⁶个V. cholerae细胞（图1），接种量为5 × 10⁶。

鱼类腹泻的定量分析

.......

讨论

斑马鱼是研究V. cholerae的较新模型，在未来发现V. cholerae生物学和致病机制中先前未知的方面具有广阔前景^11,12,13。成年斑马鱼模型的优势在于它既是具有完整成熟肠道微生物群的天然V. cholerae宿主，又可作为环境模型。该模型的缺点是两种主要的人类毒力因子——霍乱毒素和毒素共调菌毛——在斑马鱼定植或致病过程中并非必需¹²。然而，这也可以被视为另一项优势，有助于鉴定新的V. cholerae定植因子，并促进对其他V. cholerae毒素的研究。这一点对于绝大多数非O1/O139型"环境" V. cholerae菌株尤为重要，这些菌株大多不产生霍乱毒素或毒素共调菌毛，但仍可引发疾病^20,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
摇床培养箱	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
培养箱	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
分光光度计	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
涡旋振荡器	Minibeadbeater24	112011
电子天平	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
加热搅拌器	Corning, Corning, NY	PC-420D
本生灯
自动菌落计数器	REVSCI	120417B
材料
400 ml 玻璃烧杯	Pyrex
带孔盖子	移液枪头盒中的带孔枪头架
一次性塑料勺	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
鱼缸系统	Aquaneering, San Diego, CA
反渗透水净化器	Aqua FX	TK001
鱼网	Marina
鱼饲料	Tetra fin
卤虫	Red jungle 品牌	O.S.I. pro 80
泡沫板
大头针
手术刀	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
镊子	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas 剪刀	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml 螺旋盖管	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm 玻璃珠	Bio Spec	11079110
涂布用玻璃珠	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
培养皿	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml 离心管	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml 离心管	Corning Falcon, Corning, NY	352098
试管	Pyrex	9820
玻璃移液管	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
微量移液器	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
吸头	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
化学试剂
Instant Ocean 盐
磷酸盐缓冲液（PBS）	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s 试剂	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
高碘酸	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
猪胃黏蛋白	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
牛血清白蛋白	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm 蛋白检测试剂	Thermo, Waltham, MA	22660
LB 培养基
胰蛋白胨	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
酵母提取物	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
琼脂	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS 琼脂	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS 琼脂	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
软件
Microsoft Office
Prism 5