斑马鱼是一种天然的 霍乱弧菌 宿主，并可用于重现和研究从定植到传播的整个感染周期。在此，我们演示如何评估 V. cholerae 定植水平及量化斑马鱼腹泻程度
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摘要
摘要
Vibrio cholerae 最为人所知的是引起人类霍乱疾病的病原体。在人体宿主之外，V. cholerae 主要存在于水生环境中，并与多种较高等的水生生物相互作用。已知脊椎鱼类是其自然环境中的宿主，可能是自然界中 V. cholerae 的潜在储存库。V. cholerae 和通常被称为斑马鱼的硬骨鱼类 Danio rerio 均起源于印度次大陆，提示二者在水生环境中存在长期的相互作用。斑马鱼是研究生物学多个方面的理想模式生物，包括传染病。斑马鱼在水中暴露后可被 V. cholerae 快速且容易地定植。V. cholerae 在肠道内的定植会导致腹泻的发生以及大量复制后的 V. cholerae 随粪便排出。这些排出的细菌可进一步感染新的鱼类宿主。本文将演示如何评估 V. cholerae 在斑马鱼肠道中的定植情况，以及如何量化 V. cholerae 引起的斑马鱼腹泻。该定植模型对于研究特定基因是否在宿主定植和/或环境存活中发挥重要作用的研究人员具有重要价值。而斑马鱼腹泻的量化方法则对任何致力于探索斑马鱼作为模式系统研究肠道病原体的研究人员均具有应用意义。
引言
Vibrio cholerae 是一种存在于水环境中的革兰氏阴性细菌，可引起人类霍乱以及零星发生的腹泻1,2。V. cholerae 广泛分布于全球多个地区的自然环境中，常与其他水生生物共存。这些共存的生物包括浮游生物、昆虫卵块、贝类以及脊椎鱼类3,4,5,6,7。已有多个研究从不同地理区域的鱼类肠道中分离出 V. cholerae7,8,9,10。鱼类体内存在 V. cholerae 表明，鱼类可能作为该菌的环境储存宿主。此外，鱼类还可能参与将疾病传播给人类，并促进 V. cholerae 菌株的地理扩散6。
为了更好地理解V. cholerae与鱼类的相互作用，研究人员建立了Danio rerio（即斑马鱼）作为研究V. cholerae的模型系统11。斑马鱼原产于南亚，包括孟加拉湾地区，而该区域被认为是V. cholerae最早的储存库。在1817年首次霍乱大流行爆发之前，霍乱仅在现今的印度和孟加拉国地区被报道过。因此，在进化时间尺度上，斑马鱼与V. cholerae几乎可以确定存在长期的相互关联，表明斑马鱼是自然环境中V. cholerae的宿主之一12。
斑马鱼模型 V. cholerae 操作简单，可用于研究整个致病过程 V. cholerae 生命周期。鱼类暴露于 V. cholerae 通过浸泡在已接种已知数量的水中 V. cholerae数小时内即发生肠道定植，随后出现腹泻。腹泻物包含黏液、蛋白质、排出的细菌及其他肠内容物。腹泻程度可通过几项简单测量进行量化13. V. cholerae 被感染鱼类排出的病原体可继续感染易感鱼类，从而完成感染循环。因此，斑马鱼模型重现了 V. cholerae 人类疾病过程12,14.
最常使用的 V. cholerae 动物模型历史上主要是小鼠和兔子14,15,16,17,18这些模型在增进我们对相关领域的认知方面发挥了重要作用 V. cholerae 发病机制。然而，由于小鼠和兔子并非自然 V. cholerae 宿主，对于可以研究的方面存在一定的局限性 V. cholerae 生命周期可以被研究。 V. cholerae 小鼠和兔的定植通常需要肠道微生物群缺失，或经抗生素预处理以破坏肠道微生物群。这两种模型均需通过灌胃将细菌引入消化道，或通过外科手术操作将细菌直接注射入肠道。斑马鱼的优势在于，具有完整肠道微生物群的成年鱼也能被轻易定植，且感染过程可自然发生，无需任何人为干预。
本研究展示了利用斑马鱼作为模型生物的应用 V. cholerae 感染。感染、解剖及定植菌的计数 V. cholerae，以及由腹泻引起的量化指标 V. cholerae 将被描述12,13该模型可能对研究以下领域的科学家具有重要价值 V. cholerae 疾病过程及在 V. cholerae 环境生活方式
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方案
本文所述所有方法均已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。该方法最初由 Runft et al.12 描述。
1. 肠道定植水平的测定
注意：在斑马鱼模型中，肠道定植是最有用的指标，可用于比较不同霍乱弧菌（V. cholerae）菌株的相对适应性，或评估突变或基因敲除的影响。
- 斑马鱼浸浴接种
注意：这种暴露方式类似于自然感染过程。- 制备 V. cholerae
- 接种单个菌落至5 mL的溶菌肉汤（LB）中 V. cholerae 从LB平板上挑取单菌落，置于37 °C、180 rpm振荡条件下培养6–8小时（过夜培养）。
- 在250 mL锥形瓶中加入25 mL新鲜的高压灭菌LB培养基，并接种50 µL上述过夜培养物。在37 °C、150 rpm振荡条件下培养16–18 h。
- 在600 nm处测定光密度（OD）600) 将过夜培养物按1/10稀释后取样，以估算每毫升中的细菌数量（OD600 = 1 约为 109 CFU/mL
- 以6,000 g离心10分钟收集细胞。用移液器吸除上清液或将其倾倒至消毒液中。用无菌PBS将细胞重悬至所需浓度，通常为1 × 10⁶至1 × 10⁸个细胞/mL。7 至 1 × 1010 每毫升 PBS。
注意：此处将含有60 mg/L海盐的经高压灭菌反渗透水称为无菌感染用水。
- 接种与培养
- 将四到五条斑马鱼放入盛有200 mL无菌感染水的400 mL烧杯中。
- 加入1 mL的 V. cholerae （从步骤 1.1.1.4 起）以获得所需感染浓度（通常为 5 x 104 至 5 × 107 CFU/mL）于200 mL感染水中。
- 用带孔的盖子盖住烧杯，以防止鱼跳出；200 µL吸头盒的盖子顶部可用于此目的。
- 将每个烧杯标记，并在实验期间将其放入设定为 28 °C 的玻璃门培养箱中。
- 短暂暴露操作步骤
注意：短暂暴露于 V. cholerae （通常为6小时）后移除接种细菌，有助于研究细菌传播，并能更准确地定量排出的细菌。- 暴露6小时后，通过渔网将烧杯中的水倒出以收集鱼类。将感染性液体倒入含漂白剂的容器中以灭活。 V. cholerae.
- 将取出的鱼放入盛有200 mL无菌感染水的烧杯中，让鱼在洁净水中游动5分钟，以去除鱼体表面的细菌。
- 重复网具操作（步骤1.2.2），并将鱼转移至含有200 mL无菌感染用水的新烧杯中。在整个实验过程中，将鱼保留在该烧游戏副本。
- 制备 V. cholerae
- 安乐死
- 当实验达到预期终点时，可采集感染液样本（通常15 mL足够），用于测定排出的细菌数量以及腹泻相关指标（如黏蛋白检测、蛋白质含量和/或光密度），如有需要（见第2节）。
- 通过鱼网将剩余的水倒入漂白剂中（以收集鱼类），从而杀死鱼类 V. cholerae 在水中
- 将鱼放入含有感染水和336 µg/mL 乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（tricaine）的烧杯中，在室温下于该tricaine溶液中孵育20分钟。
注意：鱼网使用10%的次氯酸钠溶液进行了灭菌。
- 解剖
- 鱼类的制备
- 用一次性塑料勺从三卡因溶液中捞出一条鱼，置于解剖面上。
- 将鱼腹侧朝上放置，用大头针从下颌处固定，大头针的钝端倾斜远离身体中线。在肛门后方稍远处再插入一根大头针，同样使其倾斜远离身体。
- 暴露肠道
- 用浸有70%乙醇的无绒擦拭巾擦拭鱼的腹侧表面。
- 将手术刀和Vannas剪刀浸入70%乙醇中消毒，然后用火焰灼烧灭菌。
- 在腹部皮肤下方沿纵轴方向用手术刀穿透鳞片做一小切口。注意不要切得过深，因为肠管位于皮肤正下方。
- 使用剪刀沿身体纵轴小心延长切口，切割深度不超过皮肤层，并避开肛门。
- 用剪刀向鱼头方向做两个侧向切口，以扩大切口开口。
- 将侧切口两侧的皮肤固定在解剖台面上，针脚向外倾斜，远离身体方向。
注意：针尖此前已用酒精火焰灭菌。
- 肠道切除
注意：肠道应可见为位于其他器官上方的一条浅色、极薄的管状结构。- 用火焰灭菌镊子，然后用其取出整个肠道（通常长度为12–15 mm）。将肠道置于含有玻璃珠（见步骤1.4.1–1.4.2）和1 mL 1×PBS或LB的匀浆管中，冰上放置。
- 鱼类的制备
- 匀浆化
- 提前准备匀浆管，将约1.5 g的1 mm玻璃珠加入2 mL螺口管中（填充至约一半），然后通过高压灭菌进行消毒。
- 加入1 mL无菌LB或1×PBS。
- 将斑马鱼肠道加入离心管（步骤 1.3.3.1）后，务必拧紧管盖，然后将离心管固定在涡旋振荡器中。
- 将样品在最高档位匀浆1分钟，然后在冰上冷却1–2分钟。重复此匀浆步骤一次，以实现完全匀浆。
注意：多种替代的匀浆方法也可行。
- 量化肠道定植水平
- 为进行肠道匀浆液的梯度稀释，准备若干小玻璃试管或1.5 mL离心管，每管加入900 µL LB培养基或1×PBS缓冲液。每条鱼准备5–6个试管，取100 µL匀浆液加入第一管，充分涡旋混匀，然后从第一管中取100 µL转移至第二管，依次进行10倍系列稀释。
- 重复此步骤，直至完成所有稀释液的配制。
- 将每种稀释液取 100–200 µL 涂布于含有 100 µg/mL 链霉素（若使用链霉素抗性菌株）和 40 µg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）的 LB 琼脂平板上。于 30 °C 培养 16–18 小时。
- 过夜孵育后，计数 V. cholerae 使用自动菌落计数器或手动计数平板上的菌落；用记号笔标记已计数的菌落有助于避免重复或遗漏。
- 通过将平板计数乘以悬液的稀释倍数，并考虑涂布的体积，计算每条鱼肠道的菌落形成单位（CFU）。
2. 鱼类腹泻的测量
注意：采用四种不同指标评估鱼类腹泻：水中黏蛋白水平、水中总体排泄蛋白水平、水的OD600值，以及水中V. cholerae的菌落形成单位（CFU）13。如上所述，在斑马鱼接触V. cholerae约6小时后，腹泻通常在视觉上即可明显观察到。
- 测定黏蛋白水平
注意：黏蛋白分泌在以下过程中被诱导 V. cholerae 定植情况是评估排泄水平的良好指标，尤其在感染早期13黏蛋白检测是微量滴定板高碘酸-希夫试剂检测的一种改良方法19.- 准备以下材料：50%（w/v）过碘酸储备液、0.1%过碘酸工作液（将10 µL 50%过碘酸储备液加入5 mL 7%乙酸中——配制后立即使用）、黏蛋白标准品、96孔微孔板、希夫试剂。
- 使用醋酸钠缓冲液（100 mM 醋酸钠，5 mM EDTA，用冰醋酸调节 pH 至 5.5）悬浮以下浓度的黏蛋白（来自猪胃 III 型）制备黏蛋白标准品：400 µg/mL、300 µg/mL、200 µg/mL、150 µg/mL、100 µg/mL、75 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL 和 10 µg/mL。
按照以下方法准备酶标板：在将用于检测的每个孔中加入 100 µL 感染水，包括空白孔（1× PBS）、上述黏蛋白标准品或鱼类感染水样。每个样品设三个复孔。
- 使用醋酸钠缓冲液（100 mM 醋酸钠，5 mM EDTA，用冰醋酸调节 pH 至 5.5）悬浮以下浓度的黏蛋白（来自猪胃 III 型）制备黏蛋白标准品：400 µg/mL、300 µg/mL、200 µg/mL、150 µg/mL、100 µg/mL、75 µg/mL、50 µg/mL、25 µg/mL 和 10 µg/mL。
- 使用多通道移液器向每个孔中加入50 µL新鲜的0.1%过碘酸溶液，并通过反复吹打数次混匀。
- 用塑料膜将培养板严密包裹，于37 °C孵育1–1.5小时。
- 将培养板冷却至室温，持续 5–10 分钟。向每孔中加入 100 µL 品红溶液（希夫试剂），用移液器吹打混匀。
- 用塑料膜包裹酶标板，置于摇床上室温孵育至显色；通常在20分钟内完成显色。使用酶标仪在560 nm波长下读取吸光度。
- 绘制黏蛋白标准曲线（OD560 与 µg/mL 黏蛋白标准品）。通过确定未知样品的吸光度（OD）值在标准曲线上的对应位置来测定其黏蛋白水平560 根据每个未知样品在标准曲线上的位置，读取对应黏蛋白浓度值。
- 准备以下材料：50%（w/v）过碘酸储备液、0.1%过碘酸工作液（将10 µL 50%过碘酸储备液加入5 mL 7%乙酸中——配制后立即使用）、黏蛋白标准品、96孔微孔板、希夫试剂。
- 测定蛋白质水平
注意：除了黏蛋白外，水中总蛋白水平也是反映鱼类腹泻（浑浊的液态粪便）程度的另一个指标。本实验采用标准的布拉德福德法（Bradford assay）来估测蛋白水平，蛋白浓度的估算基于牛血清白蛋白（BSA）标准曲线。- 将100 µL的一种BSA标准品（见下文注释）或100 µL感染水（含感染鱼的烧杯中的水）与900 µL Bradford检测试剂（Pierce蛋白检测试剂适用于此）在一次性比色皿中混合。将所有样品在室温下孵育2分钟。
注意：所使用的 BSA 标准品浓度分别为：1,800 µg/mL、1,000 µg/mL、750 µg/mL、500 µg/mL、250 µg/mL、125 µg/mL、50 µg/mL 和 25 µg/mL。BSA 标准品用经高压灭菌的蒸馏水稀释。 - 读取 OD660 使用分光光度计测定每个标准品或样品的吸光度。
- 绘制 BSA 标准曲线（OD660 与 µg/mL）。通过确定未知样品的吸光度（OD）值在标准曲线上的对应位置，测定其蛋白浓度。660 将每个未知样品的值落在BSA标准曲线上，并读取该值对应的黏蛋白浓度。
- 将100 µL的一种BSA标准品（见下文注释）或100 µL感染水（含感染鱼的烧杯中的水）与900 µL Bradford检测试剂（Pierce蛋白检测试剂适用于此）在一次性比色皿中混合。将所有样品在室温下孵育2分钟。
- 测量 OD600
注意：数小时后即可观察到腹泻（浑浊的液态粪便）的存在，且通过简单的OD检测即可识别。600 可利用该测定方法进行定量分析。- 将含有感染水的试管倒置数次，使内容物均匀分布。取1 mL水样加入一次性比色皿中。以1 mL无菌感染水作为阴性对照。
- 使用阴性对照样品，在分光光度计上以600 nm波长进行“空白”测定。在600 nm处测定每个水样，并记录结果。
- 排泄物的测定 V. cholerae 感染后的CFU/mL
注意：斑马鱼产生的腹泻物质中有一个主要成分被排泄出体外 V. cholerae. CFU/mL 的测定可用于评估细菌在鱼类肠道中的复制情况，以及作为传播实验中感染剂量的衡量指标。该检测方法最适合用于短暂感染发生后的情况。若采用24小时感染，则该检测将测量接种物与排出菌的总和 V. cholerae.- 在预定时间点采集水样，并按前述方法进行连续稀释。
- 将系列稀释液接种于选择性培养基（含链霉素或其他适当抗生素或DCLS的LB琼脂）上，于30 °C培养24小时。
- 计数菌落。按照步骤1.5所述计算每毫升水中的菌落形成单位（CFU）。
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结果
V. cholerae 对斑马鱼肠道的定植
为了提供我们通常观察到的定植水平示例，我们在一个含有若干条斑马鱼的烧杯中，向200 mL水中接种了5 × 106 CFU的流行性埃尔托型V. cholerae菌株N16961。感染6小时后，将鱼用新鲜水清洗，并按实验方案所述转移至含有200 mL灭菌感染用水的烧杯中。转移后18小时（即初次感染后24小时），处死斑马鱼并取出其肠道，以测定定植水平。通常在感染后24小时（hpi）可观察到每条鱼肠道中约有105至106个V. cholerae细胞（图1），接种量为5 × 106。
鱼类腹泻的定量分析
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讨论
斑马鱼是研究V. cholerae的较新模型，在未来发现V. cholerae生物学和致病机制中先前未知的方面具有广阔前景11,12,13。成年斑马鱼模型的优势在于它既是具有完整成熟肠道微生物群的天然V. cholerae宿主，又可作为环境模型。该模型的缺点是两种主要的人类毒力因子——霍乱毒素和毒素共调菌毛——在斑马鱼定植或致病过程中并非必需12。然而，这也可以被视为另一项优势，有助于鉴定新的V. cholerae定植因子，并促进对其他V. cholerae毒素的研究。这一点对于绝大多数非O1/O139型"环境" V. cholerae菌株尤为重要，这些菌株大多不产生霍乱毒素或毒素共调菌毛，但仍可引发疾病20,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Melody Neely、Jon Allen、Basel Abuaita和Donna Runft在建立斑马鱼模型过程中所付出的努力。本研究工作得到了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所的资助，资助编号为R21AI095520和R01AI127390（授予Jeffrey H. Withey）。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| 培养箱 | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| 分光光度计 | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| 涡旋振荡器 | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| 电子天平 | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| 加热搅拌器 | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| 本生灯 | |||
| 自动菌落计数器 | REVSCI | 120417B | |
| 材料 | |||
| 400 ml 玻璃烧杯 | Pyrex | ||
| 带孔盖子 | 移液枪头盒中的带孔枪头架 | ||
| 一次性塑料勺 | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| 鱼缸系统 | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| 反渗透水净化器 | Aqua FX | TK001 | |
| 鱼网 | Marina | ||
| 鱼饲料 | Tetra fin | ||
| 卤虫 | Red jungle 品牌 | O.S.I. pro 80 | |
| 泡沫板 | |||
| 大头针 | |||
| 手术刀 | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| 镊子 | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas 剪刀 | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml 螺旋盖管 | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm 玻璃珠 | Bio Spec | 11079110 | |
| 涂布用玻璃珠 | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| 培养皿 | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml 离心管 | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml 离心管 | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| 试管 | Pyrex | 9820 | |
| 玻璃移液管 | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| 微量移液器 | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| 吸头 | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| 化学试剂 | |||
| Instant Ocean 盐 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| 三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐） | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷 | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s 试剂 | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| 高碘酸 | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| 猪胃黏蛋白 | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm 蛋白检测试剂 | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB 培养基 | |||
| 胰蛋白胨 | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| 酵母提取物 | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| 琼脂 | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS 琼脂 | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS 琼脂 | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| 软件 | |||
| Microsoft Office | |||
| Prism 5 |
参考文献
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