单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

摘要

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。

摘要

单分子荧光 原位 杂交（smFISH）是一种研究单细胞基因表达的强有力技术，因其能够检测并计数单个RNA分子。与基于深度测序的方法互补，smFISH可提供有关转录本丰度的细胞间变异以及特定RNA亚细胞定位的信息。近期，我们已利用smFISH研究了基因的表达 NDC80 在酿酒酵母减数分裂过程中，存在两种转录本异构体，其中短转录本异构体的全部序列包含于长转录本异构体之中。为可靠地区分每种转录本异构体，我们优化了已知的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验方案，并获得了在酿酒酵母减数分裂样品中高度一致且高质量的smFISH数据。本文描述了该优化后的实验流程、用于判断smFISH数据是否达到高质量的标准，以及实施该方案时的一些实用建议 其他酵母菌株及培养条件

引言

基因表达的动态调控驱动生物体的发育过程，以及其对环境胁迫、感染和代谢变化的响应。专注于转录调控的研究依赖于测量RNA丰度的技术。其中一种方法称为单分子荧光原位杂交（single molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH），可用于在单个细胞中检测单个RNA分子^1,2。该方法能够 测量基因表达在细胞间的变异性，并确定RNA在细胞内的定位。

在最常用的单分子荧光原位杂交（smFISH）技术中，检测单个RNA分子需要多个短DNA探针（通常约为48个20碱基长的探针），这些探针与目标RNA序列互补 ，并共价连接相同的荧光染料。单个荧光探针结合产生的信号较弱，但所有探针信号的集合则非常强。这一特性显著提高了信噪比，因为尽管单个探针可能发生非特异性结合，但其信号强度远低于目标RNA分子的信号³。在检测误差允许范围内，可以对不同生长条件或不同突变体之间的RNA分子数量进行计数和比较。

自首次开发以来，smFISH 已被应用于研究基因表达的多个方面⁴，例如转录延伸^1,2，剪接^5,6转录爆发^7,8,9细胞内等位基因表达^10,11,12，以及RNA定位^13,14,15最近，我们已采用该方法研究同一基因的两种转录本异构体的表达，其中短转录本异构体（NDC80^{开放阅读框}）与其长亚型（NDC80^luti)¹⁶为了特异性识别两种mRNA异构体，我们使用了两组探针：其中一组探针对应于独特序列 NDC80^luti，另一组探针则与两种同工型的共有区域结合，并标记另一种荧光染料。 NDC80^luti RNA 被识别为具有两种荧光信号的共定位斑点，而 NDC80^{开放阅读框} RNA 是仅包含共有探针集信号的那一个。由于共有探针集的数量 NDC80^{开放阅读框} 转录本的表达量由以下方法计算： "减法" 为了可靠地识别smFISH信号点并减少误差传播，需要具有高探针杂交效率和高信噪比的方法。

本文介绍了一种在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中进行单分子荧光原位杂交（smFISH）的优化实验方案。该方案针对处于营养生长或减数分裂状态的S. cerevisiae SK1菌株背景，对细胞数量、固定时间、消化时间、消化缓冲液、探针浓度以及杂交缓冲液等smFISH实验条件进行了优化。此外，本文还说明了：（1）图像采集后评估smFISH数据质量的方法；（2）本实验方案中可能需要根据不同菌株背景和生长条件进一步优化的步骤。

方案

注意：本方案中使用的所有缓冲液和培养基均列于表1中。试剂的供应商信息见材料表。

第1天/第1-2天：

注意：对于营养生长期培养，将细胞培养至 OD₆₀₀ 0.4 到 0.6 之间的优选培养基中。对于减数分裂培养，使用优选方法诱导细胞进入减数分裂（通常是在 OD₆₀₀ 1.85。

1. 样品固定与消化

1. 用 3% 多聚甲醛固定总共约 3.5 OD₆₀₀ 的细胞。
   1. 对于营养期培养物，将 5.52 mL 培养物加入含 480 µL 37% 多聚甲醛的 15 mL 圆锥管中。
   2. 对于减数分裂期培养物，将 1840 µL 培养物加入含 160 µL 37% 多聚甲醛的 2 mL 微量离心管中，轻轻倒置约 5 次以混匀。
      警告：多聚甲醛具有毒性，操作和废弃时应遵循所在机构的相关规定。
2. 将管子置于室温下的滚轴混合仪上孵育 20 分钟。对于减数分裂期样品，在室温固定 20 分钟后，继续在 4 ˚C 下旋转过夜固定。
   注意：过夜固定可提高减数分裂期样品 smFISH 数据的可重复性和质量。 固定时间应进行优化。
3. 在样品固定期间，将 200 mM 钒核糖核苷复合物（VRC）在 65 ˚C 下解冻至少 10 分钟。
4. 在 15 mL 管中配制消化主混合液：对于 1 个样品，将 425 µL Buffer B 与 40 µL 已预热至 65 ˚C 的 200 mM VRC 混合； 对于 5 个样品，将 2125 µL Buffer B 与 200 µL 已预热至 65 ˚C 的 200 mM VRC 混合。加入主混合液前，涡旋约 5 秒以充分重悬 VRC，加入 VRC 后混合液呈浅棕绿色。
   注意：在消化过程中加入 VRC 可提高 smFISH 结果的一致性，可能通过抑制由酵解酶混合物引入的核酸酶污染（该酶由粗提物纯化而来）。此步骤所需的 VRC 用量应进行优化。
5. 对于营养期样品，在约 1057 × g 下离心 3 分钟。对于减数分裂期样品（过夜固定后），在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。弃去上清液至多聚甲醛废液容器中。
   注意：所有离心步骤均在室温下进行。
6. 通过吹打或倒置并轻弹管壁，用 1.5 mL 冷 Buffer B 重悬细胞。重悬后将营养期样品转移至 2 mL 管中。
7. 在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。通过真空抽吸或移液去除大部分液体，残留约 100 µL。
8. 用 1.5 mL 冷 Buffer B 重悬细胞。
9. 在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。通过真空抽吸或移液去除大部分液体，残留约 100 µL。
10. 用 1.5 mL 冷 Buffer B 重悬细胞，在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。通过真空或移液完全吸除液体。
11. 用 425 µL 消化主混合液重悬细胞，并短暂涡旋以混匀。向每管中加入 5 µL 10 mg/mL 的 100T 酵解酶。
    注意：每次加入前均需涡旋酵解酶。应逐管单独加入酵解酶，而非加入主混合液中。由于酵解酶易快速沉淀，这两个步骤有助于维持各管间消化的一致性。
12. 涡旋 2–3 秒以混匀。将管子置于滚轴混合仪上，在 30 ˚C 下消化 15–30 分钟。营养期细胞和减数分裂早期通常需约 15 分钟，减数分裂前期和减数分裂过程通常需约 30 分钟。
    注意：消化 15 分钟后，每隔 5 分钟在显微镜下检查一次，当约 80% 的细胞呈现不透明且无折光性时停止消化。自此步骤起，细胞极为脆弱，操作应轻柔，避免使用真空抽吸或涡旋。
13. 在约 376 × g 下离心 3 分钟。通过移液完全去除液体。
14. 用 1 mL Buffer B 轻柔吹打 1–2 次以重悬细胞。
15. 在约 376 × g 下离心 3 分钟。通过移液去除 Buffer B。用 1 mL 70% 乙醇（用无 RNase 水稀释）轻柔重悬细胞。
16. 在室温下孵育 3.5–4 小时。

2. 杂交

1. 将甲酰胺置于室温下（50 mL 分装样品在水浴中约需 30 分钟）。
   注意：在甲酰胺瓶达到室温前请勿打开，以避免甲酰胺氧化。
   警告：甲酰胺具有毒性。请根据机构规定进行操作和处置。
2. 在 15 mL 圆锥管中配制 10% 甲酰胺洗涤缓冲液。
3. 以约 376 × g 离心 3 分钟。用移液器移除 500 µL 70% 乙醇。轻轻吹打重悬剩余细胞，然后将细胞转移至低吸附性离心管中。
   注意：使用低吸附性离心管可显著减少后续洗涤过程中的细胞损失。
4. 再次以约 376 × g 离心 3 分钟。用移液器吸除全部乙醇。
5. 加入 1 mL 10% 甲酰胺洗涤缓冲液，轻轻吹打 2–3 次以重悬细胞。
6. 在配制杂交溶液的同时，将细胞于室温下静置约 20 分钟。对于 1 个样品，混合 50 µL 杂交缓冲液（室温）、5 µL 200 mM VRC（预热至 65 ˚C）以及每种探针各 1 µL（终浓度为 200 nM）。对于 5 个样品，混合 250 µL 杂交缓冲液（室温）、25 µL 200 mM VRC（预热至 65 ˚C）以及每种探针各 5 µL（终浓度为 200 nM）。
   1. 在打开管子前，先将杂交缓冲液（-20 ˚C 冻存）解冻至室温，以防止甲酰胺氧化。
   2. 加入 200 mM VRC 后，涡旋振荡 5–10 秒，再加入探针。探针为商业设计和购买，按制造商说明进行复溶。
   3. 若同时孵育两种探针，则分别加入 1 µL 探针 #1 原液的 1:10 稀释液和 1 µL 探针 #2 原液的 1:10 稀释液，使每种 探针的终稀释度约为 1:500。最佳信噪比所需的探针浓度需进行优化（详见讨论部分）。
7. 以约 376 × g 离心样品 3 分钟。用移液器将上清液移至有害废物容器中。
8. 向每根管中加入至少 50 µL 杂交溶液。轻弹管壁以混匀。
9. 在黑暗条件下，于 30 ˚C 滚动摇床中孵育至少 16 小时。

第2天/第3天

3. 清洗与成像

1. 将甲酰胺置于室温下。
2. 在15 mL锥形管中配制10%甲酰胺洗涤缓冲液（FWB）。
3. 从滚轴摇床上取下试管，放入用铝箔包裹的盒子中以避光。 
4. 将样品在约 376 x g 条件下离心 3 分钟。 用移液器将上清液移至有害废物容器中。
5. 用移液器轻柔地吹打2-3次，将沉淀重悬于1 mL 10% FWB中。
6. 30 ˚C 下孵育 30 分钟（不旋转） 覆箔盒
7. 以约 376 × g 离心样品 3 分钟。用移液器将上清液移除至有害废物容器中，保留约 50 µL。
8. 同时，在15 mL锥形管中配制DAPI/FWB：对于 1个样品，将1000 µL 10%甲酰胺洗涤缓冲液与1 µL 5 mg/mL DAPI混合；10个样品，则将10 mL 10%甲酰胺洗涤缓冲液与10 µL 5 mg/mL DAPI混合。用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于1 mL DAPI/FWB中 2-3 次
9. 30 ˚C 下孵育 30 分钟（不旋转） 覆箔盒
10. 将抗淬灭试剂在冰上解冻。
11. 将样品在约 376 x g 条件下离心 3 分钟。用移液器彻底移除上清液。如有需要，可再次离心以去除残留的上清液。
12. 对于不立即成像的样品，将沉淀重悬于50 µL GLOX缓冲液中 无 酶。上下吹打3-4次以混匀。
    1. 将所有未成像的样品置于锡箔包裹的盒子中，于 4 ˚C 保存，直至准备成像。准备成像时，将样品在约 376 x g 离心 2 分钟，然后用移液器完全去除上清液。按如下方法用含酶的 GLOX 缓冲液重悬样品。
13. 对于需立即成像的样品，加入15–20 µL含酶的GLOX缓冲液。 轻轻吹打混匀。
    注意：所加入的体积可以 变化 根据细胞沉淀的大小而定。建议将沉淀重悬于15 µL含酶的GLOX缓冲液中，并在显微镜下检查细胞密度。若细胞过于密集（细胞成团堆积），可添加额外的含酶GLOX缓冲液；若细胞过于稀疏，可离心样品并去除约5 µL缓冲液。
14. 将5 µL样品移液至盖玻片（18 mm × 18 mm，1号）上，然后将盖玻片置于载玻片上。
15. 在盖玻片放置位置的载玻片上方覆盖一张实验室擦拭纸。轻轻按压擦拭纸，使载玻片固定（应观察到液体从盖玻片的四个边缘渗出）。
16. 将载玻片放入用铝箔覆盖的盒子中，转移至显微镜室。
17. 使用高倍率（60-100X）和高数值孔径的宽场荧光显微镜进行成像。
    注意：为了收集smFISH探针发射的尽可能多的光子，不建议使用共聚焦显微镜，因其会显著限制可收集的光量。本实验中，数据采集所用显微镜配备100倍、1.4数值孔径（NA）物镜，滤光片设置如下：CY5（激发波长632/22，发射波长679/34），曝光时间1.3秒，透射率100%；TRITC（激发波长542/27，发射波长597/45），曝光时间1.3秒，透射率100%；DAPI（激发波长390/18，发射波长435/48），曝光时间0.05–0.1秒，透射率32%–50%。同时应采集明场参考图像。为确保所有RNA信号点均被检测到，需从视野焦平面以下完全到底部至以上完全到顶部，以0.1–0.2 µm的步长采集15–25个光学切片。

4. 图像分析

1. 根据实验的具体需求，使用已发表的smFISH分析工具（如FISH-quant¹⁷ 和StarSearch²）或自行编写的程序分析smFISH数据。
   注意：一个良好的分析流程应允许用户设定阈值，以区分真实的RNA信号点与背景信号，并输出各项统计信息，例如每个信号点的X、Y和Z（可选）坐标及其强度、每个细胞中的信号点数量，以及可能的拟合参数，用于过滤假阳性检测结果。

结果

为了评估smFISH实验方案（如文中所述）的执行效果 图1），我们设计了一组包含54个探针的序列，覆盖该开放阅读框的全长 NDC80 基因图2A，顶端）。位于最5'端的探针称为Probe 1；下一个为Probe 2；第三个为Probe 3。 等等27个编号为奇数的探针（探针1、3、5……）均偶联了CAL Fluor 590（CF590）荧光染料；27个编号为偶数的探针（探针2、4、6……）则偶联了Quasar 670（Q670）荧光染料。因此，这些交替排列的探针组通常被称为“奇/偶”探针。在杂交后，两组探针应标记同一条转录本。

在完成点状信号检测后，我们采用若干指标来评估smFISH数据集的质量。第一个指标是奇数/偶数探针信号共定位的程度与质量。在本实验中，所有smFISH信号点中有88%实现了共定位（图2A和2B），其中超过95%的信号点对之间的距离在2个像素以内（图2C，成对），该范围在两个荧光通道之间因色差和检测畸变所导致的预期误差之内。相比之下，未成对的信号点中，仅有不到10%的最近邻距离小于2个像素，表明错误识别信号点对的概率较低（图2C）。未成对的信号点（12%）在两个通道之间分布均匀（图2B，比较仅CF590信号与仅Q670信号），因此我们得出结论：对于该长度为2.4 kb、每个细胞中表达水平在0至45个转录本之间的基因，每个荧光通道中约有94%的RNA分子被准确检测到。如果smFISH实验流程未达到最优，则可能出现以下情况：（1）更大比例的smFISH信号点仅显示两种荧光信号中的一种（非共定位）；和/或（2）细胞的信噪比极低，甚至完全无信号。

接下来，我们探究了smFISH信号的检测是否相对于每个细胞中RNA分子的总数存在偏差。在一个细胞群体中，每个细胞内特定RNA的总数呈分布状态，部分细胞含有的RNA分子数量多于其他细胞。一个良好的smFISH实验方案应能稳健地检测RNA，无论每个细胞中RNA分子的数量是高还是低。为了验证这一点，我们针对每个细胞，计算了具有共定位信号的smFISH斑点所占比例，以及仅有一种荧光信号的斑点所占比例。随后，我们将每个细胞中总斑点数相同的细胞归为一组，计算每组中具有共定位（成对）或非共定位（仅CF590或仅Q670）斑点的平均比例，并将该平均比例作为每个细胞总斑点数的函数进行作图（图3）。对于每一类斑点，其比例在整个每个细胞总斑点数范围内均保持相似。例如，比较每个细胞总荧光斑点数为20个与30个的细胞，其共定位斑点的平均比例相近。该结果表明，我们的实验方案能够检测细胞内较宽范围的RNA分子数量（至少可达约每个细胞40个分子）。如果该方案未达到最优性能，则可能观察到偏差。例如，随着每个细胞总斑点数的增加，仅含两种荧光信号之一的斑点比例可能随之升高。

利用这一优化后的实验方案，我们检测了编码动粒蛋白的 NDC80 基因在不同生长条件下的表达情况。NDC80 基因可表达两种 mRNA 异构体：长链非编码转录本异构体 NDC80^luti 与短链 NDC80^ORF 异构体相比，在5'端多出约400个碱基对的延伸序列，但两种转录本共享 NDC80 基因的编码区（见图4A示意图）。我们设计了两组探针：CF 590 探针组结合于 NDC80^luti 特有的5'区域；Q 670 探针组则结合于 NDC80^luti 与 NDC80^ORF 的共有区域。NDC80^luti 转录本被识别为两种探针信号共定位的单分子FISH（smFISH）斑点，而 NDC80^ORF 转录本则仅显示Q 670探针的信号。由于 NDC80^luti 特有序列的长度限制，我们仅能在此区域排列20条寡核苷酸探针，少于推荐的30至48条。因此，我们首先验证该探针组在优化方案中是否能稳定检测RNA信号。对于每个荧光通道，我们将每个smFISH斑点的信噪比（SNR，定义为斑点周围像素强度方差相对于斑点信号强度的比值）与检测到的信号强度作图，生成整个视野中所有识别斑点的散点图（示例图像见图4A，散点图见图4B）。在Q 670和CF 590探针组中，均清晰地识别出两个不同的信号群体（优化条件下，图4B），表明真实的smFISH斑点（灰色区域内）可与背景信号有效区分。需要注意的是，在非优化条件下，这种区分效果较不明显（非优化条件，图4B）。

我们使用这两组探针研究了 NDC80^luti 和 NDC80^ORF 在营养生长和减数分裂过程中的表达情况。在营养生长细胞中，可检测到Q 670探针组的强信号，而CF 590探针组则无信号（图5A，营养生长），这与Northern印迹结果一致，即仅短亚型在营养生长期间表达¹⁶。该结果还表明，CF 590探针组具有特异性，在我们优化的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验方案中背景信号较低。相比之下，在减数分裂前期，两组探针均检测到强信号，且大多数信号点存在共定位现象（图5A，减数分裂前期）。结合Northern印迹分析（图5B），该结果证实长亚型 NDC80^luti 特异性地在减数分裂中表达。这两种mRNA均在细胞质中被检测到（位于DAPI染色区域之外），表明它们均从细胞核中输出，这与核糖体图谱数据一致¹⁸。

为了确定所收集的数据是否足以准确反映数据集中固有的生物学变异，我们使用每个细胞的统计量进行了自助法分析（bootstrap analysis），这些统计量包括：(1) 每个细胞中发生共定位的荧光点所占比例；以及 (2) 仅含有两种荧光信号之一的荧光点所占比例（仅 CF 590 信号和仅 Q 670 信号）。在此分析中，程序从已量化的 437 个细胞中随机选取 1 个细胞，重复 500 次。接着，计算这 500 个被选中细胞各自统计量的均值和方差。随后，重复该过程，每次从所有细胞中无放回地随机选取 2 个细胞；然后随机选取 3 个细胞，依此类推，直至达到总数据集大小的一半。当分析的细胞数量达到约 40 个时，数据集的方差趋于平稳，表明此后均值的变化主要源于数据本身的内在变异，而非取样不足所导致的人为假象（图 6，插图）。当我们绘制每次迭代周期中采样细胞数对应的样本方差与样本均值之比时，这一趋势更加明显（图 6）。根据所示数据，当细胞数量达到约 60 个后，方差的变化变得极小。在单分子荧光原位杂交（smFISH）实验中，所量化细胞的数量应超过获得稳定均值和方差平台期所需的最小细胞数。在本研究中，每个样本、每个重复中我们量化了超过 95 个细胞。总的细胞数量（> 400 个细胞）远超反映群体均值所需的最小细胞数（约 60 个细胞）。

通过定制的 Matlab 程序¹⁶，发现营养生长期细胞中每个细胞的 NDC80^ORF 转录本中位数为 5，而在减数分裂前期细胞中，该中位数显著下降至每个细胞 4 个转录本（双尾 Wilcoxon 秩和检验，p = 0.026）（图 7）。每个细胞中 NDC80^luti 转录本的中位数为 21 个，且 100% 的细胞均表达 NDC80^luti 转录本。由于 mRNA 分子数量为离散量，我们将具有特定转录本数量的细胞比例绘制成阶梯状的相对频率直方图。每个直方图中最大的区间被归一化至相同高度。

图 1：单分子荧光原位杂交（smFISH）实验流程图。 对于营养生长样品和减数分裂样品，分别在室温下用甲醛固定 20 分钟，或在 4 ˚C 下过夜固定。用缓冲液 B 洗涤三次后，用 zymolyase 消化细胞，直至约 70%–90% 的细胞被消化。消化后的样品随后用缓冲液 B 洗涤一次以去除 zymolyase，并在 70% 乙醇（EtOH）中透化约 3.5 小时。为进行杂交准备，样品首先在含 10% 甲酰胺的洗涤缓冲液（FWB）中孵育约 20 分钟。接着，将样品重悬于约 50 µL 杂交溶液中（其中含有荧光探针），于 30 ˚C 黑暗条件下过夜孵育。杂交完成后，样品在 10% FWB 中孵育 30 分钟以洗去未结合的探针，然后在含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 10% FWB 中孵育以染色 DNA。对于在 FWB/DAPI 孵育后立即成像的样品，将其重悬于添加了过氧化氢酶、Trolox 和葡萄糖氧化酶的 GLOX 缓冲液（GLOX + enz）中；而其他样品则重悬于不含酶的 GLOX 缓冲液中，并在 4 ˚C 下保存不超过约 3 小时。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：使用奇/偶探针评估smFISH质量。 （A）顶部：奇/偶探针组示意图。54条寡核苷酸探针覆盖目标区域 NDC80 基因设计了探针。奇数探针用一种荧光染料标记（CF590，显示为品红色），偶数探针用另一种荧光染料标记（Q670，显示为绿色）。底部：使用奇数/偶数探针组获得的减数分裂前期细胞的代表性单分子FISH（smFISH）图像。样品取自细胞（UB8144）转入孢子形成培养基后6小时，此时细胞停滞在减数分裂前期。DNA用DAPI染色（显示为蓝色）。图像显示为z轴层扫图像的最大强度投影。比例尺：5 µm。（B）使用奇数/偶数探针组获得的成对或未配对smFISH信号点的百分比。共分析了428个减数分裂前期细胞，数据来自两次独立实验的合并结果。该图改编自 图2- 陈的图补充4 等¹⁶ （C）每对配对点之间的距离以及未配对点与其最近邻点之间距离的累积分布函数（CDF）。对于在某一荧光通道中检测到的每一个点，应用“k 最近邻”算法来识别在互补通道中距离最近的检测点，并记录到该点的距离。若两个定位点互为最近邻，则被视为配对，并生成一个新的列表，记录配对的点、仅在 CF590 通道检测到的点以及仅在 Q670 通道检测到的点。对于每一类检测结果，使用 Matlab 绘制距离的 CDF 直方图，结果证实，正确配对的点之间的距离确实显著小于在另一通道中无对应点的那些点之间的距离。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：配对与未配对信号点的比例随每细胞总RNA数量的变化。 为检验在不同表达水平下单分子FISH信号点的检测与配对是否存在偏差，将单个细胞按总RNA表达量进行分组。对每组细胞分别计算配对信号、仅CF590信号及仅Q670信号检测的平均比例。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：使用针对NDC80^luti和NDC80^ORF mRNA设计的探针所生成的smFISH数据的质量评估。 Q 670探针（显示为绿色）与NDC80^luti和NDC80^ORF mRNA共有的区域杂交，而CF 590探针（显示为洋红色）则与NDC80^luti特有的5'区域杂交。（A）在优化条件与非优化条件下获得的减数分裂前期NDC80^luti和NDC80^ORF的代表性smFISH图像。菌株UB8144（优化条件）和UB1337（非优化条件）被诱导进入减数分裂，并在减数分裂前期固定。这两个菌株携带不同的减数分裂同步系统，但使用任一系统均不影响smFISH质量（数据未显示）。在非优化条件下，细胞在室温下固定20分钟（无过夜固定），用未添加VRC的zymolyase进行消化，并在较低浓度VRC条件下进行杂交。图像显示为z轴层扫图像的最大强度投影。DNA用DAPI染色（显示为蓝色）。比例尺：5 µm。（B）散点图显示了在图4A所示视野中检测到的每个smFISH信号点的信噪比（SNR）及其信号强度，分别对应两种荧光通道以及优化或非优化条件。在优化条件下，smFISH信号点呈现两个群体。真实的smFISH信号点位于灰色区域内，与背景信号分离。在非优化条件下，单个mRNA难以通过肉眼分辨，且运行信号点检测软件后，真实信号点与背景之间的区分也不够明显。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：NDC80^luti 与 NDC80^ORF 转录本的表达具有时间特异性调控。（A）NDC80^luti 和 NDC80^ORF 在营养生长和减数分裂过程中的代表性单分子荧光原位杂交（smFISH）图像。营养生长样本取自细胞（UB8144）在营养丰富的培养基中处于对数生长期时。减数分裂前期样本取自细胞（UB8144）转入孢子形成培养基后6小时，此时细胞停滞在减数分裂前期。Q 670探针（绿色显示）与NDC80^luti和NDC80^ORF mRNA共有的区域杂交，而CF 590探针（品红色显示）则与NDC80^luti独特的5'区域杂交。DNA用DAPI染色（蓝色显示）。每个细胞通过其Zip1-GFP信号进行分期，该信号是减数分裂前期的标志物。我们的smFISH实验方案无需额外处理即可保留较强的GFP信号。营养生长期：Zip1-GFP阴性；减数分裂前期：Zip1-GFP阳性。图像显示为z轴层扫图像的最大强度投影。比例尺：5 µm。本图改编自Chen 等¹⁶的图2C。（B）减数分裂过程中（UB4074菌株）NDC80^ORF、NDC80^luti 转录本及Ndc80蛋白（Ndc80p）的表达水平。NDC80^luti 和 NDC80^ORF 的水平通过Northern印迹法测定，Ndc80p水平则通过抗-V5免疫印迹法在指定时间点检测。Hxk1p为免疫印迹的上样对照。与菌株UB8144相同，该菌株也携带pGAL-NDT80 GAL4-ER同步系统^19,20。细胞在0小时转入孢子形成培养基，并在6小时后通过添加β-雌二醇释放双线期阻滞。NDC80^luti 转录本在S期/减数分裂前期被显著检测到，而NDC80^ORF 转录本主要存在于减数分裂开始前（0小时）以及减数分裂期（7–9小时）。本图改编自Chen 等¹⁶的图6J 请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：对 图 5 中所示的减数分裂前期样本进行的自助法分析。 所有定量的细胞被合并，然后对特定数量（n）的细胞随机抽样500次。计算每个细胞中成对和未配对mRNA比例的均值及95%置信区间，并针对每种细胞数量n的选择绘制数据（插图）。通过绘制样本方差与均值的比值随抽样细胞数（n）的变化，可直观显示方差的平稳状态。实际测量的细胞总数（437个细胞）远超过误差达到平稳时所需的细胞数（约60个细胞），表明增加数据量不会进一步提高测量结果的置信度。请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：对 图 5 所示的单分子荧光原位杂交（smFISH）数据进行量化，以每个细胞中具有特定数量的 NDC80^luti 和 NDC80^ORF 转录本的细胞相对频率直方图表示，数据来自三次独立实验的合并结果。 虚线表示每个细胞中 NDC80^luti 和 NDC80^ORF 转录本的中位数。每个直方图均经过归一化处理，使所有直方图中的最高柱高度一致。共分析了 637 个营养生长期细胞和 437 个减数分裂前期细胞。分别对 NDC80^luti 和 NDC80^ORF 进行双尾 Wilcoxon 秩和检验，比较营养生长期与减数分裂前期样本。本图改编自 Chen et al.¹⁶ 的 图 2D。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液B（1 L 储存液：1.2 M 山梨醇；0.1 M 磷酸钾缓冲液，pH 7.5）	1x
无核酸酶水	500 mL
山梨醇	218.6 克
KH2PO4	2.18 g
K2HPO4	14.62 g
无核酸酶水	定容至1 L
过滤除菌后，分装为50 mL等份，4 ˚C保存
Zymolyase 100T（10 mg/mL）
-20 ˚C 下分装保存
将10 mg酵解酶粉末溶解于1 mL MilliQ水中
E. coli tRNA（10 mg/mL）
-20 ˚C 下分装保存
将10 mg tRNA粉末溶解于1 mL MilliQ水中
70% 乙醇（50 mL）	1x（mL）
纯乙醇	35
无核酸酶水	15
*室温保存
杂交缓冲液（10 mL）	1x（毫升）
50% 硫酸葡聚糖	2
E. coli tRNA（10 mg/mL）	1
200 mM 钒酰核糖核苷复合物（VRC）	0.1
BSA，50 mg/mL	0.04
20x SSC	1
甲酰胺	1
无核酸酶水	4.86
-20 ˚C 下分装保存，每管 250 µL 或 500 µL
10% 甲酰胺洗涤缓冲液（10 mL）	1x (mL)
甲酰胺在 室温	1
20x SSC	1
无核酸酶水	8
*现配，涡旋振荡20-30秒以混匀
10%葡萄糖溶液
过滤除菌后分装，于 4 ˚C 保存
将1 g葡萄糖溶解于10 mL无核酸酶水中
葡萄糖氧化酶
-20 ˚C 下分装保存
将3.7 mg葡萄糖氧化酶溶解于1 mL 50 mM NaOAc缓冲液（pH 5）中
无酶抗淬灭（GLOX）缓冲液（1 mL）	1x（µL）
无核酸酶水中的10%葡萄糖	40
1 M Tris，pH 8.0	10
20x SSC	100
无核酸酶水	850
*现配现用，也可将分装样品于4 ˚C保存
含酶抗淬灭缓冲液（GLOX）（50 µL）	1x（µL）
过氧化氢酶（轻轻涡旋，易沉淀）	0.5
葡萄糖氧化酶	0.5
100 mM Trolox（溶于乙醇）	1
GLOX缓冲液	50
每次现配，置于冰上制备，4 ˚C 可保存 2–3 小时

表1. 缓冲液与培养基

讨论

本文所述方案基于其他已发表的单分子荧光原位杂交（smFISH）方案^2,3,21,22,23，并针对酵母菌株背景SK1进行了专门优化。优化的参数包括细胞数量、固定时间、离心速度与时间、消化时间、消化缓冲液、探针浓度和杂交缓冲液。其他参数，如杂交温度和时间，未进行优化。在本节中，我们提供一些注意事项，以帮助将该方案适配至任何酵母菌株背景及感兴趣的生长条件。

出芽酵母的细胞壁是获得高质量单分子荧光原位杂交（smFISH）图像的主要障碍之一，因为细胞壁会阻碍探针的渗透。若使用蜗牛酶（zymolyase）对细胞壁的消化不完全，会导致探针杂交效率低下，并引起细胞间信号的高度变异性。然而，过度消化会使 细胞过于脆弱，从而在洗涤步骤中造成大量细胞丢失，或在制片成像过程中发生细胞破裂。因此，优化消化时间至关重要。我们建议通过 pilot 实验，对同一样本设置不同的消化时间进行测试。在我们的实验中，当约80%的细胞失去折光性时终止消化，可获得最佳的smFISH数据。通常情况下，在相同培养条件下，不同遗传突变株的消化时间相似。然而，在不同培养条件或出芽酵母减数分裂的不同阶段之间，所需的消化时间会有所差异。一旦确定了最佳时间，smFISH实验的质量即可稳定重现。需要注意的是，对于细胞壁合成和/或组分存在缺陷的突变株，消化过程可能在15分钟内即已完成。不同批次的蜗牛酶也可能轻微影响消化所需的时间。

最佳探针浓度对于实现高信噪比至关重要。我们自行设计并商业定制合成了smFISH探针。优质的探针（通常为20聚体）其GC含量百分比应处于适宜范围 从35%到45%，探针之间至少间隔2个碱基对，并具有较低的交叉反应性。我们使用生产商提供的基于网页的探针设计工具生成探针列表；若可选探针数量充足，则利用酿酒酵母基因组数据库（Saccharomyces Genome Database）中的BLAST算法，剔除与其他基因组区域重叠超过17个碱基对的探针。对于退火至唯一基因组区域的探针组，我们选择光稳定性更高的荧光染料（CAL Fluor 590） NDC80^luti （CF 590），因为在该探针组中，满足上述所有标准的探针数量（20个）低于制造商推荐的最低数量（约25个）。按照制造商说明书重悬探针溶液后，将原液进行1:10稀释，并将稀释后的溶液以5 µL分装保存于-20 ˚C。每份分装仅使用一次。为优化实验条件，应从1:10稀释液开始进行系列稀释，测试何种浓度可获得最佳信噪比。我们建议从原始原液制备1:250、1:500、1:1000和1:2000的稀释系列。在本实验中，对于CF 590和Q 670探针组，1:500的稀释比例均获得了最佳的信噪比。

对于芽殖酵母的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验，最佳固定时间也至关重要。我们发现，与室温下固定20分钟相比，4 ˚C条件下过夜固定显著提高了减数分裂样品smFISH结果的一致性和质量。尽管我们尚未测试过夜固定对营养生长阶段样品的影响，但在该生长条件下，室温固定效果良好。因此，为了针对新的菌株或生长条件优化smFISH实验方案，我们建议从室温下较短的固定时间开始，若遇到信号变异较大的情况，可逐步延长固定时间。

与其他已发表的方案^3,22,23相比，本方案在消化过程中使用 RNase抑制剂VRC，并在杂交过程中采用 更高浓度的VRC。在这两个步骤中添加VRC可提高smFISH结果的一致性，原因可能是更有效地保护RNA分子免受核酸酶活性的影响，而这种核酸酶可能来源于溶壁酶混合物（该酶由粗提物纯化而来，可能含有RNase污染物）。因此，我们建议采用本方案中列出的VRC用量，或使用更高浓度的VRC进行优化。

在缓冲液B和甲酰胺洗涤缓冲液的洗涤步骤中，可能会损失大量细胞。为减少细胞损失，可提高离心速度。在本实验中，使用高速（21,000 × g）离心以沉淀样品，显著减少了 细胞丢失。然而，zymolyase 消化后的细胞非常脆弱，因此不建议改变离心速度。我们建议使用 USA Scientific 的低吸附性离心管，这能在甲酰胺洗涤缓冲液的洗涤过程中显著帮助细胞形成沉淀。总体而言，我们的方案能够稳定地获得足够密集的单层细胞，适用于高效成像。通常情况下，7 个视野即可获得 >130 个适用于定量分析的细胞。

最后，确定图像分析所需的最优参数及输出结果非常重要。为了检测单分子FISH信号点，已发表的分析程序通常使用高斯核对原始图像进行滤波，以去除背景信号，并要求用户为每组图像设定信噪比^2,17。然而，目前尚无统一的标准用于确定合适的参数，因此有必要对不同设置进行一些经验性测试。为了设定每个步骤所需的参数，需要迭代输入不同的参数组合，并检查每组参数所得结果与在少数代表性细胞中手动计数结果的吻合程度。一旦确定了一组合适的参数，即使在不同生长条件和遗传背景下获得的图像，大多数情况下也可使用该组参数进行分析。

此外，可以测试是否能在定量之前对smFISH图像进行最大强度投影²²。该步骤可简化斑点检测算法，并显著缩短成像时间，但可能会损失一些关于单个斑点的潜在有用信息，例如其亚细胞定位。在我们的实验中，NDC80 基因产生的mRNA分子数量足够少，经过该处理后斑点分离良好（这在芽殖酵母的转录本中并不罕见^3,7）。当共定位分析至关重要时，分析流程需要确定每个通道中每个smFISH斑点的位置，以评估共定位情况。根据具体研究问题的不同，可能还需要从分析流程中提取其他信息，例如每个斑点的强度，用于进一步分析。优化实验方案和图像分析流程中的关键步骤，对于获得高质量的smFISH数据以研究目标问题至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白，无RNase（50 mg/mL）	Ambion	AM2616	于 -20 °C 保存。
过氧化氢酶	Sigma	C3515	短期保存于 4 °C。使用前涡旋混匀。
DAPI	Sigma	D9564	用水重悬后于 -20 °C 保存。避光。
50% 硫酸葡聚糖	Milli Pore	S4030	室温保存。黏度很高，为黏稠液体，操作需耐心。
E. coli tRNA	Sigma	R4251	用水重悬后分装，于 -20 °C 保存。
乙醇（100%，200 proof）	多种		易燃。
37% 甲醛	Fisher	F79-500	室温保存。有毒。使用和处置时需谨慎。
甲酰胺	Ambion	AM9342	于 4 °C 保存。待温度升至室温后再开启，以防氧化。有毒。使用和处置时需谨慎。
葡萄糖	多种		溶解于无核酸酶水中后，于 4 °C 保存。
葡萄糖氧化酶	Sigma	G2133	用 50 mM NaOAc（pH 5.0）重悬后分装，于 -20 °C 保存。
无核酸酶水	Ambion	AM9932	室温保存。
磷酸钾（单碱基和双碱基）	多种		室温保存。
探针文库，稀释于 TE 缓冲液（pH 8.0）中	Biosearch Technologies		按照生产商说明，用 TE 缓冲液（pH 8.0）重悬后分装（5 µL），于 -20 °C 保存。避光。
山梨醇	多种		室温保存。
20X SSC	Ambion	AM9763	室温保存。
TE 缓冲液，pH 8.0	Ambion	AM9849	室温保存。
1 M Tris，pH 8.0	Ambion	AM9856	室温保存。
Trolox	Sigma	238813	分装后于 -20 °C 保存。
200 mM 钒酰核糖核苷复合物（VRC）	NEB	S1402S	按生产商说明重悬后分装，于 -20 °C 保存。
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	用水重悬后分装，于 -20 °C 保存。
低吸附离心管	USA Scientific	1415-2600	室温保存。