利用基于细胞的检测法检测中和酶替代疗法细胞摄取的抗体

摘要

本文介绍一种基于细胞的流式细胞术方法，用于检测中和抗体或其他干扰酶替代疗法在人源性基质（如脑脊液（CSF）或人血清）中细胞摄取的因素。

摘要

向患者给予酶替代疗法（ERT）及其他生物制剂疗法可能会引发抗药物免疫反应。对抗药物抗体（ADA）进行表征，特别是那些可能中和药物生物学活性的抗体（称为中和抗体，NAbs），对于理解这些抗体对药物药理学特性的影响至关重要。本方案描述了一种基于细胞的流式细胞术方法，用于检测在人源基质中能够中和代表性溶酶体ERT细胞摄取的中和因子。该方案包括三个步骤：筛选、确证试验和滴度检测，用以在受试者样本中检测、鉴定并确定中和抗体相对滴度水平。

在此方法中，样品首先与荧光素标记的 ERT 产物混合，然后与细胞孵育。例如，表达细胞表面无阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）的人T淋巴细胞（Jurkat细胞），最后通过流式细胞仪进行分析。无中和抗体（NAbs）的样本将导致荧光标记的酶替代疗法（ERT）产物被细胞摄取 通过 CI-M6PR，而NAbs的存在会与药物结合，从而干扰CI-M6PR的结合与摄取。通过流式细胞术检测Jurkat细胞内化的荧光标记ERT的量，并以相对于代表性无药基质样本所获得信号的百分比（%）抑制率进行评估。在确证步骤中，样本先与ERT偶联的磁珠预孵育，以清除与药物特异性结合的因子（如NAbs），然后再与细胞孵育。在本检测中筛查并确证为药物特异性NAbs阳性的样本，将进行连续稀释以测定抗体滴度。半定量的抗体滴度可与药物安全性和有效性的测量结果相关联。

引言

免疫原性评估是任何生物治疗产品（包括酶替代疗法，ERT）安全性与有效性监测项目的重要组成部分。患者可能产生免疫反应，从而直接影响药物的安全性、有效性以及药代动力学/药效动力学特征。其中一部分抗药抗体（ADA）被称为中和性抗体（NAbs），可通过两种机制抑制ERT的疗效：一是抑制ERT被靶细胞摄取，二是抑制ERT的催化活性。本文所述方法旨在检测干扰ERT进入细胞的中和性抗体。为了全面监测治疗用ERT的安全性和有效性，持续监测中和性抗体对于阐明其与临床结局或药效动力学效应之间可能存在的相关性至关重要¹。

用于评估针对蛋白质治疗药物的中和抗体（NAbs）的平台包括基于细胞的检测、酶活性检测和配体结合检测¹根据多种标准选择最佳的检测平台：治疗产品的作用机制、检测平台的灵敏度、选择性、精密度，以及尤为重要的是其模拟能中和抗体（NAbs）抑制作用的能力。 体内配体结合实验在某些情况下可能是合适的（例如，当无法确定相关细胞系或基于细胞的检测方法无法达到适当灵敏度时）。然而，在2016年美国食品药品监督管理局（FDA）发布的行业指南草案文件及其他业内公认的技术白皮书中，推荐使用基于细胞的中和抗体（NAb）检测方法，因为该方法可能更真实地反映药物的生物学作用机制 体内^1,2,3.

开发基于流式细胞术的细胞中和抗体（NAb）检测方法的关键组分包括：一种能够对药物刺激产生反应的合适细胞系、一种可中和酶替代疗法药物（ERT）的替代性阳性对照中和抗体、一种荧光染料标记的ERT，以及待测物种的生物基质^4,5,6。细胞系的选择取决于ERT的作用机制，在方法开发过程中应评估多种细胞系³。在本研究所描述的方法中，选择人Jurkat T细胞是因其在细胞表面内源性表达CI-M6PR，且不表达抗体片段受体（FcRs），从而避免非特异性结合大多数抗体的Fc区域^7,8。在方法开发过程中，建立阴性对照对于验证研究和患者样本检测至关重要，例如可使用未接受受试药物治疗的个体血清混合物作为阴性对照¹。为确保药物研发在非临床、临床及上市后阶段的一致性，细胞系还应能耐受来自不同物种的相关基质¹。另一个关键组分是检测方法中阳性对照的选择。ERT细胞摄取检测的阳性对照是根据其能否结合治疗性药物并阻断其通过CI-M6PR介导的摄取能力而选定的^9,1。通常很难从人类受试者获得足量且稳定的中和抗血清用于检测对照，尤其是在罕见病患者群体中更为困难²。替代方案包括来自高免疫动物的抗血清，或将亲和纯化的多克隆或单克隆抗体添加至与检测相关的基质中¹。当使用物种特异性基质时，需注意基质中除抗体外的其他抑制性因子也可能抑制ERT的摄取。检测方法的另一个关键组分是荧光染料标记的ERT。针对不同ERT，应根据检测对荧光亮度、pH稳定性以及在流式细胞仪其他检测通道中可能产生的光谱重叠等因素，评估并选择合适的荧光染料进行偶联。

此处所述的检测方法可用于测量针对进入细胞的治疗性蛋白质（如酶替代疗法药物）的中和抗体 通过 CI-M6PR。多种用于治疗溶酶体贮积症（LSDs）的酶替代疗法（ERT）利用该途径实现细胞摄取和溶酶体靶向，包括用于黏多糖贮积症ⅣA型（Morquio A综合征）的elosulfase alfa、用于CLN2型Batten病的cerliponase alfa、用于法布里病的agalsidase alfa，以及用于庞贝病的alglucosidase alfa。^10,11该方法的目的是测量干扰药物结合和内化的中和抗体（NAbs）的相对水平。 通过 CI-M6PR。该过程分为分级筛选、确认和滴定三个步骤³样本首先进行中和抗体（NAb）阳性筛查，随后在确证步骤中确认为阳性。最终，经筛查和确证均为阳性的样本可进行系列稀释，以测定抗体滴度¹基于细胞的流式细胞术药物摄取检测方法具有高灵敏度且在机制上具有相关性 体外 检测可能影响药物药理学特征的药物特异性中和抗体的方法。我们此前已对该方法进行了验证，并利用此平台对临床样本中用于药物elosulfase alfa的检测进行了测试⁸本文详细描述了一种可应用于其他治疗性蛋白或酶替代疗法（ERT）的逐步操作方案。

方案

人源基质购自商业来源，并已获得其机构审查委员会（IRB）的批准，但仍应视为具有潜在传染性。确保所使用的实验室环境始终秉持安全文化¹²。

1. 开始检测前的准备

1. 根据制造商说明书制备ERT偶联的链霉亲和素磁珠¹³.
2. 制备质量控制样本（QCs）：加入阳性对照抗体（PC）例如，一种物种特异性基质中的中和抗体（NAb）例如，混合脑脊液或血清）。
   注意：美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的指导原则建议，在方法学验证和常规检测中应制备高浓度和低浓度质控样本。^1,14.
   1. 例如，要获得浓度为 10 µg/mL 的阳性对照，可将 10 µL 浓度为 1 mg/mL 的阳性对照储备液加入 990 µL 相应基质中例如，脑脊液（CSF）总体积为1,000 µL。
   2. 将质控样品分装为适合单次使用的体积（例如，50 µL）并分装后于 -60 至 -80 °C 冻存¹.
   3. 分装一份未经受试品处理的切割点对照（CC）物种特异性基质例如，用于单次使用的混合脑脊液或血清）例如，50 µL）并分装于-60至-80 °C保存¹.
3. 使用蛋白质标记试剂盒，按照制造商的说明书将荧光染料与ERT进行偶联反应¹⁵将样品分装为适合单次使用的体积（例如，50 µL），并在 -60 至 -80 °C 下冻存。

2. 第1天：细胞铺板与样品准备

1. 细胞板制备
   1. 使用组织培养罩，并为以下步骤维持无菌环境。将要放入培养罩中的每个物品用70%乙醇喷洒，并保持清洁环境^16,17,18。
   2. 在37 °C的水浴或珠浴中预热细胞生长培养基（例如，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640）¹⁹。
   3. 计数人T淋巴细胞Jurkat细胞，并在适用于配备板加载器的流式细胞仪的96孔圆底细胞培养板中，以每孔100 µL、7.5 × 10⁵ 个细胞/mL的密度接种。
      1. 例如，使用血细胞计数板或自动细胞计数器进行细胞计数^20,21。
      2. 确保细胞在进入实验前活力至少达到70%（例如，通过台盼蓝染色评估细胞活力）¹⁷。
   4. 将细胞置于37 °C、5% CO₂ 和95%湿度的培养箱中孵育过夜14–20小时。
2. 筛选样本制备
   1. 使用无血清培养基（例如，RPMI-1640）稀释待测样本或检测对照样本。在此示例方法中，将样本以1:2.5的比例在RPMI-1640中稀释，即向90 µL无血清培养基中加入60 µL样本（例如，8联管）。随后进入步骤3.1，进行检测操作以制备荧光标记的ERT。
      注：1:2.5的稀释比例是通过实验确定的，适用于本方法中所述条件。每种新开发的方法应单独确定最佳样本稀释比例。
3. 确证性磁珠及样本制备
   1. 计算确证性样本所需的ERT偶联磁珠数量。
      1. 例如，对于10个样本，所需磁珠体积为：10个样本 × 每样本100 µL ERT偶联磁珠 + 30%额外量以补偿洗涤过程中的损失 = 1,300 µL ERT偶联磁珠。
   2. 充分涡旋混匀磁珠。将计算所得体积的磁珠加入15 mL锥形管中以进行洗涤。
   3. 通过加入1,300 µL偶联缓冲液或按生产商建议的缓冲液（例如，含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液）对ERT偶联磁性微珠进行洗涤，操作步骤如下¹³。
   4. 充分涡旋混匀试管。将试管置于磁力架上静置2分钟。在不扰动磁珠的前提下，小心吸除并弃去上清液。
      注：当磁珠被吸附至磁铁一侧时，溶液颜色会由深棕色变为透明。
   5. 用1,300 µL偶联缓冲液重悬磁珠。重复上述洗涤步骤，共洗涤四次。
   6. 最后一次洗涤后，将磁珠重悬于先前在步骤2.3.1.1中计算所得的1,300 µL偶联缓冲液中。根据板图，每孔加入100 µL至96孔白色圆底非结合性聚丙烯板中（例如，每个样本或质控样本对应一个确证孔；样本在与荧光标记ERT孵育时将分为复孔）。
   7. 将板置于96孔侧裙边磁板架上，使磁珠沉降形成沉淀。小心吸除透明上清液并弃去。
      注：在侧裙边磁板架上放置约1–2分钟后，溶液将由深棕色变为透明。所得磁珠称为“干燥”磁珠。
   8. 若筛选结果为阳性的样本需进行确证，则向指定孔中分别加入100 µL样本（一组含ERT偶联磁珠，一组不含）。用塑料封板膜密封板孔，并在室温（RT）下以约800 rpm的速度在旋转摇床上震荡至少60分钟。
      注：每次实验均应包含先前制备并冻存的阳性与阴性质控样本以及对照样本（CC）。
   9. 孵育结束后，将确证板置于96孔侧裙边磁板架上，使磁珠沉降形成沉淀。
4. 滴度稀释系列制备
   1. 为制备滴度系列，将样本在混合基质中进行连续稀释，稀释次数应足够多，以跨越预设的滴度临界值¹。
   2. 例如，在1:3稀释系列中，将30 µL样本与60 µL混合基质混合，共进行8个稀释梯度（例如，8联管）。随后进入步骤3.1，进行检测操作以制备荧光标记的ERT。

3. 第1天：检测步骤

1. 在无血清培养基中配制荧光标记的 ERT（例如，每孔60 µL，或每板约6 mL。
   1. 例如，要配制 10 mL 浓度为 1 µg/mL 的荧光标记 ERT，可将 10 µL 浓度为 1 mg/mL 的荧光标记 ERT 储存液加入 9.99 mL 无血清培养基中例如RPMI-1640
2. 在新的培养板中（例如，96孔，白色，圆底，非结合性聚丙烯板）中，加入步骤2.2、2.3或2.4中制备的样品，以及荧光标记的ERT，按1:1比例混合，每组设复孔例如，每孔加入60 µL已制备的样品和60 µL荧光标记的ERT。
   注意：实验板布局示例见下文 图1.

图1：实验孔板布局示例。 样本与荧光标记的ERT在2–8 °C条件下孵育过夜。质量控制样本，如高值质控（HQC）、低值质控（LQC）和阴性质控（NQC），被置于孔板对角位置进行筛选和确认，以评估孔板的均一性。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用多通道移液器反复吹打数次，将样品与荧光染料标记的 ERT 混合。用铝箔包裹板子，在 2–8 °C 下孵育过夜 14–20 小时。

4. 第2天：将制备好的样品加入细胞

1. 从2–8 °C的孵育环境中取出样本孵育板，将其置于37 °C的珠浴中预热10–15分钟。
2. 从CO₂培养箱中取出细胞，使用倒置显微镜对已接种的细胞进行目视检查，确保细胞状态良好且在各孔中分布均匀^17,19。
3. 根据实验板图，向细胞板的各孔中加入100 µL预先混合的样本和荧光标记的ERT。
4. 将加样后的细胞板放回37 °C的CO₂培养箱中，孵育3小时±15分钟。
   注意：该孵育时间已在实验室中确定为本检测中信噪比响应的最佳时间。
5. 在14–18 °C条件下，使用台式离心机以320 x g离心6分钟。确认各孔底部存在细胞沉淀。
6. 将板倾斜30–45°角，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。向每孔中的细胞沉淀加入200 µL 1x DPBS，以重悬细胞。
7. 重复细胞洗涤步骤，共洗涤3次。随后立即进入步骤5，进行细胞活力染色。

5. 第2天：细胞活力染色

1. 使用多通道移液器，向每个选定的孔中加入 100 µL 工作浓度为 1x 的 Live/Dead 染料溶液，该染料的发射波长应与荧光标记的 ERT 所用的不同，并根据制造商说明书进行配制²²。
2. 在室温避光条件下孵育 15 分钟。随后将培养板置于 14–18 °C 的台式离心机中，以 320 × g 离心 6 分钟。
3. 小心吸除各孔中的上清液，避免扰动细胞沉淀。用 1x DPBS 将细胞洗涤一次。

6. 第2天：用1%多聚甲醛固定细胞

1. 使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 冷却至 2–8 °C 的 1% 多聚甲醛（PFA）。
2. 密封培养板，轻轻脉冲振荡以混匀。用铝箔包裹培养板，置于 2–8 °C 环境中至少 10 分钟，以完成固定。
   注意：操作时需小心，避免液体溅到板封膜上。
3. 分析前，使用多通道移液器向每个孔中加入 50 µL 1× DPBS，并上下吹打混匀。

7. 流式细胞术

1. 将培养板放置在流式细胞仪的板式进样器上并运行。
2. 使用流式细胞术软件（参见材料表）获取并记录测得的中位荧光强度（MFI）。
   注意：参见图2中的进样器设置示例。该检测已对样本流速、样本体积、混匀体积、混匀速度及混匀次数进行了优化。可根据所使用的流式细胞术采集软件，通过各参数数值旁的“向上箭头”或“向下箭头”按钮对这些参数进行调整²³。

图2：流式细胞仪进样器设置示例。 每种新建立的检测方法都应优化相应的进样器设置。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 按照图3所示创建流式细胞仪分析/门控/图谱。
   注意：不同流式细胞术软件的设门与应用方法可能有所差异²³。

图3：流式细胞术设门策略。 Jurkat 细胞通过前向散射（FSC）图从总事件中分离并收集 与 侧向散射（SSC）通道，并在目标细胞群周围绘制门控。使用前向散射面积（FSC-A）和前向散射高度（FSC-H）通道将单细胞（单细胞）与双联体或更大的细胞聚集体区分开。通过门控排除能被活死染料染色的单细胞，从而选择活细胞。在单个活的Jurkat细胞中测量中位荧光强度（MFI），并以直方图形式展示。药物摄取被阻断的细胞的MFI值（例如，HQC）以及对照摄取量的细胞（分别为红色和蓝色）的图像。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 从分析中排除死细胞，并记录约 10,000 个事件²³。

8. 数据分析

1. 将数据（原始 MFI）导出至分析软件（参见材料表）。
   注意：根据所需的分析类型，可使用分析软件执行以下数据分析。
2. 计算复孔（质控品和样本）的平均 MFI 以及变异系数（%CV），以评估复孔值相对于平均值的离散程度。
   
   
   
3. 对于在检测中进行筛查的样本和质控品，计算相对于合并基质 CC 质控品平均 MFI 的信号抑制百分比（%SI）。
   
4. 如需进一步分析，可计算确认阶段的质控品和样本相对于相应筛查值的回收率（RR）。
   

结果

在实验的第一天，将一份冻存的Jurkat细胞解冻并接种，同时制备待测样品。图1展示了一个示例板图。第二天，将样品与Jurkat细胞混合，在37 °C下孵育约3小时15分钟。随后对细胞进行洗涤、PFA固定，并在流式细胞仪上进行分析。图2展示了流式细胞仪的示例设置。

流式细胞术设门策略旨在测定活体单个Jurkat细胞中荧光素偶联药物的含量²⁴ (图3）。通过设门排除细胞碎片（通常为低前向散射光信号，FSC）和死细胞（通常为高侧向散射光信号，SSC），将细胞与碎片分离，仅保留活细胞用于后续分析²⁵通过绘制排除高FSC区域和低FSC高度的门，将单细胞从细胞簇中分离出来²⁶细胞经活力染色处理，该染料可标记细胞膜不完整的死亡或非健康细胞，并设置额外的门控以排除死细胞²²活单细胞的MFI用于分析荧光染料标记的ERT摄取。作为潜在筛选试验结果的一个示例，向基质中添加了高浓度的替代性抗药抗体阳性对照[例如，高质量对照（HQC）] 抑制了荧光素偶联的 ERT 摄取，导致 MFI 较低，约为 300（图3）。相比之下，未添加阳性对照抗体而仅与基质共同孵育的细胞应具有更高的MFI（MFI = 37,830） 图3），表明荧光团偶联的酶替代疗法（ERT）被成功摄取。

本示例中的中和性阳性对照抗体是根据药物的作用机制（即通过CI-M6PR介导的ERT摄取）来选择的。同时测试并比较了多种荧光染料，以获得最佳的检测灵敏度和动态范围¹。CypHer 5e被纳入测试，因其在酸性pH条件下荧光信号增强，这可能对某些ERT药物的溶酶体靶向性提供额外的评估依据²⁷。此外，还考察了一种绿色荧光染料（例如，Alexa Fluor 488）和一种远红荧光染料（例如，Alexa Fluor 647）。不同荧光染料表现差异的示例如图4a和4b所示。在该示例中，Alexa Fluor 647标记的ERT表现最佳，因其具有更高的灵敏度（例如，在最低阳性对照浓度下达到最高的%SI值）以及宽广的动态范围（约3个数量级）。

图4：不同荧光染料-ERT偶联物的示例结果。 (A在检测方法开发过程中，应使用不同荧光染料标记的ERT进行阳性对照（PC）稀释曲线的评估。在本示例中，测试了两种浓度为6.25 µg/mL的荧光染料标记ERT（Alexa Fluor 488和CypHer 5e）以及一种浓度为1.56 µg/mL的荧光信号更强的染料标记ERT（Alexa Fluor 647），并在这些条件下加入浓度递增的阳性对照中和抗体（NAbs）。B该图展示了来自前一图的曲线 A 使用MFI作图，显示采用Alexa Fluor 647标记的ERT后动态范围显著增加。 请点击此处查看此图的放大版本。

所述方法是一种分层次的方法，用于检测、确认并插值准定量水平的中和抗体滴度³。为确定该检测方法已具备验证条件，应根据既定指导原则^1,3评估包括检测灵敏度、精密度、选择性、特异性、药物耐受性、稳健性以及临界值在内的各项参数。

当样品的 %SI 值高于筛选临界值（SCP）时，判定该样品在此检测中为潜在阳性。SCP 通过统计学方法确定，即检测来自代表性人群的未经药物处理的样本，并测量信号强度（SI）的相对降低程度³。相关指南（例如美国食品药品监督管理局 FDA 的指南）建议，SCP 应设定为正态分布数据集中第 95^th 百分位数，SCP 的计算方法在其他文献中已有详细描述¹。任何导致检测信号降低（以 %SI 升高表示）且达到或超过 SCP 的样品被判定为潜在阳性；而检测结果高于 SCP 但 %SI 无变化或未降低的样品则视为阴性。

初筛阳性（%SI 高于 SCP）的样本进一步接受确证试验，以确定中和抗体（NAbs）对 ERT 的特异性。确证试验通过将样本与 ERT 偶联的磁珠预先孵育，以去除药物特异性抗体或抑制因子。通过评估确证试验 MFI 与初筛 MFI 的比值（RR），判断样本中被清除的 NAbs 数量。若 RR 高于计算得出的阳性阈值[即，确证性临界值（CCP）] 表明存在抗药性中和抗体（NAbs）。与筛选试验相同，在确证试验中应首先通过评估来自代表性人群的未经治疗样本建立CCP。CCP基于统计学确定的1%假阳性率，是判定样本为确证阳性结果的阈值图5)³.

对筛查并确认为阳性的样本进行连续稀释，并在滴度检测中进行测试，以确定每个样本中中和抗体（NAbs）的相对水平或滴度。当样本检测结果为阳性且超过指定阈值[例如，滴度临界值（TCP）]时，其最高稀释倍数即为该样本的滴度（图5）^1,3。

图 5：样本检测结果示例。 这些图示展示了通过筛查检测呈阳性或阴性的样本示例，筛查依据为信号抑制百分比（%SI）高于或低于17.51%的临界值（SCP）。阳性样本随后进入确证实验，使用药物偶联磁珠从样本中去除药物特异性抗体后，再进行检测。若样本的回收率（RR）高于确证临界值（i.e.，RR = 1.315），则判定为确证阳性。对确证阳性的样本进行系列稀释，直至信号降至滴度临界值（TCP）以下，以确定样本结果等于滴度临界值时的滴度（稀释倍数）。请点击此处查看该图的高清版本。

在多日时间内由不止一名分析人员对检测的重复性和变异性进行了测试。质控品（QCs）最初以一批次制备，并分装为单次使用的小份 aliquot。在连续3天内，两名分析人员使用多组质控品进行了检测，以评估检测的精密度。在所示示例数据中，质控品的批间和批内精密度的变异系数（%CV）均低于美国食品药品监督管理局（FDA）指南推荐的 %CV < 20% 的标准（图6）¹。

图6：两名分析人员在三天内生成的质控精密度数据示例。 精密度数据采用方差分析法（ANOVA）进行计算，所用公式来自DeSilva et al.²⁸。日内（同一批次内）和日间（不同批次间）统计结果以%CV形式报告。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过CI-M6PR介导的ERT摄取可能受到中和抗体或其他因素的抑制，从而影响ERT的安全性或疗效¹因此，使用与药物作用机制相关的稳健模型来评估受试者样本中的中和抗体（NAbs）显得尤为重要。我们及其他研究者发现，某些生物测定方法的性能（例如受体二聚化，荧光素酶表达 等等。不符合卫生主管部门对检测精密度、重复性和灵敏度的建议²⁹在本文所述的生物测定方法中，采用表达内源性CI-M6PR的Jurkat细胞来监测特异性针对溶酶体酶替代疗法（ERT）摄取的中和抗体（NAbs）。该方法结合流式细胞术检测读数，利用生理相关的细胞模型，具有适当的检测精密度、灵敏度、可重复性以及高通量样本处理能力。基于流式细胞术读数的中和抗体检测方法也已应用于其他疾病领域。例如，已有方法被开发用于检测针对戊型肝炎病毒和腺相关病毒（AAV）的预存抗体^30,31.

实验方案中的关键步骤包括选择合适的荧光染料、加入用于监测检测灵敏度的低质控品（LQC）、确保足够水平的细胞活力，以及严格遵守孵育时间。在本示例中，连接至溶酶体酶替代疗法药物（ERT）的荧光染料（例如，Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647 和 CypHer 5e）在性能上表现出显著差异。其中 Alexa Fluor 647 的荧光信号最强³²，被选用于后续检测方法的开发。我们建议在检测方法开发早期即对多种荧光染料进行评估，以获得最佳的灵敏度和动态范围。在样本检测过程中，应通过包含一个接近检测灵敏度限值的 LQC 来监控检测灵敏度，使其在 1% 的检测运行中出现失败¹。结合高质控品（HQC），LQC 还可作为系统适用性质控，用于长期监测检测系统的漂移情况³。通过制备一次性分装的细胞库，并根据可比的质控结果对新细胞库进行验证，可实现最佳的细胞活力和检测性能^3,18。细胞与荧光染料偶联药物的孵育时间对检测结果的一致性也至关重要，因为药物摄取量随其与细胞共孵育时间的延长而增加。为减少药物摄取在不同实验日之间的变异性，可将样本数据归一化至每块板上的混合基质对照样本（例如，上述方法中的临界值对照样本）。使用该方法获得稳定数据的另一个重要因素是监控板内均一性，并尽量减少可能的边缘效应。初步实验可包括在整个微孔板上使用单一质控品进行检测，而更全面的实验则可在方法验证阶段进行（例如，精密度和准确度验证）¹。这凸显了板图设计的重要性³³。如板图示例所示，将质控样本置于板的两侧，可监测板内均一性，并通过 Levey-Jennings 图表对均一性进行长期追踪³⁴。

尽管该检测方法可监测中和抗体及其他可能抑制溶酶体酶替代疗法（ERT）摄取的因素，但仍需进行额外实验以确认是否存在由抗体引起的摄取抑制。一种可行方案是使用蛋白A/G/L处理样本，该蛋白可非特异性地结合免疫球蛋白³⁵。若经蛋白A/G/L去除处理后样本仍呈阳性，则可能存在非抗体类抑制因子导致药物摄取受阻。本文所述方法旨在检测抗体介导的摄取抑制作用；若发现大量受试样本中的抑制效应源于非抗体类抑制因子，则应重新评估阳性对照及其他检测参数。

还可进一步表征该检测方法，以证明基于药物作用机制，荧光标记药物可转运至相应的细胞区室。在本示例中，预期酶替代疗法药物（ERT）将结合细胞表面的CI-M6PR，并将其转运至溶酶体。我们此前报道过多个实验结果，表明本方法中观察到的几乎所有荧光信号均来源于溶酶体内的荧光标记ERT⁸。我们发现，用细胞松弛素B处理细胞后，荧光标记ERT的信号消失，而细胞松弛素B可通过抑制肌动蛋白重排来阻断内吞作用。此外，通过台盼蓝淬灭细胞外荧光或在4 °C条件下孵育细胞以减缓内吞过程的实验表明，荧光标记ERT可被迅速内化，仅有极少荧光来自结合于细胞表面的ERT。通过共聚焦显微镜观察pH敏感性溶酶体示踪染料与荧光标记药物的共定位，可确认药物向溶酶体的靶向性。还可使用外源性M6P与标记药物竞争受体结合，以验证CI-M6PR介导内吞的特异性。对于其他检测中的荧光标记药物，也应进行类似的实验，以验证其摄取动力学及细胞内定位。

该基于细胞的检测平台已被用于研究利用CI-M6PR受体介导的内吞作用的治疗性药物的中和抗体（NAbs）。我们近期报道了使用该检测平台的研究结果，表明elosulfase alfa的中和抗体（NAb）产生与药物疗效之间无相关性^36,37。为验证该检测方法在临床样本检测中的适用性，应根据既定的指导原则^3,4评估其各项参数，包括检测灵敏度、精密度、选择性、特异性、药物耐受性、稳健性以及临界值。此外需注意，对于溶酶体酶替代疗法（ERT），可能产生中和抗体（NAbs），其通过结合于酶催化位点附近而潜在干扰药物活性。通常情况下，我们认为监测此类中和抗体的优先级较低，因为溶酶体内部严苛的酸性及蛋白水解环境不利于抗体与ERT之间的相互作用^2,39,40。然而，可能存在具有抗蛋白水解能力的中和抗体，并抑制药物的催化功能⁴⁰。本检测方法通过监测荧光标记的ERT被摄取至溶酶体的过程进行评估，其局限性在于无法检测抗蛋白水解的中和抗体。若基于安全性或疗效数据怀疑存在此类中和抗体，则应开发并采用可监测ERT活性的检测方法对样本进行检测。

免疫原性评估对于理解中和抗体对药物安全性和有效性的影响至关重要。识别能够抑制 体外 药物摄取 通过 CI-M6PR 为理解中和抗体活性提供了机会 体内本方法利用表达CI-M6PR的人源细胞系，检测荧光标记的溶酶体酶替代疗法（ERT）药物在细胞摄取过程中的干扰作用。该方法已用于监测多种用于治疗溶酶体贮积症的ERT药物中的中和抗体（NAbs）。该检测平台也可适用于其他研究中和抗体对需细胞内化才能发挥功能的生物治疗药物影响的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜装置，500 mL 真空滤瓶	康宁	CLS430769
圆底96孔培养板	Thermo-Nunclon	163320
无菌试剂储液槽	VistaLab	3054-1004
96孔白色圆底聚苯乙烯微孔板	康宁	3605
96孔聚丙烯管，8管条	康宁	4408
磁珠分离器试管架	V&P Scientific, Inc	VP 772F2M-1、VP 772F2R-2、VP 772F2R-3
DynaMag-2 磁力架	赛默飞世尔科技	12321D
DynaMag -96 侧边带裙边磁铁	赛默飞世尔科技	12027
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD 生物科学
BD 高通量采样器（HTS）	BD 生物科学
BioRad TC20 自动细胞计数仪	伯乐（BioRad）	1450103
微孔板振荡器	VWR	12620-928
Galaxy MiniStar 微型离心机	VWR	C1413
组织培养 CO2 培养箱	Nuaire	NU-4750
生物安全柜	Labcono	Purifier Cell Logic +
Jurkat细胞系	ATCC	TIB152™
Alexa Fluor 647 蛋白质标记试剂盒	赛默飞世尔科技	A20173
Dynabeads M270 链霉亲和素	赛默飞世尔科技	65306
EZ-Link NHS-LC-LC-生物素	赛默飞世尔科技	21343
RPMI-1640 1x 培养基	Life Technologies	A10491-01-500mL
胎牛血清（FBS）	ATCC	30-2020
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）	康宁	30-002-CI
不含钙和镁的1x DPBS	康宁	21-031-CV
4% 甲醛	电子显微镜科学	15735-85
LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒（适用于405 nm激发）	Life Technologies	L34955
Tween 20	Sigma	P1379-100mL
牛血清白蛋白	Sigma	3059
混合人源基质例如 人血清或脑脊液	Bioreclamation IVT	从网站请求报价
VWR 聚酯板膜	VWR	60941
密封 &铝箔样品	贝克曼库尔特	538619