本文介绍了一种利用抗体芯片检测多种细胞模型中信号通路变化的实验方案。这些变化可由药物、缺氧、紫外光、辐射，或基因过表达、表达下调、基因敲除等因素引起，在多种疾病模型中具有重要意义，有助于判断某种疗法是否有效，或揭示药物耐药的潜在机制。
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摘要
摘要
蛋白质磷酸化网络调控异常的癌症患者通常采用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗，治疗反应率可达85%左右。然而，患者常因信号转导通路的改变而对治疗产生耐药性。基因表达谱芯片技术可用于检测整体mRNA水平的变化，蛋白质组学可检测蛋白质表达水平的整体变化或鉴定相关蛋白，但信号转导通路的活性只能通过检测蛋白质的翻译后修饰来确定。因此，能否准确判断药物治疗是否有效、是否出现耐药性，或能否全面表征信号通路中的任何改变，是当前临床面临的重要挑战。本文详细介绍了抗体芯片作为一种可检测多种翻译后修饰（例如，磷酸化）全局变化的工具。使用抗体芯片的优势之一在于其易用性（无需蛋白质组学专家或昂贵设备）和检测速度快。目前主要的局限性在于针对多种翻译后修饰组合的芯片种类有限。此外，无偏倚的方法（如磷酸化蛋白质组学）可能更适用于新靶点的发现，而抗体芯片则更适合已知且研究较为充分的靶点检测。
引言
靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的临床应用通过为医生提供有效工具以靶向驱动肿瘤发生转化的特定蛋白，彻底改变了癌症治疗模式。这些化合物可抑制或阻断酪氨酸激酶所靶向蛋白的磷酸化过程1,2. 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的开发部分源于多种关键信号通路基因的遗传改变足以驱动癌症的发生和进展[例如表皮生长因子受体（EGFR）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、BCR-ABL和人表皮生长因子受体2（HER2）3,4酪氨酸激酶抑制剂对细胞周期的影响5 以及分子信号通路6 代表了从非靶向治疗向分子指导的癌症治疗的转变。TKIs 的主要优势在于 与 化疗的优势在于提高应答率并降低对健康细胞的毒性风险7因此，针对新型酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的研究与开发日益受到关注。
基因组测序结果的获取始于人类基因组计划8,9,10 并延续至今，开展了多种下一代（NextGen）癌症测序研究[例如，癌症基因组图谱（TCGA）11,12]。这激发了许多实验方法的发展，这些方法能够同时提供数千个基因的信息，和/或无偏倚地捕捉在生物扰动下基因或蛋白质的调控状态13由于细胞功能的调控发生在多个层次，从基因转录到蛋白质的翻译后修饰及其活性调节，因此要全面理解控制细胞功能的事件，最终需要整合来自多种生物学检测手段的数据。单细胞分辨率下同时监测数千个基因信使RNA（mRNA）水平的技术能力，提升了在全基因组范围内推断基因功能及其相互作用的能力。然而，若不整合其他调控层面的数据——即蛋白质表达水平、蛋白质修饰状态以及蛋白质的翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、甲基化）——对基因表达芯片结果的解读将始终存在固有的局限性。 等等。在此，我们描述了抗体芯片作为一种在单次实验中，根据多种条件检测重要信号通路组分翻译后修饰情况的实用方法。14,15,16.
磷酸化抗体芯片可用于区分和分析信号转导通路中的变化16。这些变化可能源于基因修饰，或使用激酶抑制剂、化疗药物处理细胞系，或由葡萄糖剥夺、缺氧或血清饥饿引起的应激。值得注意的是，药物耐药性或特定基因的上调或下调也可能导致信号转导通路的变化17。
例如，药物靶点发生突变可导致药物敏感性降低，从而产生耐药性。在肺癌中，已知的EGFR突变会使肿瘤对某些酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）不敏感，但对其他TKIs更为敏感。突变还可能激活替代性信号通路17作为一种更广泛的应用，可用于鉴定参与耐药性和缺氧过程中的信号转导通路， 等等。磷酸化抗体芯片可提供更深入的洞察，从而更好地理解相关机制。
允许评估蛋白质修饰的技术是系统生物学的重要组成部分，因为这些修饰通常具有调控功能，例如调节酶的活性或蛋白质之间的物理相互作用。蛋白质磷酸化在几乎所有由胞外信号触发的信号转导通路中均发挥关键作用，这充分体现了翻译后修饰的重要性18传统上，激酶的鉴定或蛋白质磷酸化状态的检测也可通过蛋白质印迹（Western blot）分析实现，特别是当研究者仅关注1–5个靶标时。然而，Western blot特异性较高，且易受先验知识的限制，可能导致重要靶标的遗漏。抗体芯片可提供中等通量的多靶标检测，其原理是固定多种捕获抗体（如广谱性磷酸化酪氨酸抗体、抗泛素抗体等）， 等。] 在固体基质上（例如，玻璃或硝酸纤维素）。在基于夹心法的ELISA中，二抗可提供有关特定蛋白质的信息（图1）。随着研究目标的增多或先验知识的局限，该检测方法将变得更加有力且相关。15磷酸化阵列的应用范围更广，因为它们可以在一次实验中比较多种靶蛋白的磷酸化水平及其总体蛋白量，并且在定量方面显著优于质谱分析。该技术不适用于鉴定新的或先前未知的磷酸化位点。
基于大规模质谱的蛋白质组学可用于鉴定蛋白质的特异性磷酸化位点19。尽管该技术能够列举数千种翻译后修饰事件，但它需要昂贵的仪器设备、专用的实验流程以及计算分析方面的专业知识，而这些条件超出了大多数研究人员的能力范围。
抗体芯片可同时检测多种蛋白质的表达水平16这些可能包括蛋白质的泛素化（泛素阵列）或磷酸化变化。该阵列技术的关键优势在于能够同时提供有关多种重要细胞参数相关生物通路生物学状态的重要反馈信息（如53 kDa蛋白质p53、受体酪氨酸激酶及细胞内信号通路）。此外，还可结合不同类型的阵列以提高检测的覆盖深度例如，细胞凋亡、泛素化和磷酸化）。这种能够同时检测多个样本中多种翻译后修饰的能力，使得抗体芯片在无需特殊仪器或专业技术的情况下，以一种省时且经济高效的方式整合多个阵列，具有显著优势。
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方案
1. 蛋白质提取
- 接种 5 × 10⁵6 在组织培养罩内，将细胞接种于10 mm组织培养皿（或培养瓶）中。使用自动细胞计数器或血细胞计数板在铺板时对细胞进行计数。也可估算细胞数量。
- 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）将 10 mm 培养板（或培养瓶）上的细胞充分冲洗 3 次。加入裂解缓冲液前，务必彻底去除所有 PBS。
注意：裂解缓冲液通常随试剂盒提供。若无，则使用放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA）或其他含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液。 - 裂解 1 × 107 细胞/mL，通过加入适量裂解缓冲液，并用细胞刮刀将细胞刮入裂解缓冲液中。例如，对于HeLa细胞和MiaPaCa-2细胞，每10 cm培养皿使用600 µL。
- 用移液器将裂解液上下吹打约10次，转移至新的1.5 mL离心管中。
- 在 4 °C 条件下孵育裂解液 30 分钟，建议置于摇床或振荡器上进行。使用 27 G 针头将裂解液反复推过注射器 10 次，以充分破坏细胞膜。也可采用超声处理裂解液。将裂解液储存于 -20 °C 或立即使用。
- 以 14,000 x g 离心裂解液 g 4 °C 下离心 15 分钟，将上清液转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。
- 采用二辛可宁酸法（BCA）测定总蛋白含量20 或使用Lowry、Bradford等等效方法测定，继续使用至少50–400 μg蛋白。蛋白质应立即使用，或分装后于-70 °C冷冻保存（避免反复冻融）。
2. 人类磷酸化激酶阵列
- 开始实验前将所有试剂平衡至室温（约 1 小时）。
注意：所有试剂和塑料耗材均包含在试剂盒中。 - 根据制造商说明书，在开始实验前新鲜配制所有试剂（阵列缓冲液）（根据所选靶标/阵列的不同，说明可能略有差异）。
- 用 100 μL 去离子水重悬检测抗体混合液，或根据所提供 1.5 mL 离心管的不同，遵循制造商的说明操作。
- 将 40 mL 的 25x 洗涤缓冲液加入 960 mL 去离子水中，稀释成 1x 洗涤缓冲液，并通过倒置混匀。
注意：晶体在室温下会溶解。缓冲液可能随时间变黄，但仍可正常使用。 - 用移液器将 1 mL 阵列缓冲液 1 加入 8 孔多联板的每个孔中（或在 4 孔多联板中加入 2 mL）。
- 使用平头镊子从保护膜之间取出阵列膜，并将其放入孔中，确保膜上的编号朝上。
注意：膜浸入后，膜上的染料将消失。 - 用盖子盖好板，置于摇床上，室温孵育 60 分钟。
注意：此为膜封闭步骤。 - 在孵育期间，准备蛋白样品。加入 50–100 μg 总蛋白。用裂解缓冲液将裂解物稀释至终体积 1 mL，裂解物体积最多为 334 μL。
注意：通常 50–100 μg 总蛋白已足够。 - 小心吸去阵列缓冲液 1，将膜与 1 mL 样品在摇床上于 2–8 °C 孵育过夜。
注意：请勿触碰或刮伤膜表面。 - 次日，小心取出每张阵列膜，放入单独的塑料容器（约 8 x 11 cm2）中，每容器加入 20 mL 1x 洗涤缓冲液。在摇床上用 1x 洗涤缓冲液于室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 从步骤 2.3 中取 20 μL 重悬的抗体混合液，加入 1 mL 1x 阵列缓冲液 2 中。将 1 mL 此溶液加入每个待使用的 8 孔中。
- 小心从洗涤板中取出膜，用纸巾轻压膜的下边缘以吸去多余洗涤缓冲液，然后将其转移回含有抗体混合液的板中。盖上盖子，在摇床上室温孵育 2 小时。用 dH2O 彻底冲洗使用过的板，并晾干以备后续使用。
- 小心取出每张阵列膜，放回洁净的单独塑料容器（约 8 x 11 cm2）中，每容器加入 20 mL 1x 洗涤缓冲液。在摇床上用洗涤缓冲液于室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 在 15 mL 离心管中，将试剂盒提供的 Streptavidin-HRP 或链霉亲和素-荧光染料（用于更定量的检测）用 1x 阵列缓冲液 2 按 1:1,000 比例稀释。
- 将膜放回含有 HP 溶液的 8 孔板中，在摇床上室温孵育 30 分钟（若使用荧光检测，需用铝箔包裹板以避免光照）。
- 将膜夹在两片 5 mm 厚的 3 M 滤纸之间，以去除多余缓冲液。如需使用 X 射线胶片或化学发光成像仪成像，将干燥的膜与 HRP 检测试剂（将两种化学发光试剂按 1:1 混合）孵育 3 分钟，然后将膜放入透明塑料文件袋中。
注意：干燥的膜也可用于荧光成像仪检测荧光信号；成像前应尽量减少光照。对 X 射线胶片或成像仪图像进行定量时，应避免过度曝光。大多数化学发光/荧光成像仪具有防止信号饱和的功能。
3. 数据分析
- 下载ImageJ，一种图像处理程序21，并安装该软件。
- 通过双击 “ImageJ图标” 打开ImageJ。在菜单栏中点击 “文件” ，然后从下拉菜单中选择 “打开” ，浏览计算机文件以找到目标图像。点击该文件将其打开。
- 为进行分析，将图像反转（将白底黑点转换为黑底白点）：在菜单栏中点击 “编辑” ，然后从下拉菜单中选择 “反转”。
- 从工具栏中选择“椭圆图标”（ImageJ工具栏中的第二个选项）。通过在图像上点击（黑色十字）并移动鼠标来绘制一个圆形或椭圆形。调整圆形或椭圆形的大小和形状，使其包围点印迹上的斑点。
- 在菜单栏中点击 “分析” ，然后从下拉菜单中选择 “测量”，系统将自动打开一个新窗口，显示所选区域的数值（面积、平均值、最小值和最大值）。
- 通过从圆心拖动圆圈（将箭头光标置于正中心）移动圆形区域，并将其放置在下一个待测（斑点）区域周围。测量所有感兴趣的斑点、阳性对照、阴性对照以及用于分析的背景区域。
注意：阴性对照为PBS，背景是指膜上无任何斑点的区域（任意空白区域均可），阳性对照是由制造商提供的对照样本。 - 选择PBS阴性对照斑点，并从每个斑点的测量值中减去该对照值。对代表每个受体酪氨酸激酶（RTK）的重复斑点对的强度取平均值。每个平均强度可与对照比较，用于计算变化倍数。
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结果
为研究酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药性对细胞系中信号转导通路的影响，共分析了四个样本。一个对照样本（H3255r1）和三个TKI耐药细胞系（H3255r2-4）（图2）与点抗体模板相关（图3）。所有4个样本均采用本方案进行制备。从中选取了6种具有差异性活性的磷酸化蛋白，用于展示抗体芯片的分析结果（图4）。热图（图5）对关键信号转导蛋白的磷酸化水平变化提供了半定量的读数。芯片结果的验证可通过正交方法（如蛋白质印迹法）完成。
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讨论
将多种生物学检测指标相结合的方法能够更准确地反映实验中细胞机制的真实状态。磷酸化抗体芯片的出现使得研究人员能够快速表征蛋白质修饰模式，这种整体性信息往往比单一蛋白的修饰状态更具提示意义。磷酸化抗体芯片应用的一般工作流程基于丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位点的磷酸化修饰。本示例聚焦于表征肺癌治疗耐药性相关的变化。该应用的主要理论依据在于，蛋白质磷酸化在多种人类癌症的信号转导过程中发挥着核心作用。18，且该方法可推广至其他系统。癌症中磷酸化的失调通常涉及酪氨酸激酶的过度活化，因此其磷酸化底物（常包括自磷酸化的激酶本身）水平高于正常生理状态，相应地，在癌细胞的磷蛋白中可占据显著比例。这种磷酸化水平的升高将更有利于检测。此外，蛋白质磷酸化具有医学意义，因为异常的酪氨酸磷酸化是多种癌症的标志性特征。23此外，由于该技术可应用于研究其他涉及磷酸化的生物系统，因此文中描述的许多特征可轻松调整，以适用于其他类型的蛋白质阵列（如泛素、凋亡等）。 等等。).
磷酸化抗体芯片广泛用于鉴定所涉及的任何...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢南加州大学劳伦斯·J·埃利森转化医学研究所（向大卫·阿古斯的捐赠）提供的慷慨资金支持。我们感谢奥特姆·比默和丽莎·弗拉什纳的支持，他们的帮助促成了本手稿的撰写与发表。我们感谢劳拉·吴在行政事务方面的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Odysee SA 成像仪 | Li-Cor 生物科学 | 荧光成像仪 | |
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 22363212 | |
| 细胞刮刀 | Falkon（康宁） | 353085 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS） | 康宁 | 21-031-CV | 蛋白提取洗涤缓冲液 |
| 组织培养皿 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC 胰岛素注射器 U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8 1 mL用于蛋白质样品的针头处理 |
| 蛋白谱阵列 | R&研发 | ARY003B | 人类磷酸化 MAPK 芯片 |
| 蛋白质谱阵列 | R&研发 | ARY002B | 人类磷酸化激酶阵列 |
| Eppendorf 5430R 离心机 | Eppendorf | 台式离心机 | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | 用于蛋白质定量的吸光度读数仪 | |
| IRDye 800CW 链霉亲和素 | Li-Cor 生物科学 | 925-32230 | 用于荧光检测的链霉亲和素偶联物 |
| LabGard ES II 级，A2 型生物安全柜 | NuAire | NU-425-400 | 组织培养罩 |
| TC20 自动细胞计数仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 1450102 | 细胞计数仪 |
| 蛋白酶抑制剂 &磷酸酶抑制剂混合物（100倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技 | 78446 | |
| RIPA缓冲液 | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | 超声波破碎仪 |
| 摇床平台振荡器 | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院开源 | https://imagej.net/欢迎 | |
| SAS Institute JMP® 12.1.0（64位） | 微软 |
参考文献
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