跑轮：用于轻度诱导黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）间歇训练的实验方案

摘要

TreadWheel 利用果蝇天生的负向地性，通过旋转运动温和地诱导成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行运动。该装置可用于分析运动与基因型、性别和饮食等因素之间的相互作用，及其对评估代谢健康的生理和分子检测指标的影响。

摘要

由于普遍向高热量摄入和低活动水平的生活方式转变，复杂的代谢性疾病发病率不断上升。这些多因素疾病是由遗传、环境和行为因素共同作用而产生的。其中一种复杂的疾病是代谢综合征（MetS），它是一组代谢紊乱的集合，包括高血压、高血糖和腹部肥胖。医生推荐的主要治疗方法是运动和饮食干预，以减轻肥胖及其继发的代谢性疾病。特别是有氧间歇训练，能够对2型糖尿病（T2DM）、心血管疾病（CVD）及其他疾病的常见风险因素产生有益影响。随着越来越多证据揭示运动对代谢健康的治疗作用，在受控条件下建立一个模拟运动的系统，为在实验环境中评估运动效果提供了有价值的工具。Drosophila melanogaster 是研究运动干预所导致生理和分子变化的理想工具。果蝇寿命短，且在营养代谢机制方面与人类具有相似性。为了在 Drosophila 中诱导运动，我们开发了一种名为TreadWheel的装置，该装置利用果蝇天生的负向趋地性，温和地诱导其攀爬行为。这使得研究人员能够在大量遗传背景各异的果蝇群体中开展实验，从而更深入地理解基因型与环境交互作用在运动对代谢健康影响中的机制。

引言

儿童和成人肥胖在高热量饮食且长期久坐的文化中正成为日益严重的流行病，可能导致严重的长期后果，包括胰岛素抵抗、慢性炎症和骨关节炎^1,2,3,4。由于脂肪和糖类摄入量增加以及以久坐为主的生活方式，热量摄入与消耗之间的失衡不断加剧，导致这些疾病的发生率持续上升⁵。相应地，这种能量失衡已导致2型糖尿病（T2DM）和心血管疾病（CVD）病例增多⁵。如果个体已被诊断患有代谢综合征（MetS），其发展为上述两种疾病的风险更高，而MetS的症状包括腹部肥胖和血脂异常²。MetS由基因型与多种环境因素（如饮食和运动）之间的复杂相互作用所决定⁶。因此，要全面理解这一复杂疾病的潜在机制，必须综合考虑所有这些因素。

在应对代谢综合征（MetS）时，医生首先建议进行生活方式干预，包括健康且均衡的饮食以及规律的身体活动^2,7,8。由于有效的药物治疗手段有限，而胃旁路手术费用高昂且需要终身医学监测，因此药物和手术干预仅推荐用于严重病例，并且必须与上述生活方式干预联合实施^3,7,8。尽管运动和饮食控制等生活方式干预措施能够实现并维持长期减重目标，但这些纠正措施是否足以完全改善与代谢综合征相关的不良影响，仍有待进一步研究^7,8。

多年来，小鼠模型已被用于研究运动对代谢性疾病的影响；然而，将运动引入果蝇代谢综合征（MetS）研究则是一项相对较新的工作。^9,10,11,12果蝇是研究运动的理想模式生物，因为它们易于操作、寿命短、饲养成本低，且与人类高度保守的能量相关代谢通路在果蝇中同样存在。 黑腹果蝇 和人类¹³. D. melanogaster 基因组特征明确，且有丰富的遗传学工具可供使用 果蝇 能够揭示各种基因型以及基因型与环境的相互作用，这些因素可能调节运动对机体健康的影响¹⁴.

当前的锻炼方法 果蝇 利用果蝇天生的负向趋地性行为本能，即向上攀爬的倾向，刺激其成虫在饲养容器内进行攀爬活动^11,12,15动力塔是一种用于刺激果蝇运动的方法，它通过系统地将果蝇培养管垂直抬升后迅速回落至实验台面，使果蝇被震落到离心管底部，从而激发其本能的负向趋地性。^12,16使用该设备开展的实验表明，运动是预防多种年龄相关疾病（包括心血管疾病和2型糖尿病）的强大保护因素，并有助于促进健康衰老^12,17,18具体而言，他们证明了运动可以延缓果蝇与年龄相关的运动能力下降，并改善多种与年龄相关的症状，如心脏功能和应激反应^17,18然而，从未被放置在塔上的对照组果蝇的攀爬得分高于经历过该装置的果蝇，提示重复下落产生的力可能对果蝇造成损伤并影响其运动能力¹²这表明，采用一种较为温和、避免造成身体创伤的替代性运动诱导方法，将是功率塔实验方案的一种有益补充方法。¹⁶.

轻度诱导运动 果蝇， 我们开发了一种名为TreadWheel的锻炼设备（图1). TreadWheel（以下简称TW）的旋转运动通过不断重新定义小瓶中的重力方向顶端，激发果蝇天生的负向趋地性行为，从而刺激果蝇向上攀爬。与其他方法不同，TW的旋转运动本质上较为温和，可最大限度减少可能产生并影响实验结果的额外应激因素。因此，该设备能够在不引发应激反应的前提下，对大量果蝇实施运动干预，使研究人员得以研究运动对代谢健康的影响。图2）、衰老、睡眠及许多其他主题¹¹.

本方法采用倒金字塔式的间歇训练方案，主要结合了有氧间歇训练（AIT）的特点，并融入部分耐力训练内容。与标准的AIT方案不同，本方案在五天内逐步延长每次间歇的持续时间，以促进耐力提升。相较于其他干预方法，AIT在预防代谢综合征（MetS）方面尤为有效，且在逆转代谢综合征常见危险因素方面优于持续性中等强度运动^19，20。然而，与Power Tower相比，TW的一个缺点是果蝇对旋转运动更快产生习惯化，因此果蝇在习惯化先天倾向上的个体差异可能会影响对运动益处的解读。¹¹ 针对此局限性，Watanabe和Riddle¹⁵及其配套文章²¹提出了一种精巧的解决方案。

方案

1. 跑轮装置的设置与操作

注意：TW 训练设备构造的示意图参见补充图1。所需材料列于材料表中。在本方案中，术语 "TW"、"TreadWheel"、"exercise machine" 和 "machine" 可互换使用。

1. 使用电源开关校准电机，使完整旋转一圈的时间为 15 秒（4 转/分钟）。在将果蝇管放入固定于旋转臂的夹具之前，需先校准仪器的旋转速度。
   1. 使用标准秒表和临时固定在仪器上的静止物体（例如，将一把小油漆刷用胶带固定在电机盖上，使刷毛刚好接触其中一个旋转支架）来调节速度。以该静止物体为参考点，计时一分钟内的旋转圈数，并调节速度以达到每 15 秒一圈的旋转周期（4 转/分钟）。

2. 果蝇的采集与保种

注意：所有果蝇在以下台面操作的间隙均饲养于25 °C、50%湿度、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中。除非另有说明，果蝇均饲喂标准的玉米粉-糖蜜实验室饲料。

1. 使用苹果汁琼脂平板、每板一滴酵母糊以及6盎司塑料瓶，为每种目标基因型准备产卵室，用于收集将孵化为幼虫的卵。
   1. 制备苹果汁琼脂平板时，将3%琼脂溶解于市售苹果汁中，注入35 mm × 10 mm的培养皿至¾满。琼脂凝固后，将平板储存于冰箱中备用。
   2. 在50 mL锥形离心管中，按每克酵母加入2 mL蒸馏水的比例，将市售活性干酵母与蒸馏水混合。使用玻璃搅拌棒将酵母与水混合，制成类似番茄酱稠度的糊状物。根据需要调整酵母和水的比例，以达到所需稠度。
   3. 酵母糊在不使用时应储存于冰箱中。管盖应保持松动，以便释放气体。
   4. 使用锋利的针或刀具在6盎司方形底瓶（聚丙烯材质）上打若干小孔，作为产卵室的通风孔。
   5. 在每块苹果汁琼脂平板上轻点一小滴酵母糊（直径约3 mm）。
2. 将目标基因型的成虫放入6盎司塑料瓶中，并用苹果汁琼脂平板封口，用橡皮筋固定平板与瓶口。倒置后放入培养箱，使成虫产卵。
3. 每天更换产卵室中的苹果汁琼脂平板两次（上午和傍晚）。将使用过的平板继续留在培养箱中12–24小时，以使一龄幼虫完成孵化。
4. 使用细毛笔或收集针（连接在手柄上的柔性细针）收集一龄幼虫。将50只特定基因型的一龄幼虫转移至装有目标实验食物的培养管中，在培养箱内饲养，使其发育并完成变态过程（图2A）。
5. 收集成虫用于运动处理（图2A）。
   1. 在化蛹后，使用湿润的小毛笔收集蛹，并将其转移至空的培养管中，以防止成虫羽化后接触幼虫期食物。
   2. 成虫羽化后，立即将其转移至装有标准实验室饲料的培养管中。羽化后1至5天内按性别分离果蝇。
6. 将收集的成虫平均分配至实验组和对照组。每管饲养50只果蝇，维持在标准实验室饲料培养管中。
7. 每两天将成虫转移至新鲜食物培养管，以防止其在运动过程中被困住。在引入果蝇前，立即在新食物中添加数粒补充的活酵母。
   注意：虽然可以在不添加活酵母的情况下维持果蝇生长，但我们发现添加活酵母时成虫表现最佳。活酵母补充是一个可根据研究人员实验目的进行调整的变量。

3. 运动方案

1. 在运动的第一天（第1天），推动小瓶塞，使对照组小瓶中留出1 cm的空间，运动组小瓶中食物与塞子之间留出6 cm的空间（图1C).
   注意：对照管在运动装置上时，果蝇活动空间有限，因此其活动量将远少于运动管中的果蝇。
2. 将小瓶放入夹子中，然后让果蝇在仪器上适应 10 分钟（图1B).
   注意：另一种对照方法是将未进行锻炼的果蝇放置在运动装置旁边的实验台面上，使其在瓶内有6 cm的空间以正常活动。相对于这两种对照，运动效果相似。 "1 厘米在跑轮上" 和 "6 cm 在台面上" 对照组已被发现¹¹.
3. 将对照组和运动组果蝇置于机器上，在恒定室温下每周连续处理5天，每次交替进行旋转与休息的周期图1D）。
   注意：需要保持恒定温度，以避免温度对活动水平产生混杂效应。对于温度操控研究，将TW置于培养箱内，以在运动训练期间调节温度处理条件。
   1. 第1天进行4次运动，每次运动15分钟，每次运动之间间隔5分钟休息。
   2. 接下来的每一天，将其中一次既有的运动时段延长5分钟。例如，在第2天，将第一次运动时段延长至20分钟，其余运动时段仍维持15分钟。
   3. 第3天，果蝇在前两轮运动中每轮运动20分钟，后两轮每轮运动15分钟。
   4. 第4天，除最后一次运动持续15分钟外，其余每次运动均持续20分钟。
   5. 第5天，所有运动组的运动时长均保持为20分钟。
      注意：在休息期间，装有果蝇的瓶子应牢固地夹在TW上。此期间瓶子的方向无关紧要，因为所有果蝇所受的重力方向均相同。
4. 完成当天的运动干预后，将食物瓶塞恢复至正常位置，并将果蝇放回培养箱中，直至次日。
5. 完成全部训练方案后，使用标准果蝇 CO₂ 麻醉法麻醉果蝇₂ 麻醉方法。然后将果蝇转移至新的食物培养管或微量离心管中，以评估目标表型特征。
   注意：示例表型包括攀爬能力（食物瓶）、甘油三酯储存（微量离心管）或基因表达（微量离心管）。根据后续检测类型，样本可在此处暂停处理并妥善保存。涉及活体果蝇的检测需根据表型分析的具体目标及时进行。

4. 攀爬能力评估

1. 完成运动方案后，经过一天休息，使用快速迭代负趋地性（RING）类似的负趋地性攀爬实验检测果蝇的一般攀爬能力²²。
   1. 使用 CO₂ 麻醉将每组 10 只果蝇放入空的培养瓶中（或如果已经分选好，可直接从食物瓶中轻敲转移），并用石蜡膜密封以防止果蝇逃逸。让果蝇至少适应新培养瓶环境 10 分钟。为防止培养瓶倾倒，可在瓶底粘贴一个直径约 5 cm 的卡纸圆片以增加支撑面积。
      注意：不应使用培养瓶塞，因其会遮挡用于判断攀爬高度的瓶身部分。
   2. 将培养瓶置于距离 1 cm × 1 cm 网格 20 cm 的位置，并确保其完全处于固定静止相机（带内置计时器）的拍摄视野中（使用带计时拍摄功能的智能手机效果良好）。
   3. 轻轻将培养瓶在实验台面上敲击三次，使所有果蝇跌落至瓶底。第三次敲击后，立即启动 4 秒相机计时器以拍摄图像，用于确定每只果蝇的攀爬高度。
      注意：每次敲击应保持一致的力度，并由同一名研究人员操作，以尽量减少因敲击差异导致果蝇反应的变异。
   4. 重复步骤 4.1.3 两次，每次试验之间至少休息 1 分钟，每瓶共完成三次试验。
2. 为保留果蝇用于其他分析，在完成攀爬实验后立即将其浸入液氮中进行速冻。
   1. 使用一个浅口、敞口的杜瓦瓶，装入深度约 5 cm 的液氮。
   2. 使用 CO₂ 麻醉将果蝇转移至小型微量离心管中，然后将离心管放入盛有液氮的杜瓦瓶中。或者，若后续分析需避免使用 CO₂，可将果蝇所在的攀爬瓶底部浸入液氮中，轻轻敲击使果蝇落至瓶底，直接在瓶内速冻，随后用镊子将冷冻的果蝇转移至微量离心管中。
      注意：液氮为低温物质，使用时必须配备适当的个人防护装备并确保室内通风良好。
3. 使用 ImageJ²³ 多点选择工具处理图像。
   1. 在 ImageJ 中打开待处理的图像。
   2. 根据背景网格纸设置 1 cm 的标尺，以计算每只果蝇的攀爬距离。从工具栏中选择 "直线工具"，沿背景网格纸上一个 1 cm² 方格的一边进行描画。点击 "分析"选项卡，选择 "设置标尺"。将 "已知距离"设为“1.00”，"长度单位"设为“cm”，确保 "全局"未勾选，然后点击 "确定"。
   3. 从工具栏中选择 "多点选择"图标，放大图像中培养瓶底部区域。通过点击培养瓶最底部的位置设置第一个点。
   4. 点击培养瓶中每只果蝇的中心位置，将其标记为数据点。注意每瓶共有 11 个点，其中一个标记培养瓶底部，其余每个点对应一只果蝇。
   5. 点击 "分析"选项卡，选择 "测量"，生成测量值表格。将表格另存为 csv 文件。
   6. 在电子表格程序中打开该 csv 文件，通过从第 2 至第 11 个点的 y 值中减去第 1 个点的 y 值，计算每只果蝇的确切攀爬距离。
   7. 对每张图像重复步骤 4.3.1 至 4.3.6。

5. 甘油三酯储存检测

注意：在整个检测过程中，所使用的样品、标准品、甘油标准溶液和三酰甘油工作溶液均应置于冰上，并在不使用时储存于冰箱中。

1. 使用甘油标准溶液制备标准品。
   1. 通过向标记为 B 的微量离心管中加入 1,000 µL 匀浆缓冲液，制备空白样（B）。
   2. 通过向标记为 S1 的微量离心管中加入 1,000 µL 甘油标准溶液，制备标准品 1（S1），每孔浓度为 2.5 mg/mL。
   3. 在标记为 S2 的微量离心管中，将 500 µL 甘油标准溶液与 500 µL 二水合水（diH₂O）混合，制备标准品 2（S2），每孔浓度为 1.25 mg/mL。
   4. 在标记为 S3 的微量离心管中，将 250 µL 甘油标准溶液与 750 µL 二水合水（diH₂O）混合，制备标准品 3（S3），每孔浓度为 0.625 mg/mL。
   5. 在标记为 S4 的微量离心管中，将 125 µL 甘油标准溶液与 875 µL 二水合水（diH20）混合，制备标准品 4（S4），每孔浓度为 0.3125 mg/mL。
2. 使用血清甘油三酯测定试剂盒制备甘油三酯工作液。
   1. 向试剂盒中的游离甘油试剂中加入 40 mL 二水合水（diH₂O），并通过倒置瓶身混合均匀。
   2. 向试剂盒中的甘油三酯溶液中加入 10 mL 二水合水（diH₂O），并通过倒置瓶身混合均匀。
   3. 将甘油试剂与甘油三酯溶液混合，并通过倒置瓶身混匀，以制备甘油三酯工作液。
      注意：甘油三酯工作液可稳定保存 60 天，每套试剂盒可按照以下方案完成四次 96 孔板检测。所用体积已根据官方血清甘油三酯测定试剂盒的说明按比例缩小，适用于 96 孔板格式。
3. 通过将每种标准品各 5 µL 小心地移取至 96 孔平底透明微孔板中（每个标准品设三个复孔，空白样设四个复孔），验证空白样和标准品。
   1. 向含有每种标准品的孔中准确加入 125 µL 甘油三酯工作液。让溶液反应 30 分钟。
   2. 将 96 孔板放入分光光度计中，在 540 nm 处读取吸光度。利用吸光度值绘制标准曲线，并通过评估 R² 值验证标准品的准确性。如果标准品的 R² 值低于 0.98，则需更仔细地重新制备标准品。
4. 使用各含 10 只冷冻果蝇的微量离心管，开始甘油三酯储存检测的第一天实验¹⁴。
   注意：此步骤中切勿使用重复加样器或多通道移液器，因为为了获得可重复的结果，每次加入试剂的量必须非常准确且一致。根据我们的经验，重复加样器和多通道移液器无法达到这种精度和一致性。使用单通道移液器时，实验人员可对每一份样品进行目视确认以进行质量控制，且任何单通道移液器特有的偏差对所有样品的影响程度相同。
   1. 通过将 0.272 g KH₂PO₄、400 µL 0.5 M EDTA 和 199.6 mL 二水合水（diH₂O）混合于玻璃瓶中，配制 200 mL 匀浆缓冲液储备液。
   2. 向 40 个含有爬行实验后冷冻成虫的微量离心管中，各准确加入 100 µL 匀浆缓冲液。然后在 18,000 g 条件下离心 30 秒。
   3. 使用电动研磨器和研杵（或其他组织匀浆方式）研磨果蝇，制备成乳白色溶液。确保每个样品使用新的研杵。然后在 18,000 g 条件下离心 2 分钟。
   4. 仅从每根管中吸取上清液顶部 75 µL 至新的微量离心管中，确保不转移沉淀中的果蝇残渣。将新管置于冰箱中过夜。
5. 从冰箱中取出第一天的样品，开始甘油三酯检测的第二天实验。
   注意：步骤 5.5 可与步骤 5.4 在同一天进行，但我们发现甘油三酯浓度信号在冰箱中过夜后更强。然而，步骤 5.4 与 5.5 之间的时间间隔不应超过 36 小时。
   1. （可选）将第一个含上清液的管涡旋振荡 10 秒，取 5 µL 移入干净的微量离心管中，再向该管中加入 95 µL 0.15 M NaCl。如需后续进行蛋白检测，可将这些子样品储存在 -20 °C 冰箱中。
      注意：这些添加了 NaCl 溶液的上清液样品可用于测定蛋白含量，具体方法由研究者自行选择。我们采用 Bradford 法²⁴。蛋白含量可用于标准化甘油三酯含量的测量，但研究者在解释这些比值时也应谨慎，因为运动和饮食也会影响蛋白储存水平。
   2. 对于原始上清液管，将第一个管涡旋振荡 10 秒，然后取 5 µL 分别加入 96 孔微孔板中的两个独立孔中，以生成技术重复。务必记录每个样品所用的孔位。对其他 39 个管重复此步骤。
   3. 向微孔板中四个孔各准确加入 5 µL 空白样，其余孔中各准确加入 5 µL 每种标准品，每个标准品设三个复孔。
   4. 向每个孔中准确加入 125 µL 甘油三酯工作液，让溶液反应 30 分钟。
   5. 将 96 孔板放入分光光度计中，在 540 nm 处读取吸光度。
   6. 利用由标准品计算得到的标准曲线，将吸光度值转换为浓度（mg/mL）。

结果

我们特别关注识别影响个体整体代谢健康的各种因素。先前研究发现，基因型与饮食的交互作用对代谢特征在群体水平上的变异具有显著贡献¹⁴。这意味着每种基因型对环境差异的响应均具有独特且复杂的模式。为了将我们关于基因型与环境效应的研究拓展至包括体力运动，我们开发了TreadWheel装置，该装置能够以高通量的方式使大量基因型个体接受有氧间歇训练（AIT）。

为了确定在 TW 上运动是否影响代谢特征，我们测量了常见野生型果蝇 Oregon-R (OreR) 和 y¹w¹ 的甘油三酯储存量（图 2B–C），并将这些数值根据果蝇的蛋白质浓度进行标准化，方法最初由 Mendez 等¹¹ 报道。我们采用多变量方差分析（MANOVA）对数据进行分析，考虑了基因型、性别、运动处理（及其交互作用）以及实验区组效应（如时间重复和食物瓶），发现基因型与运动之间存在显著的交互作用（p = 0.0017），影响甘油三酯的储存。雄性和雌性之间存在显著的性二态性效应，雄性储存的甘油三酯多于雌性（p < 0.0001）。我们观察到，在雌性中，运动组果蝇的甘油三酯水平显著低于未运动组（图 2B，p <0.0001）。在雄性中，尽管 Oregon-R 运动组果蝇的甘油三酯储存量相较于对照组有所下降，但差异无统计学意义；然而，在两个独立品系之间，甘油三酯储存量的差异具有统计学显著性（图 2C，p <0.0001）。需要注意的是，虽然将甘油三酯浓度相对于蛋白质浓度进行标准化有助于了解果蝇整体身体组成的比率，但比较不同组果蝇的直接甘油三酯或蛋白质浓度也能分别提供关于运动对这些表型影响的具体信息。

由于成虫运动、性别和基因型等变量已被证明会影响甘油三酯的储存，因此预期这些因素也会对其他表型产生影响，并与饮食相互作用。我们使用代表性的野生型 Drosophila 遗传参考群体品系（DGRP 153）²⁵，在高脂或正常饮食条件下培养其幼虫，并在成虫期诱导其运动一周（图 2A）。随后，我们进行类似 RING 的负向趋地性实验以检测其攀爬能力。所用攀爬实验与标准 RING 实验有所不同：实验中未使用 RING 装置，而是采用瓶口覆盖石蜡膜的试管来盛放果蝇。除这一改动外，原 RING 实验的其他方面，例如将果蝇轻敲至试管底部后到拍摄照片之间的时间间隔，均保持不变²²。

所有处理均独立重复三次，每次重复每种处理至少包含59只果蝇。数据采用多变量方差分析（MANOVA）进行分析，考虑了饮食、基因型、性别、运动处理（及其交互作用），以及时间重复、检测小瓶和小瓶检测重复等实验区组效应。我们发现，在高脂饮食条件下饲养的运动组雌性果蝇的攀爬高度显著高于其他雌性处理组（p <0.005）（图2D）。对于雄性果蝇，仅在正常饮食条件下运动可改善其攀爬能力；而在高脂饮食条件下饲养的雄性果蝇则未表现出显著变化（图2E）。我们还发现攀爬能力存在显著的性二型效应（p <0.0001），雄性攀爬高度高于雌性。令人意外的是，DGRP 153品系的雌性果蝇在摄取正常饮食后进行运动，其攀爬表现反而下降（图2D）（p <0.0001），这表明此类运动干预并非对所有基因型均产生一致的积极效果，可能依赖于其他环境因素。在Mendez et al.¹¹的研究中，另外四个遗传品系的雌性果蝇在正常饮食条件下饲养后接受运动训练，其攀爬能力均得到提升。这表明DGRP 153品系中观察到的反应具有基因型特异性，并非TW运动处理的普遍特性。不同性别、饮食和运动处理组之间的反应差异表明，性别、饮食与运动之间存在显著的交互作用，影响该品系果蝇的攀爬能力（p <0.0001）。

综上所述，实验结果表明，运动对成年果蝇代谢健康的影响可能取决于其性别、基因型以及幼虫期饮食。其他研究也观察到，基因型、环境因素（例如，饮食和运动）以及性别所引起的表型变异^11,12,14,15。因此，利用转轮（TW）与Drosophila果蝇相结合的方法，可成为阐明影响代谢健康的遗传与环境因素的有力策略。

图1：TreadWheel运动装置。（A）该装置可容纳48个样品管，具有可调节速度功能。本实验在4 rpm条件下进行。（B）装有实验果蝇的单个食物管被固定在连接于旋转轴的支架上。（C）运动组样品管中，瓶塞与食物之间的距离为6 cm，对照组为1 cm。随后将样品管放置于装置上进行运动处理。（D）采用为期5天的倒金字塔式运动方案对成年果蝇进行运动训练。每天在一次运动周期中增加5分钟，逐步提高运动强度，以模拟耐力和间歇性训练。本图经Mendez et al.¹¹修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：可视化方法与代表性结果。 (A检测幼虫饮食与成虫运动交互效应的方法。幼虫在高脂或正常实验室饮食条件下培养，并在羽化后转为正常食物饲养。成虫按性别分离，分入实验组并进行连续五天的运动训练。随后进行类似RING的负向趋地性攀爬实验，之后将果蝇冷冻以测定甘油三酯含量。图中展示了两个遗传品系（Oregon R 和 y）的代表性甘油三酯数据。¹w¹ 对于 (B）雌性与（C）雄性。所有果蝇均在正常饮食条件下培养，并在成年期进行运动。不同字母标注的组间差异显著（p <0.05）使用一个 事后 学生的 t-检验。该图包含 Mendez 报道的部分数据 等¹¹代表性攀爬数据展示了DGRP 153品系的（D）雌性与（E）雄性个体。每个数据点代表在三个独立时间点上至少232个个体的平均攀爬表现。误差条表示一个标准误。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：TreadWheel装置的详细示意图。（A）用于将小瓶固定在设备上的双小瓶夹具结构示意图。（B）设备旋转驱动系统的内部视图。（C）设备正面的平行投影图。请点击此处查看该图的放大版本。

补充代码文件：TreadWheel.skp 请点击此处下载该文件。

讨论

本文详述的运动方案已被证明可有效在Drosophila中诱导轻度运动，并可用于在受控的实验室条件下模拟耐力运动¹¹。需要注意的是，在最初开发TreadWheel概念时，我们曾考虑过改造现有的商用产品以实现类似功能（例如，实验室用旋转装置）。然而，我们最终放弃了这一方案，转而采用定制设计，原因是商用设备无法提供足够低的转速（4 rpm），且样品管容量不足，难以满足高通量样本制备的需求。

TW 协议本身可进行调整，以涵盖广泛的研究主题。例如，通过调整果蝇运动频率和持续时间，可以改变其接受的运动强度。若将该协议延长至一周以上或应用于其他年龄组，则有可能研究运动对衰老及各种年龄相关疾病的影响。我们建议，如果实施长期运动方案，每周至少应增加一天休息时间以利于恢复。已有研究表明，包含恢复日的运动方案在表现和进步方面优于连续每日运动的方案¹²。此外，我们建议避免将单次运动时长延长超过 30 分钟，因为在长时间连续运动后，果蝇可能对旋转运动产生适应性¹¹。我们还观察到果蝇在 TW 上维持活动水平的动机存在遗传差异¹¹。因此，如果需要更长的运动时段，建议监测果蝇的活动水平，如 Watanabe 和 Riddle^15,21 所述，他们对 TW 概念进行了改进。其他可变因素还包括温度和睡眠-觉醒模式，这些因素也被证明会影响果蝇的运动行为^26,27。

在实验方案进行过程中及完成后，可采用多种分析方法来研究运动在生理学、行为学和分子水平上的影响，并进一步揭示运动的表观遗传效应。此外，还可利用其他代谢检测方法（例如，葡萄糖、糖原和蛋白质测定）、心脏功能评估以及炎症反应测量，进一步探究运动对果蝇生理状态和身体组成的影响^12,14,24,28。与运动诱导相关的行为变化，如摄食行为、运动活动和睡眠模式的改变，也可通过CAFE实验²⁹或活动监测设备^12,15,30等工具进行测量。与运动相关的基因表达变化和细胞呼吸变化，也可通过qRT-PCR¹¹和呼吸测定法³¹等方法进行定量分析。最后，Drosophila拥有丰富的遗传资源，例如果蝇遗传参考面板2（Drosophila Genetics Reference Panel 2）和果蝇合成群体资源（Drosophila Synthetic Population Resource），为研究人员提供了开展数量遗传学研究的平台^25,32。这些工具可用于开展定位实验，如全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies）和数量性状位点定位（Quantitative Trait Loci mapping），以鉴定与运动和饮食相关的候选基因位点。

利用TreadWheel开展的研究表明，平均而言，运动可降低体重、总甘油三酯储存量和糖原含量，同时增加蛋白质含量及攀爬能力¹¹。此外，不同性别和基因型在体重、甘油三酯、蛋白质、糖原、葡萄糖以及活动水平方面对运动的反应存在差异^11,15。尽管不同基因型和性别对运动与饮食的反应差异可能难以解释，有时甚至与直觉相悖，但这恰恰反映了自然界种群中真实存在的生物学变异来源。在我们努力理解导致代谢综合征（MetS）高发率的多种潜在因素的过程中，通过在模式生物中检测这些因素，有助于厘清各因素相对作用的研究工具，将对我们开发个体化的预防和治疗干预措施至关重要。为了全面评估运动的有效性，在开展实验和得出结论时，必须综合考虑上述每一个因素及其相互作用。

与大多数其他果蝇运动装置一样，TW在量化果蝇运动方面存在局限性。最近，Watanabe和Riddle开发了旋转运动量化系统（Rotating Exercise Quantification System, REQS），该系统在TW结构基础上加装了来自果蝇监测系统系列的活动监测单元（LAM25H）^15,21。与TW类似，该系统利用旋转运动温和地诱导果蝇运动，并通过LAM25H组件追踪和量化果蝇活动，但其容纳的试管数量（32支）少于TW¹⁵。对于高通量的运动研究，如果无需或不希望进行活动量化，则TW可支持更大的样本量。此外，TW的设计也可在其现有形式基础上进行改进，以容纳更多试管。该系统连同其他现有的运动方法共同证实，运动不仅可在黑腹果蝇（Drosophila）中实现，还可用于研究体力活动对多种生理和分子反应的影响^11,12,15。因此，TW作为一种已被验证的诱导果蝇温和运动的方法，可用于探究多种生物学问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>TreadWheel 构建材料：
重型减震调平支架	McMaster-Carr	60855K71	数量：4
不锈钢滚珠轴承	McMaster-Carr	57155K306	数量：8
插件式电压互感器（500毫安，120伏交流输入，24伏交流输出）	McMaster-Carr	70235K16	数量：1
紧凑型方形直流齿轮电机	McMaster-Carr	6409K23	数量：1
工具架（夹具）	McMaster-Carr	1723A22	数量：5（10倍）
12L14碳钢高精度公差棒材	McMaster-Carr	5227T24	数量：1
紧定螺钉轴套	McMaster-Carr	6432K13	数量：8
圆带轮	McMaster-Carr	6284K51	数量：5
Dart Controls – 25 最大转速，交直流电动机	McMaster-Carr	13DV 1A	数量：1
<强>果蝇饲养与维护材料
6 盎司方形底瓶（聚丙烯）	Genesee Scientific	32-130	数量：1
35x10毫米培养皿	VWR	82050-536	数量：1
窄型果蝇培养管	Genesee Scientific	32-116	数量：1
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	数量：1
吹管，微型	Genesee Scientific	54-104	数量：1
<强>RING样实验所需材料：
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	https://imagej.nih.gov/ij/	数量：1
1 厘米方格纸或绘制的网格（至少 20 厘米 × 30 厘米）	各种		数量：1
带定时器的数码相机或带相机定时器应用程序的智能手机	各种		数量：1
<强>甘油三酯检测所需材料：
杜瓦瓶	VWR	14200-960	数量：1
血清甘油三酯测定试剂盒	Sigma Aldrich	TRO100	数量：1
无线研磨杵电机	VWR	47747-370	数量：1
研钵杵	VWR	47747-358	数量：1