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方法文章

用于电生理学研究硬骨鱼类垂体细胞的健康脑-垂体切片

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DOI：

10.3791/57790

⸱

2018年8月16日

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的制备具有活性的脑-垂体组织切片的实验方案，以辐鳍鱼纲鱼类青鳉（Oryzias latipes）为模型，随后采用穿孔膜片钳技术对垂体细胞进行膜片钳电生理记录。

摘要

已对多种脊椎动物的垂体细胞开展了电生理学研究，但在硬骨鱼类中的研究极为有限。在已有的研究中，绝大多数采用的是分离的原代细胞。为了增进对硬骨鱼类垂体细胞在更具生物学相关性的环境中行为特征的理解，本方案展示了如何利用小型淡水鱼类青鳉（Oryzias latipes）制备具有活性的脑-垂体组织切片。在制备脑-垂体切片时，所有溶液的pH值和渗透压均调整至与25至28 °C环境下生活的淡水鱼类体液相一致的水平。切片制备完成后，本方案进一步演示了如何采用穿孔式全细胞膜片钳技术进行电生理记录。膜片钳技术是一种功能强大的工具，具有前所未有的时间分辨率和灵敏度，可用于研究从完整全细胞到单个离子通道的电学特性。穿孔式膜片钳的独特之处在于能够保持细胞内环境的完整性，防止细胞质中的调控成分被膜片钳电极液稀释。相比之下，在进行传统全细胞记录时，观察到青鳉垂体细胞会迅速丧失产生动作电位的能力。在现有的多种穿孔技术中，本方案重点演示了如何使用抗真菌剂两性霉素B实现膜片膜的穿孔。

引言

垂体是位于下丘脑下方、视交叉后方的脊椎动物关键内分泌器官。它由特定的细胞类型产生并分泌六到八种激素。垂体激素在大脑与外周器官之间起中介作用，驱动包括生长、生殖以及稳态调节在内的一系列重要生理过程。与神经元类似，垂体的内分泌细胞具有电兴奋性，能够自发产生动作电位1。这些动作电位的作用取决于细胞类型。在哺乳动物垂体的多种细胞类型中，动作电位可使细胞内Ca2+浓度升高至足以维持激素的持续释放2。此外，垂体接收来自大脑的兴奋性和抑制性信号，这些信号影响细胞的膜电位3,4,5,6。通常，兴奋性输入会增加细胞的兴奋性，常涉及细胞内钙库释放Ca2+以及放电频率的增加 7。了解细胞如何利用离子通道组成并适应来自大脑的这些输入信号，是理解激素合成与释放机制的关键。

膜片钳技术由Sakmann和Neher于20世纪70年代末期建立8,9,10，并由Hamill进一步改进11，该技术可对细胞的电生理特性进行精细研究，直至单个离子通道水平。此外，该技术可用于同时研究电流和电压。目前，膜片钳技术已成为测量细胞电生理特性的金标准。已发展出四种主要的紧密封接式膜片钳构型11：细胞附着式、膜内翻式、膜外翻式和全细胞式膜片钳。前三种构型通常用于单个离子通道的研究。第四种构型即全细胞式，在完成细胞附着式构型后，通过施加低于大气压的压力在细胞膜上形成穿孔。该构型还可用于研究整个细胞的离子通道组成12。然而，该技术的一个局限性在于，细胞质分子会被膜片微电极内的灌流液稀释13（图1A），从而影响被研究细胞的电学和生理反应。事实上，这些分子中的一些可能在信号转导或不同离子通道的调控中发挥重要作用。为避免这一问题，Lindau和Fernandez14开发了一种方法，即在膜片微电极中加入成孔化合物。在形成细胞附着式构型后，该化合物会嵌入膜片下的质膜中，并逐渐穿孔，从而与细胞质建立电学接触（图1B）。可使用多种不同的抗真菌药物，如制霉菌素15和两性霉素B16，或表面活性剂如皂苷β-七叶皂苷17,18。这些化合物形成的孔道足够大，允许单价阳离子和Cl-在细胞质与膜片微电极之间扩散，同时保留细胞质中大分子和较大离子（如Ca2+ ）的浓度水平15,16。

使用穿孔膜片钳技术的难点在于可能产生较高的串联电阻。串联电阻（Rs）或通路电阻，是指相对于接地端，膜片电极尖端与细胞穿孔之间总的电阻。在膜片钳记录过程中，Rs 与细胞膜电阻（Rm）呈并联关系。Rm 与 Rs 的并联构成一个分压电路。当 Rs 较高时，电压将主要降落在 Rs 上，从而导致记录出现误差。记录的电流越大，该误差也越显著。此外，该分压效应还具有频率依赖性，会形成一个低通滤波器，从而影响时间分辨率。因此，穿孔膜片钳技术并不总能准确记录大而快速的电流，例如电压门控钠离子（Na+）电流（详细内容参见参考文献 19）。此外，在膜片钳记录过程中，Rs 可能发生变化，进而引起记录电流的改变。因此，在药物施加过程中若 Rs 发生变化，可能会导致假阳性结果的出现。

Andersen 实验室首次引入了对脑组织切片进行电生理学研究，以分析脑内神经元的电生理特性20。该技术为在更完整的环境中深入研究单个细胞以及细胞间通讯和细胞环路奠定了基础。Guérineau 等人于1998年提出了制备垂体切片的类似技术et al. 21。然而，直到2005年，脑-垂体切片制备技术才首次成功应用于硬骨鱼类的膜片钳研究22。在该研究中，作者还报道了穿孔膜片钳记录技术的应用。但迄今为止，绝大多数关于垂体细胞的电生理学研究仍集中在哺乳动物，仅少数涉及其他脊椎动物，包括硬骨鱼类1,2,22,23。在硬骨鱼类中，几乎所有研究均使用原代分离细胞进行24,25,26,27,28,29,30。

本文概述了一种优化的实验方案，用于从模式鱼类青鳉鱼制备健康的脑-垂体切片。与原代分离细胞培养相比，该方法具有多项优势。首先，相较于分离细胞培养条件，细胞在切片中所处的环境相对完整。其次，切片制备使我们能够研究由细胞间通讯介导的间接通路22，而这一点在分离细胞培养条件下无法实现。此外，我们还展示了如何利用两性霉素B作为成孔剂，采用穿孔式全细胞膜片钳技术对所获得的组织切片进行电生理记录。

青鳉是一种原产于亚洲的小型淡水鱼类，主要分布于日本。一百多年来，人们对青鳉的生理学、胚胎学和遗传学进行了广泛研究31，使其成为许多实验室中常用的科研模式生物。对本文尤为重要的是，硬骨鱼类下丘脑-垂体复合体具有独特的形态结构：在哺乳动物和鸟类中，下丘脑神经元将其调节垂体内分泌细胞的神经激素释放到正中隆起的门脉系统中；而在硬骨鱼类中，下丘脑神经元则直接投射到垂体的内分泌细胞上32。因此，在鱼类中进行精细的脑-垂体切片操作尤为关键，这使我们能够在结构完好的脑-垂体网络中研究垂体细胞的电生理特性，特别是垂体细胞如何调控其兴奋性以及由此产生的 Ca2+ 稳态。

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方案

所有动物操作均按照挪威生命科学大学关于实验动物护理与福利的建议进行，并在授权研究人员的监督下实施。

1. 仪器与溶液的准备

注意：所有溶液均应为无菌状态。所有溶液的 pH 值和渗透压（osmol/kg 水）需特别注意，应根据所研究物种的细胞外环境进行精确调整。pH 值和渗透压应分别使用精密电子设备（如 pH 计和冰点渗透压仪）进行调节。

  1. 配制500 mL不含Ca的细胞外溶液2+ (Ca2+ 游离EC液：150 mM NaCl，5 mM KCl，1.3 mM MgCl₂2，4 mM 葡萄糖，10 mM Hepes。
    1. 溶解 4.38 g NaCl、186.37 mg KCl、61.89 mg MgCl2，360.32 mg 葡萄糖和 1.19 g HEPES 溶于 450 mL 超纯水（25 °C 时电导率为 0.055 μS/cm，电阻率为 18.2 MΩ）中2在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器进行搅拌。
    2. 用 NaOH 将 pH 值调节至 7.75。
    3. 将溶液转移至500 mL容量瓶中。用超纯水定容至刻度线。2O 至 500 mL。
    4. 在测定渗透压前充分混匀溶液。用甘露醇调节渗透压至290–300 mOsm。使用水抽滤系统和0.2 µm滤膜对溶液进行过滤除菌。
  2. 配制500 mL细胞外液（EC）：150 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂2，1.3 mM MgCl2，4 mM 葡萄糖，10 mM Hepes。
    1. 溶解 4.38 g NaCl、186.37 mg KCl、147.01 mg CaCl₂·2H₂O 和 100.07 mg MgCl₂·6H₂O 于 900 mL 去离子水中。2，61.89 mg 的 MgCl2，360.32 mg 葡萄糖和 1.19 g HEPES 溶于 450 mL 超纯水2在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器进行搅拌。
    2. 用 NaOH 将 pH 值调节至 7.75。
    3. 将溶液转移至500 mL容量瓶中。用超纯水定容至500 mL刻度线。2O 至 500 mL。
    4. 在测定渗透压前充分混匀溶液。用甘露醇调节至290–300 mOsm。使用水抽滤系统和0.2 µm滤器对溶液进行过滤除菌。
  3. 配制500 mL含0.1%牛血清白蛋白的细胞外溶液（EC with BSA）：150 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂2，1.3 mM MgCl24 mM 葡萄糖，10 mM Hepes
    1. 溶解 4.38 g NaCl、186.37 mg KCl、147.01 mg CaCl₂·2H₂O 和 104.58 mg MgCl₂·6H₂O 于 900 mL 去离子水中。2，61.89 mg 的 MgCl2，360.32 mg 葡萄糖和 1.19 g HEPES 溶于 450 mL 超纯水2在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器进行搅拌。
    2. 用 NaOH 将 pH 值调节至 7.75。
    3. 将溶液转移至500 mL容量瓶中。用超纯水定容至500 mL刻度线。2O 至 500 mL。
    4. 在测量渗透压前充分混匀溶液。用甘露醇调节至290–300 mOsm。使用水抽滤系统和0.2 µm滤膜对溶液进行过滤除菌。加入50 mg BSA。
  4. 配制 250 mL 细胞内液（IC）：110 mM KOH，20 mM KCl，10 mM Hepes，20 mM 蔗糖。
    1. 将1.54 g KOH、327.75 mg KCl、595.75 mg HEPES和1.712 g蔗糖溶解于450 mL超纯H₂O中2在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器进行搅拌。
    2. 用 (N-吗啉代)乙磺酸（MES）调节 pH 至 7.2。
    3. 将溶液转移至250 mL容量瓶中。用超纯水定容至刻度线。2O 至 250 mL。
    4. 在测量渗透压前充分混匀溶液。用蔗糖将渗透压调节至280–290 mOsm（比细胞外液低10 mOsm）。使用水抽滤系统和0.2 µm滤膜对溶液进行过滤除菌。
  5. 配制100 mL含Ca²⁺的2%低熔点琼脂糖溶液2+ 且不含 BSA 的 EC（100 mL 含有 2 g 低熔点琼脂糖的 Ca）2+ 游离EC）。使用微波炉溶解，并将融化的琼脂糖置于40 °C水浴中。待其冷却至40 °C后，用于组织。
    注意：EC，Ca2+ 游离的EC若保持无菌，可在4 °C下保存数周；IC溶液可在-20 °C下保存数月。琼脂糖可在4 °C下保存一周，并可通过短暂微波加热重复使用3–5次。过度重复使用将导致水分蒸发，以及琼脂糖和盐浓度与质量的改变。
  6. 制备琼脂盐桥：
    1. 使用本生灯加热长度为7.5 mm、外径（O.D.）2 mm、内径（I.D.）1.16 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管，加热位置位于一端约1/3处，直至玻璃开始弯曲。将玻璃管从火焰中取出，使其自然弯曲成约120度的角度。图2A).
    2. 使用微波炉将2%琼脂在不含葡萄糖的正常EC溶液中融化，待琼脂糖处于液态时，通过毛细作用力将预制成的玻璃毛细管一端浸入液体中，静置数分钟以完成填充。将制备好的毛细管桥保存于4 °C不含葡萄糖的EC溶液中，备用。
  7. 使用合适的移液管拉制仪制备带细丝的硼硅酸盐玻璃移液管。参照移液管拉制仪说明书，以获得所需的电极电阻。
    ​注意：移液管的锥形部分应尽可能短。通过使用4–6个拉制步骤可实现较短的移液管锥度。电极电阻应根据细胞大小在2至6 MΩ之间。
  8. 为避免膜片钳实验过程中组织移动，使用含0.1%聚乙烯亚胺（PEI）的硼酸盐缓冲液包被记录浴槽表面。
    1. 配制 500 mL 硼酸盐缓冲液（25 mM）：
      1. 溶解 4.768 g Na2B4O7/10H2O，加入超纯水至450 mL2在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器进行搅拌。
      2. 用 HCl 将 pH 值调至 8.4。
      3. 将溶液转移至500 mL容量瓶中。用超纯水定容至刻度线。2加水定容至500 mL，并使用水抽滤系统通过0.2 µm滤膜对溶液进行过滤除菌。
    2. 配制1%的PEI储备液（将1 mL 50% PEI加入49 mL 25 mM硼酸盐缓冲液），并取10 µL 1%储备液加入100 µL硼酸盐缓冲液中稀释，制备0.1% PEI工作液。
    3. 在切片架的玻片上加入 2 mL 0.1% PEI，使包被液孵育 1 分钟。随后用 5 mL 超纯水短暂洗涤玻片两次2O，并风干至使用。
  9. 制备两性霉素B溶液。
    1. 将3 mg两性霉素B粉末溶于50 µL避光的1 mL离心管中的二甲基亚砜（DMSO）中，配制成60 mg/mL的母液。涡旋振荡最大速度30秒，超声15分钟以混匀。分装至3–5个管中，于-20 °C保存，每日使用一管。
      注意：如果两性霉素B储备液在超声处理15–20分钟后仍未呈澄清的黄色，而是呈乳白色（仍带黄色），则需重新配制储备液。
    2. 在容量超过10 mL的洁净玻璃烧杯中，用移液器加入2 mL IC溶液，再加入8 µL两性霉素B储备液，通过移液混匀。用铝箔纸包裹烧杯，置于冰上备用，每3小时更换一次。

2. 使用振动切片机进行解剖和切片

  1. 在解剖前准备好解剖工具，包括一把尖头镊子和一把结实的镊子，并配备剪刀。使用乙醇清洁工具（组织固定器、刷子、镊子），确保这些工具仅用于解剖，不得接触固定组织。将工具存放于单独的容器中，以避免污染。
  2. 将鱼置于冰水中低温安乐死1分钟。
  3. 按照以下步骤，使用尖头镊子快速解剖青鳉鱼脑和垂体（用时不超过3分钟）。
    1. 用镊子夹住鱼体，用剪刀或尖头镊子在眼睛后方切断两条视神经。
    2. 使用强力镊子逐步从后向前敲开颅骨的背侧部分。
    3. 用强力镊子剥离一侧颅骨。
    4. 用剪刀或锐利的镊子切断脊髓。
    5. 用镊子轻轻夹住脊髓，将脑组织从后向前翻转，放入盛有冰冻的含钙溶液的培养皿中2+ 游离EC
  4. 填充1.5–2 cm3 将含有液态琼脂糖的金属模具置于冰上。
  5. 在琼脂糖即将凝固时（约 25–30 °C），用镊子轻轻夹住脑组织的脊髓端，用一小片细纸擦干镊子，将组织放入琼脂糖中。迅速搅动琼脂糖以稀释组织周围残留的细胞外液，调整组织位置，并将模具置于冰上数秒，直至琼脂糖完全凝固。
    注意：此步骤必须迅速操作。由于金属模具被冰冷却，琼脂糖会迅速凝固。
  6. 用手术刀片修剪含有组织的琼脂糖方块，并使用外科手术用（无毒）胶水将其粘附在振动切片机的样品托上。
  7. 用冰冻的含钙溶液填充用于接收标本（脑-垂体）的振动切片机比色皿2+ 游离EC
  8. 将样本架放入振动切片机中，使用高频率和低速切割琼脂糖块，制备150 µm厚的旁矢状切片。收集选定切片，并将其置于含3 mL冰冻Ca2+ 游离EC
  9. 放置网格琴（图2B) 在组织切片上。
    注意：支架将与包被共同作用，稳定组织，防止其在膜片钳记录过程中发生移动。
  10. 竖琴放置到位后，更换 Ca2+ 将无钙EC培养基加入含钙的正常EC中2+ 以及 BSA。将组织静置 10 分钟。

3. 穿孔膜片钳与电生理记录

  1. 实验开始前，按以下步骤对银丝电极进行氯化处理：首先，使用细砂纸（p180）清洁银丝电极；其次，用2 mL 70%乙醇冲洗；第三，将电极浸入2 mL 2–5%氯溶液中10分钟；最后，用2 mL超纯H2O冲洗。
  2. 将含有脑-垂体切片的记录室置于显微镜载物台上，使用10倍物镜定位目标区域（垂体），并用40倍物镜观察细胞。
    注意：若制备成功，应仅见极少数圆形细胞。这些圆形细胞通常是已受损并从组织脱落的细胞。
  3. 将接地电极通过2%琼脂桥插入胞外液浴槽中。
  4. 使用40倍物镜定位一个健康细胞。
    注意：健康细胞应牢固附着于组织切片上，不呈圆形，且未从切片脱落。
  5. 将放大器设置为电压钳（VC；图4A 点1）模式。打开封接测试窗口，点击 浴液 配置（图4B 点1和2）。使用5 mV脉冲监测移液管电阻（图4B 点3）。
  6. 使用微填充注射器，先用不含抗真菌剂的胞内液（IC溶液）回填膜片移液管尖端，再加入含两性霉素B的IC溶液（见 图3）。
  7. 使用1 mL注射器向膜片移液管内施加轻微正压。
    注意：这会使少量液体从移液管尖端流出，防止尖端污染。
  8. 移液管进入浴液后，评估其电阻，并确保无颗粒附着在尖端（图4C）。
    注意：可在显示器上贴一小块胶带，标记视野视频记录的位置，以便在物镜未对准细胞时更方便地定位移液管相对于细胞的位置。
  9. 使用微操纵器将膜片移液管引导至细胞表面。
    注意：应检查移液管是否清洁，观察是否有颗粒附着于尖端。电阻的突然变化也可能是由于颗粒堵塞移液管尖端所致。
  10. 当移液管位于细胞上方数微米处时，重新调整位置，使移液管尖端接触细胞中心偏1/3处，如 图5 所示。接触细胞后，释放正压，并施加轻柔负压以形成封接。
    注意：从移液管进入浴液到成功形成封接的时间应尽可能短，不超过1–1.5分钟，以避免两性霉素B扩散至移液管尖端并泄漏到浴液中。
  11. 立即切换至膜片钳软件中的 封接 窗口（图4D 点1），并将保持电位设为-50至-60 mV之间（图4D 点2）。在软件中补偿由玻璃移液管引起的快速电容（图4D 点3）。
  12. 切换至膜片钳软件中的 细胞 窗口（图4E 点1和2），开始监测该窗口显示的接入电阻 Ra。在获得足够接入后，于放大器软件中补偿膜电容（图4E 点3）。
    注意：获得充分接入可能需要10至30分钟（图4E 点2）。用于电流钳记录的良好接入电阻应低于20 MΩ。
  13. 在放大器软件窗口中切换至电流钳（IC）模式（图4F 点1）。在放大器软件的 I-clamp 窗口中调节快速电容电流（图4F 点2和3），使其与步骤3.12中的数值一致。检查膜电位（图4F 点1）。
    注意：重要的是，若膜电位较浅（通常高于-35 mV），则细胞可能已受损。此时应终止记录，并更换新细胞。
  14. 在找到健康细胞（牢固附着于组织且膜电位低于-40 mV）后，按照制造商提供的操作说明开始实验记录33,34。

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结果

本方案逐步演示了如何利用青鳉转基因品系 [Tg(lhb-hrGfpII)] 获得可靠的垂体（促性腺细胞）电生理记录，该品系中目标细胞（产生黄体生成素的促性腺细胞）被绿色荧光蛋白（GFP）标记。

最初，采用全细胞构型进行电生理记录。然而，在所研究的任何细胞中均未观察到自发性动作电位。在部分细胞中，可通过施加微小电流刺激（5–9 pA）从静息电位为 -50 至 -60 mV 的状态诱发动作电位（图6）。这些动作电位表现出快速衰减现象，约 4–6 分钟后便无法再诱发动作电位。所观察到的特别快速的衰减可能与细胞体积较小有关。通常情况下，垂体细胞的体积小于神经元30。例如，促性腺激素细胞的平均膜电容介于 4 至 10 pF 之间3,3...

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讨论

采用膜片钳技术对脑-垂体切片进行电生理记录需要仔细优化。目前针对硬骨鱼类活细胞研究的优化方案较为有限，大多数文献采用基于哺乳动物系统的实验方案。在此需要特别注意的是，诸如pH值和渗透压等生理参数不仅具有物种特异性，还显著依赖于生物体是生活在陆地还是水环境中。对于鱼类而言，还需进一步考虑其生存于海水还是淡水环境。例如，鱼类的CO2分压远低于哺乳动物，鱼类pCO2水平为1.7–3.4 mmHg，而哺乳动物则为40–46 mmHg pCO236。基于此，本实验方案中所有溶液的pH值均调整为7.7537,38,39,40。同时我们使用HEPES缓冲液，因其在pH 7.4–7.8范围内具有优异的缓冲能力41。渗透压设定为290–300...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

感谢 LourdesCarreon G Tan 女士在维护青鳉鱼养殖设施方面提供的帮助，以及 Anthony Peltier 提供的示意图。本工作由挪威生命科学大学（NMBU）以及挪威研究理事会资助，资助编号为 244461（水产养殖项目）和 248828（挪威数字生命项目）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
振动切片机LeicaVT1000 S
外科胶水WPIVETBOND3M Vetbond 组织粘合剂
不锈钢刀片Campden Instruments752-1-SS
金属模具SAKURA4122
钢丝网Warner Instruments64-1417
PBSSIGMAD8537
超纯低熔点琼脂糖Invitrogen166520-100
膜片钳移液管Sutter InstrumentBF150-110-10HP含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径：1.5 mm，内径：1.10 mm
显微镜 SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Molecular Devices#1-2500-0180软件
数模转换器 Digidata 1550A1Molecular DevicesDD1550
放大器 Multiclamp 700B 头级 CV-7BMolecular Devices1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH 三氟乙酸盐 
移液管拉制仪Sutter InstrumentP-1000
两性霉素BSIGMAA9528成孔抗生素
聚乙烯亚胺 SIGMAP314350% PEI 溶液
微量注射器WPIMF28/g67-5
琼脂桥用玻璃管Sutter InstrumentBF200-116-15含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径：2.0 mm，内径：1.16 mm，火焰抛光
Micro-Manager 软件开源显微镜软件
optiMOS sCMOS 相机Qimaging 01-OPTIMOS-R-M-16-C
超声破碎仪ElmaD-7700 singen
NaClSIGMAS3014
KClSIGMAP9541
MgCl2SIGMAM8266
D-葡萄糖SIGMAG5400
HEPESSIGMAH4034
CaCl2SIGMAC8106
蔗糖SIGMA84097
D-甘露醇SIGMA63565
MES酸SIGMAM0895
BSASIGMAA2153

参考文献

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用于电生理学研究硬骨鱼类垂体细胞的健康脑-垂体切片
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