用于电生理学研究硬骨鱼类垂体细胞的健康脑-垂体切片

摘要

本文介绍了一种优化的制备具有活性的脑-垂体组织切片的实验方案，以辐鳍鱼纲鱼类青鳉（Oryzias latipes）为模型，随后采用穿孔膜片钳技术对垂体细胞进行膜片钳电生理记录。

摘要

已对多种脊椎动物的垂体细胞开展了电生理学研究，但在硬骨鱼类中的研究极为有限。在已有的研究中，绝大多数采用的是分离的原代细胞。为了增进对硬骨鱼类垂体细胞在更具生物学相关性的环境中行为特征的理解，本方案展示了如何利用小型淡水鱼类青鳉（Oryzias latipes）制备具有活性的脑-垂体组织切片。在制备脑-垂体切片时，所有溶液的pH值和渗透压均调整至与25至28 °C环境下生活的淡水鱼类体液相一致的水平。切片制备完成后，本方案进一步演示了如何采用穿孔式全细胞膜片钳技术进行电生理记录。膜片钳技术是一种功能强大的工具，具有前所未有的时间分辨率和灵敏度，可用于研究从完整全细胞到单个离子通道的电学特性。穿孔式膜片钳的独特之处在于能够保持细胞内环境的完整性，防止细胞质中的调控成分被膜片钳电极液稀释。相比之下，在进行传统全细胞记录时，观察到青鳉垂体细胞会迅速丧失产生动作电位的能力。在现有的多种穿孔技术中，本方案重点演示了如何使用抗真菌剂两性霉素B实现膜片膜的穿孔。

引言

垂体是位于下丘脑下方、视交叉后方的脊椎动物关键内分泌器官。它由特定的细胞类型产生并分泌六到八种激素。垂体激素在大脑与外周器官之间起中介作用，驱动包括生长、生殖以及稳态调节在内的一系列重要生理过程。与神经元类似，垂体的内分泌细胞具有电兴奋性，能够自发产生动作电位¹。这些动作电位的作用取决于细胞类型。在哺乳动物垂体的多种细胞类型中，动作电位可使细胞内Ca²⁺浓度升高至足以维持激素的持续释放²。此外，垂体接收来自大脑的兴奋性和抑制性信号，这些信号影响细胞的膜电位^3,4,5,6。通常，兴奋性输入会增加细胞的兴奋性，常涉及细胞内钙库释放Ca²⁺以及放电频率的增加 ⁷。了解细胞如何利用离子通道组成并适应来自大脑的这些输入信号，是理解激素合成与释放机制的关键。

膜片钳技术由Sakmann和Neher于20世纪70年代末期建立^8,9

方案

所有动物操作均按照挪威生命科学大学关于实验动物护理与福利的建议进行，并在授权研究人员的监督下实施。

1. 仪器与溶液的准备

注意：所有溶液均应为无菌状态。所有溶液的 pH 值和渗透压（osmol/kg 水）需特别注意，应根据所研究物种的细胞外环境进行精确调整。pH 值和渗透压应分别使用精密电子设备（如 pH 计和冰点渗透压仪）进行调节。

1. 配制500 mL不含Ca的细胞外溶液²⁺ (Ca²⁺ 游离EC液：150 mM NaCl，5 mM KCl，1.3 mM MgCl₂₂，4 mM 葡萄糖，10 mM Hepes。
   1. 溶解 4.38 g NaCl、186.37 mg KCl、61.89 mg MgCl₂，360.32 mg 葡萄糖和 1.19 g HEPES 溶于 450 mL 超纯水（25 °C 时电导率为 0.055 μS/cm，电阻率为 18.2 MΩ）中₂在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器进行搅拌。
   2. 用 NaOH 将 pH 值调节至 7.75。
   3. 将溶液转移至500 mL容量瓶中。用超纯水定容至刻度线。₂O 至 500 mL。
   4. 在测定渗透压前充分混匀溶....

结果

本方案逐步演示了如何利用青鳉转基因品系 [Tg(lhb-hrGfpII)] 获得可靠的垂体（促性腺细胞）电生理记录，该品系中目标细胞（产生黄体生成素的促性腺细胞）被绿色荧光蛋白（GFP）标记。

最初，采用全细胞构型进行电生理记录。然而，在所研究的任何细胞中均未观察到自发性动作电位。在部分细胞中，可通过施加微小电流刺激（5–9 pA）从静息电位为 -50 至 -60 mV 的状态诱发动作电位（图6）。这些动作电位表现出快速衰减现象，约 4–6 分钟后便无法再诱发动作电位。所观察到的特别快速的衰减可能与细胞体积较小有关。通常情况下，垂体细胞的体积小于神经元³⁰。例如，促性腺激素细胞的平均膜电容介于 4 至 10 pF 之间^3,3.......

讨论

采用膜片钳技术对脑-垂体切片进行电生理记录需要仔细优化。目前针对硬骨鱼类活细胞研究的优化方案较为有限，大多数文献采用基于哺乳动物系统的实验方案。在此需要特别注意的是，诸如pH值和渗透压等生理参数不仅具有物种特异性，还显著依赖于生物体是生活在陆地还是水环境中。对于鱼类而言，还需进一步考虑其生存于海水还是淡水环境。例如，鱼类的CO₂分压远低于哺乳动物，鱼类pCO₂水平为1.7–3.4 mmHg，而哺乳动物则为40–46 mmHg pCO₂³⁶。基于此，本实验方案中所有溶液的pH值均调整为7.75^37,38,39,40。同时我们使用HEPES缓冲液，因其在pH 7.4–7.8范围内具有优异的缓冲能力⁴¹。渗透压设定为290–300.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
振动切片机	Leica	VT1000 S
外科胶水	WPI	VETBOND	3M Vetbond 组织粘合剂
不锈钢刀片	Campden Instruments	752-1-SS
金属模具	SAKURA	4122
钢丝网	Warner Instruments	64-1417
PBS	SIGMA	D8537
超纯低熔点琼脂糖	Invitrogen	166520-100
膜片钳移液管	Sutter Instrument	BF150-110-10HP	含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径：1.5 mm，内径：1.10 mm
显微镜 Slicescope	Scientifica	pro6000
P-Clamp10	Molecular Devices	#1-2500-0180	软件
数模转换器 Digidata 1550A1	Molecular Devices	DD1550
放大器 Multiclamp 700B 头级 CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B
GnRH	Bachem	4108604	H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH 三氟乙酸盐
移液管拉制仪	Sutter Instrument	P-1000
两性霉素B	SIGMA	A9528	成孔抗生素
聚乙烯亚胺	SIGMA	P3143	50% PEI 溶液
微量注射器	WPI	MF28/g67-5
琼脂桥用玻璃管	Sutter Instrument	BF200-116-15	含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径：2.0 mm，内径：1.16 mm，火焰抛光
Micro-Manager 软件			开源显微镜软件
optiMOS sCMOS 相机	Qimaging	01-OPTIMOS-R-M-16-C
超声破碎仪	Elma	D-7700 singen
NaCl	SIGMA	S3014
KCl	SIGMA	P9541
MgCl2	SIGMA	M8266
D-葡萄糖	SIGMA	G5400
HEPES	SIGMA	H4034
CaCl2	SIGMA	C8106
蔗糖	SIGMA	84097
D-甘露醇	SIGMA	63565
MES酸	SIGMA	M0895
BSA	SIGMA	A2153