方法文章

人视网膜色素上皮细胞的分化、维持与分析：用于 BEST1 突变的“培养皿中疾病”模型

DOI：

10.3791/57791

⸱

2018年8月24日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种从携带患者来源突变的人多能干细胞分化获得视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方案。这些突变细胞系可用于包括免疫印迹、免疫荧光和膜片钳在内的功能分析。这种“在培养皿中建模疾病”的方法克服了获取天然人源RPE细胞的困难。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管已发现200多种人类BEST1基因的遗传突变，并将其与视网膜变性疾病相关联，但由于缺乏合适的体内模型来在生理条件下研究BEST1及其突变，其致病机制仍不明确。BEST1编码一种离子通道，即BESTROPHIN1（BEST1），其在视网膜色素上皮（RPE）中发挥作用；然而，原代人类RPE细胞极难获取，这为科学研究带来了重大挑战。本方案描述了如何通过诱导人类多能干细胞（hPSCs）分化，生成携带BEST1致病突变的人类RPE细胞。由于hPSC具有自我更新能力，该方法可为研究人员提供稳定来源的hPSC-RPE细胞，用于多种实验分析，如免疫印迹、免疫荧光和膜片钳技术，从而为BEST1相关视网膜疾病提供一个强大的“培养皿中的疾病”模型。值得注意的是，该策略还可用于研究RPE的（病理）生理学以及其他在RPE中天然表达的感兴趣基因。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

已有文献记载，至少五种视网膜变性疾病由BEST1基因的遗传突变引起1,2,3,4,5,6,7,8，目前已报道的突变数量已超过200种，且仍在持续增加。这些与BEST1相关的疾病也被称为bestrophinopathies，会导致进行性视力下降甚至失明，目前尚无有效的治疗方法。由BEST1基因编码的蛋白质产物即BESTROPHIN1（BEST1），是一种在眼部视网膜色素上皮（RPE）中特异性表达的Ca2+激活的Cl-通道（CaCC）5,6,8,9。重要的是....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 人多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化

  1. 按照先前所述方法维持和传代hPSCs18。
    注：所有细胞（包括hPSCs和hPSC-RPEs）在整个生长和分化方案期间均在37 °C、5% CO2条件下培养。
  2. 分化前，将汇合的hPSCs分种至预先包被的6孔板中。
    1. 包被板时，将基底膜基质置于冰上解冻约1小时，用4 °C的DMEM培养基以1:50比例稀释液化的基质，每孔加入800 µL包被液，37 °C孵育至少1小时。
    2. 包被完成后，吸除包被液，并立即向每孔中加入1.5–2 mL培养基。
    3. 从原培养板中消化hPSCs时，将细胞在室温下用含0.5 mM EDTA的PBS孵育5分钟，吸除溶液后，用培养基将细胞重悬为小细胞团块。
    4. 以约20%汇合度将细胞接种至新板中。
      注：基底膜基质应分装为100 µL每份，于-20 °C保存，每份用于包被一个6孔板。包被时间可延长至37 °C下4小时，或室温过夜。重要的是，hPSCs应以3–5个细胞组成的小团块形式进行悬浮和接种，而非单细胞状态。
  3. 当细胞生长至完全汇合时，更换为分化培养基（每孔4 mL）（表1，不含activin-A）。培养14天，每周更换培养基（每孔4 ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

技术上最具挑战性的步骤是手动分离，其目标是获得高纯度的已分化P0 hPSC-RPE细胞群体。成功分离后，P0群体中>90%的细胞将生长并成熟，表现出典型的RPE形态特征（图1C）。P0群体中存在少量非RPE细胞或未成熟RPE细胞几乎是不可避免的，但只要色素化且呈鹅卵石状的hPSC-RPE细胞占绝对多数，就不会影响后续实验。

利用基于人多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hPSC-RPE）的“疾病在培养皿中建模”方法，可对每位患者特异性的 BEST1 突变进行全面的 体内 表征，包括蛋白表达水平（免疫印迹，图3）、膜运输功能（免疫染色，图4）以及离子通道功能（全细胞膜片钳.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用“在培养皿中模拟疾病”方法时，最关键的步骤是将携带致病突变的人多能干细胞（hPSCs）分化为正确的细胞谱系，对于BEST1基因而言，该谱系即为视网膜色素上皮（RPE）。因此，在每次分化实验后，应通过RPE特异性的形态特征和蛋白标志物，对获得的hPSC-RPE细胞进行严格验证，以确认其成熟状态16,17,18。为尽量减少克隆变异带来的干扰，应尽可能使用来自同一患者的多个hiPSC克隆，或携带相同突变的多个hESC克隆。

hiPSC 和 hESC 细胞系均可使用相同的方案分化为视网膜色素上皮细胞（RPE）。携带或不携带 BEST1 基因突变的 hiPSC 可分别从 BEST1 患者或健康供体的皮肤成纤维细胞重编程获得。携带 BEST1 基因突变的 hESC 可通过对具有野生型（WT）BEST1 的亲本 hESC 细胞系进行基因工程改造而获得。hiPSC-RPE .......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为 EY025290、GM127652，以及罗切斯特大学启动资金支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
敲除型DMEM培养基 (KO DMEM)ThermoFisher10829018
敲除血清替代物 (KO serum replacement)ThermoFisher10829028
非必需氨基酸 (Nonessential amino acids)ThermoFisher11140050
谷氨酰胺 (Glutamine)ThermoFisher35050061
青霉素-链霉素 (Penicillin-streptomycin)ThermoFisher10378016
烟酰胺 (Nicotinamide)Sigma-AldrichN0636
人激活素A (Human activin-A)PeproTech120-14
MEM（改良型）(MEM (a modification))Sigma-AldrichM4526
胎牛血清 (Fetal Bovine Serum)VWR97068-085
N1添加剂 (N1 supplement)Sigma-AldrichN6530
谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合液 (Glutamine-penicillin-streptomycin)Sigma-AldrichG1146
非必需氨基酸 (Nonessential amino acids)Sigma-AldrichM7156
牛磺酸 (Taurine)Sigma-AldrichT0625
氢化可的松 (Hydrocortisone)Sigma-AldrichH0386
三碘甲腺原氨酸 (Triiodo-thyronin)Sigma-AldrichT5516
mTeSR-1培养基 (mTeSR-1 medium)Stemcell Technologies5850
Matrigel基质胶 (Matrigel)Corning356230
胶原酶 (Collagenase)Gibco17104019
胰蛋白酶 (Trypsin)VWR45000-664
M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 (M-PER mammalian protein extraction reagent)Pierce78501
蛋白酶抑制剂混合物 (proteinase inhibitor cocktail)Sigma-Aldrich4693159001
RPE65抗体 (RPE65 antibody)Novus BiologicalsNB100-355
CRALBP抗体 (CRALBP antibody)Abcamab15051
BEST1抗体 (BEST1 antibody)Novus BiologicalsNB300-164
β-肌动蛋白抗体 (Beta Actin antibody)ThermoFisherMA5-15739
Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG (Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG)ThermoFisherA-21202
山羊抗小鼠IgG (Goat anti-mouse IgG)ThermoFisherSA5-35521
山羊抗兔IgG (Goat anti-Rabbit IgG)LI-COR Biosciences926-68071
Hoechst 33342染料 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
HEKA EPC10膜片钳放大器 (HEKA EPC10 patch clamp amplifier)Warner Instruments895000
Patchmaster软件 (Patchmaster)Warner Instruments895040

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
  2. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章