人视网膜色素上皮细胞的分化、维持与分析：用于 BEST1 突变的“培养皿中疾病”模型

摘要

本文介绍了一种从携带患者来源突变的人多能干细胞分化获得视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方案。这些突变细胞系可用于包括免疫印迹、免疫荧光和膜片钳在内的功能分析。这种“在培养皿中建模疾病”的方法克服了获取天然人源RPE细胞的困难。

摘要

尽管已发现200多种人类BEST1基因的遗传突变，并将其与视网膜变性疾病相关联，但由于缺乏合适的体内模型来在生理条件下研究BEST1及其突变，其致病机制仍不明确。BEST1编码一种离子通道，即BESTROPHIN1（BEST1），其在视网膜色素上皮（RPE）中发挥作用；然而，原代人类RPE细胞极难获取，这为科学研究带来了重大挑战。本方案描述了如何通过诱导人类多能干细胞（hPSCs）分化，生成携带BEST1致病突变的人类RPE细胞。由于hPSC具有自我更新能力，该方法可为研究人员提供稳定来源的hPSC-RPE细胞，用于多种实验分析，如免疫印迹、免疫荧光和膜片钳技术，从而为BEST1相关视网膜疾病提供一个强大的“培养皿中的疾病”模型。值得注意的是，该策略还可用于研究RPE的（病理）生理学以及其他在RPE中天然表达的感兴趣基因。

引言

已有文献记载，至少五种视网膜变性疾病由BEST1基因的遗传突变引起^{1,2,3,4,5,6,7,8}，目前已报道的突变数量已超过200种，且仍在持续增加。这些与BEST1相关的疾病也被称为bestrophinopathies，会导致进行性视力下降甚至失明，目前尚无有效的治疗方法。由BEST1基因编码的蛋白质产物即BESTROPHIN1（BEST1），是一种在眼部视网膜色素上皮（RPE）中特异性表达的Ca²⁺激活的Cl^-通道（CaCC）^5,6,8,9。重要的是，BEST1相关疾病的临床表型之一是对光刺激的视觉反应减弱，这种现象称为光峰（light peak, LP），可在眼电图中检测到^10,11；据信LP是由RPE中的CaCC介导的^12,13,14。为了更深入理解BEST1突变的病理机制，并推动潜在疗法的研发，研究在人RPE细胞中内源性表达的突变型BEST1通道至关重要。

然而，直接从活体患者获取视网膜色素上皮（RPE）细胞极不现实。尽管可从人类尸体及胎儿的活检组织中获取原代RPE细胞，但这些来源难以获得，严重限制了科学研究。因此，迫切需要除人眼以外的其他RPE细胞来源。近年来干细胞技术的进步为此提供了答案，功能性RPE细胞现已可由人类多能干细胞分化而来 多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（hiPSCs），后者通过重编程供体的原代皮肤成纤维细胞获得^16,17,18重要的是，hPSCs 的自我更新能力和多能性可确保为生成视网膜色素上皮细胞（RPEs）提供可靠的细胞来源，而hiPSCs具有患者特异性，hESCs则具备基因组修饰潜力例如，通过CRISPR技术）为所需疾病提供了一种多功能的“疾病在培养皿中”模型 BEST1 突变。

hPSC-RPE 相较于小鼠 RPE 模型具有多个优势：1）BEST1 基因敲除小鼠并未表现出任何视网膜异常¹⁹，提示 BEST1 在小鼠与人类 RPE 中可能存在不同的遗传学需求；2）人类 RPE 细胞中仅有 3% 为双核细胞，而小鼠中则高达 35%²⁰；3）hiPSC-RPE 在视网膜疾病临床治疗中具备自体移植的潜力²¹。然而，动物模型对于在活体系统中研究 RPE 的生理与病理过程仍然不可或缺，且 hiPSC 的致瘤潜能不容忽视 。

本实验方案介绍了一种有用且相对简单的将人多能干细胞（hPSC）分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方法，可用于科研和临床研究。该方案利用烟酰胺（维生素B3）促进hPSC向神经组织分化，并通过激活素A（activin-A）处理进一步诱导其向RPE细胞分化。已有研究表明，烟酰胺处理可增加色素化细胞的数量（表明向RPE分化的标志），可能通过抑制分化过程中细胞的凋亡活性来实现²²。所获得的hPSC-RPE细胞表现出与天然人RPE细胞相同的关键标志物、鹅卵石样形态以及细胞功能²²。因此，在科研应用中，这些hPSC-RPE细胞适用于后续的功能分析实验，包括免疫印迹、免疫染色和全细胞膜片钳记录，本文也提供了这些实验的详细操作步骤。在临床方面，干细胞来源的RPE细胞在动物实验和人体临床试验中均显示出治疗黄斑变性的巨大潜力²³。

方案

1. 人多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化

1. 按照先前所述方法维持和传代hPSCs¹⁸。
   注：所有细胞（包括hPSCs和hPSC-RPEs）在整个生长和分化方案期间均在37 °C、5% CO₂条件下培养。
2. 分化前，将汇合的hPSCs分种至预先包被的6孔板中。
   1. 包被板时，将基底膜基质置于冰上解冻约1小时，用4 °C的DMEM培养基以1:50比例稀释液化的基质，每孔加入800 µL包被液，37 °C孵育至少1小时。
   2. 包被完成后，吸除包被液，并立即向每孔中加入1.5–2 mL培养基。
   3. 从原培养板中消化hPSCs时，将细胞在室温下用含0.5 mM EDTA的PBS孵育5分钟，吸除溶液后，用培养基将细胞重悬为小细胞团块。
   4. 以约20%汇合度将细胞接种至新板中。
      注：基底膜基质应分装为100 µL每份，于-20 °C保存，每份用于包被一个6孔板。包被时间可延长至37 °C下4小时，或室温过夜。重要的是，hPSCs应以3–5个细胞组成的小团块形式进行悬浮和接种，而非单细胞状态。
3. 当细胞生长至完全汇合时，更换为分化培养基（每孔4 mL）（表1，不含activin-A）。培养14天，每周更换培养基（每孔4 mL）3次。
   注：hPSC的板上密度约每24小时翻倍一次。分化程序开始后预期会出现明显的细胞死亡。在换液过程中可肉眼观察到孔中存在死亡细胞聚集体和碎片。
4. 从第15天至第28天，在分化培养基中添加100 ng/mL人activin-A（表1，含人activin-A）。每孔4 mL培养基，每周更换3次。
5. 从第29天起停止添加activin-A（表1，不含人activin-A）。继续在分化培养基中培养细胞8–10周，直至出现色素化的hPSC-RPE细胞簇（图1A-B）。
   注：色素化细胞簇在细胞培养板上可肉眼观察为微小的深色斑点（图1A-B，上图）。在20倍显微镜下可观察到具有典型鹅卵石样形态的单个色素化细胞（图1A-B，下图）。

2. 分化RPE细胞的分离与培养

1. 移除分化培养基，用 PBS 洗涤一次，每孔加入 1 mL 含 1 U/µL 胶原酶的 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C 培养 20–30 分钟。吸除胰蛋白酶/胶原酶溶液，每孔轻轻加入 2 mL 预热的 RPE 培养基（表 2）。
   注意：使用倒置显微镜观察 hPSC-RPE 细胞的形态，胰蛋白酶/胶原酶处理前细胞呈多边形，充分消化后变为圆形。
2. 使用本生灯拉制玻璃巴斯德吸管。
   1. 双手握住一根长（9 英寸）巴斯德吸管的两端，使其保持水平，并将吸管细部长度约 2/3 处置于本生灯火焰上方。
   2. 当玻璃在火焰中变软后，迅速将两端拉开，使吸管新端形成类似微型刮刀的尖端（图 2）。
   3. 重复多次以制备多个 "细胞刮刀"。用 70% 乙醇喷洒拉制好的吸管进行消毒，并在细胞培养超净台中晾干。
3. 在显微镜下，使用微型 "细胞刮刀"轻轻将色素化的 hPSC-RPE 细胞团从培养板上解离。
   1. 轻轻敲击（切勿刮擦）色素化细胞区域，细胞解离后会漂浮进入培养基中。
   2. 立即使用 20 µL 微量移液器轻轻吸取解离的 hPSC-RPE 细胞，并转移至预先包被的含 RPE 培养基的 6 孔板中²⁴。
   3. 根据需要重复步骤 2.3.1–2.3.2 多次，每孔预包被的 12 孔板中收集约 5 × 10³ 个细胞（在 20X 显微镜下观察约为 10% 汇合度）。最终培养基体积补至 2 mL。
      注意：为防止解离的 hPSC-RPE 细胞漂走，解离过程中应避免移动培养板，使细胞虽漂浮于培养基中但仍保持局部浓度。
4. 将新分离的 hPSC-RPE 细胞（P₀）在 12 孔板中用 RPE 培养基继续培养 6–8 周，使其形成色素化的单层细胞（图 1C）。
5. 每周换液 3 次。换液时，每孔保留约 1/3 体积的旧培养基，并加入 2/3 体积新鲜预热的 RPE 培养基。此阶段，12 孔板每孔使用 2 mL RPE 培养基（即每次更换 1.3 mL 培养基）。
   注意：P₀ hPSC-RPE 细胞形成的单层可能出现穹顶状结构，提示细胞正在主动转运液体，并通过紧密连接锚定²⁵。因此，穹顶形成是 RPE 细胞成熟状态的指标。

3. 通过免疫印迹验证RPE命运

1. 使用添加了蛋白酶抑制剂混合物的哺乳动物蛋白提取缓冲液制备hPSC-RPE细胞裂解液。将细胞裂解液在冰上孵育30分钟，然后在4 °C下以13,000 × g 离心15分钟，以去除未溶解的细胞碎片。测定裂解液的总蛋白浓度。
2. 在75 °C下，用Laemmli SDS上样缓冲液变性40 µg总蛋白10分钟。在10% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶中，先以90 V恒定电压电泳15分钟，然后以150 V继续电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。
3. 在预冷的含10%甲醇的Tris-甘氨酸转移缓冲液中，以100 V电压将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，持续1小时。
4. 用含0.1%非离子型去污剂（TBST）和5%脱脂奶粉的缓冲液在室温下封闭膜1小时。
5. 将膜与用封闭缓冲液稀释的一抗在4 °C孵育过夜。针对RPE特异性标志蛋白的一抗稀释比例如下：RPE65为1:1,000；CRALBP为1:1,000；BEST1为1:1,000。抗β-actin抗体按1:10,000稀释，用于检测作为上样对照的β-actin。
6. 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
7. 将膜与用封闭缓冲液按1:10,000稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗在室温下孵育1小时。
8. 用TBST洗涤膜4次，每次10分钟。
9. 使用红外成像系统检测蛋白（图3）。

4. 通过免疫染色检测 BEST1 的亚细胞定位

1. 用 2 mL PBS 清洗 hPSC-RPE 细胞一次，然后在 2 mL 4% 多聚甲醛中室温固定 45 分钟。
2. 用 2 mL PBS 清洗两次，再将细胞在含 0.1% 非离子型表面活性剂和 2% 驴血清的 2 mL PBS 中孵育 45 分钟，以封闭非特异性结合位点。
3. 加入 BEST1 抗体（1:200 稀释），室温孵育细胞 2 小时。
4. 用 2 mL PBS 清洗细胞 3 次，然后加入荧光标记的二抗 IgG（1:1,000 稀释），室温孵育 1 小时。
5. 用 2 mL PBS 清洗 3 次，以去除未结合的二抗。
6. 通过共聚焦显微镜观察染色后的细胞（图 4）。

5. 采用全细胞膜片钳技术记录 hPSC-RPE 中依赖 Ca²⁺ 的 Cl^- 电流

1. 在进行膜片钳实验前 24–72 小时，将 12 孔板中已完全融合的成熟 P₀ hPSC-RPE 细胞（呈鹅卵石状且有色素）进行传代。吸除培养基，用 PBS 洗涤一次，然后向孔中加入 1 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 1 U/µL 胶原酶的混合液。
   注意：使用前将胰蛋白酶/胶原酶预热至 37 °C。
2. 在 37 °C 下孵育 8 分钟。
   注意：此步骤后，hPSC-RPE 细胞仍贴壁并相互连接。
3. 用 1 mL 移液器轻轻冲洗细胞，将消化液中的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。再用 1 mL 预热的胰蛋白酶/胶原酶洗涤孔板，收集残留细胞，并合并至 15 mL 圆锥形离心管中。
   注意：此时 hPSC-RPE 细胞仍以较大团块形式存在。切勿通过剧烈吹打来打散细胞团块。部分团块可能粘附在 1 mL 吸头内壁上。
4. 将离心管置于 37 °C 干浴中孵育 8 分钟。
5. 用 1 mL 移液器对消化液轻柔吹打 10–15 次。
   注意：细胞团块明显变小但仍可见。避免剧烈吹打。
6. 重复前两个步骤。
   注意：吹打后大多数细胞应呈单细胞悬液状态。可能存在少量微小团块，可接受。可选：将离心管在 37 °C 下额外孵育 5 分钟，随后轻柔吹打。细胞在 37 °C 胰蛋白酶/胶原酶中的总处理时间不应超过 30 分钟（8 + 8 + 8 + 5 = 29）。
7. 向含有消化后细胞的 15 mL 圆锥形离心管中加入 5 mL 预热的 RPE 培养基。在 200 x g 下离心 5 分钟以收集细胞。重悬细胞后接种于预先包被的 35 mm 培养皿中，接种密度为 10–20% 融合度（例如，将 12 孔板中一个 100% 融合的孔接种至五个 35 mm 培养皿，即为 10% 融合度）。
   注意：全程避免剧烈吹打，否则可能导致明显细胞死亡，表现为离心后上清液中出现大量深色细胞碎片。良好的单细胞分离接种对膜片钳记录至关重要。
8. 按照先前所述方法进行全细胞膜片钳记录^{18,26,27,28,29,30,31}。从一系列阶跃电压（从 0 mV 钳制电位下 -100 至 +100 mV）获取电流轨迹（图 5）。
   注意：内液和外液的配方分别见 表 3 和 表 4。

结果

技术上最具挑战性的步骤是手动分离，其目标是获得高纯度的已分化P₀ hPSC-RPE细胞群体。成功分离后，P₀群体中>90%的细胞将生长并成熟，表现出典型的RPE形态特征（图1C）。P₀群体中存在少量非RPE细胞或未成熟RPE细胞几乎是不可避免的，但只要色素化且呈鹅卵石状的hPSC-RPE细胞占绝对多数，就不会影响后续实验。

利用基于人多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hPSC-RPE）的“疾病在培养皿中建模”方法，可对每位患者特异性的 BEST1 突变进行全面的 体内 表征，包括蛋白表达水平（免疫印迹，图3）、膜运输功能（免疫染色，图4）以及离子通道功能（全细胞膜片钳...

讨论

采用“在培养皿中模拟疾病”方法时，最关键的步骤是将携带致病突变的人多能干细胞（hPSCs）分化为正确的细胞谱系，对于BEST1基因而言，该谱系即为视网膜色素上皮（RPE）。因此，在每次分化实验后，应通过RPE特异性的形态特征和蛋白标志物，对获得的hPSC-RPE细胞进行严格验证，以确认其成熟状态^16,17,18。为尽量减少克隆变异带来的干扰，应尽可能使用来自同一患者的多个hiPSC克隆，或携带相同突变的多个hESC克隆。

hiPSC 和 hESC 细胞系均可使用相同的方案分化为视网膜色素上皮细胞（RPE）。携带或不携带 BEST1 基因突变的 hiPSC 可分别从 BEST1 患者或健康供体的皮肤成纤维细胞重编程获得。携带 BEST1 基因突变的 hESC 可通过对具有野生型（WT）BEST1 的亲本 hESC 细胞系进行基因工程改造而获得。hiPSC-RPE ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
敲除型DMEM培养基 (KO DMEM)	ThermoFisher	10829018
敲除血清替代物 (KO serum replacement)	ThermoFisher	10829028
非必需氨基酸 (Nonessential amino acids)	ThermoFisher	11140050
谷氨酰胺 (Glutamine)	ThermoFisher	35050061
青霉素-链霉素 (Penicillin-streptomycin)	ThermoFisher	10378016
烟酰胺 (Nicotinamide)	Sigma-Aldrich	N0636
人激活素A (Human activin-A)	PeproTech	120-14
MEM（改良型）(MEM (a modification))	Sigma-Aldrich	M4526
胎牛血清 (Fetal Bovine Serum)	VWR	97068-085
N1添加剂 (N1 supplement)	Sigma-Aldrich	N6530
谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合液 (Glutamine-penicillin-streptomycin)	Sigma-Aldrich	G1146
非必需氨基酸 (Nonessential amino acids)	Sigma-Aldrich	M7156
牛磺酸 (Taurine)	Sigma-Aldrich	T0625
氢化可的松 (Hydrocortisone)	Sigma-Aldrich	H0386
三碘甲腺原氨酸 (Triiodo-thyronin)	Sigma-Aldrich	T5516
mTeSR-1培养基 (mTeSR-1 medium)	Stemcell Technologies	5850
Matrigel基质胶 (Matrigel)	Corning	356230
胶原酶 (Collagenase)	Gibco	17104019
胰蛋白酶 (Trypsin)	VWR	45000-664
M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 (M-PER mammalian protein extraction reagent)	Pierce	78501
蛋白酶抑制剂混合物 (proteinase inhibitor cocktail)	Sigma-Aldrich	4693159001
RPE65抗体 (RPE65 antibody)	Novus Biologicals	NB100-355
CRALBP抗体 (CRALBP antibody)	Abcam	ab15051
BEST1抗体 (BEST1 antibody)	Novus Biologicals	NB300-164
β-肌动蛋白抗体 (Beta Actin antibody)	ThermoFisher	MA5-15739
Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG (Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG)	ThermoFisher	A-21202
山羊抗小鼠IgG (Goat anti-mouse IgG)	ThermoFisher	SA5-35521
山羊抗兔IgG (Goat anti-Rabbit IgG)	LI-COR Biosciences	926-68071
Hoechst 33342染料 (Hoechst 33342)	ThermoFisher	62249
HEKA EPC10膜片钳放大器 (HEKA EPC10 patch clamp amplifier)	Warner Instruments	895000
Patchmaster软件 (Patchmaster)	Warner Instruments	895040