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方法文章

通过闪速纳米沉淀法快速、可放大的生物活性蛋白和免疫刺激剂组装与装载至多种合成纳米载体

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DOI：

10.3791/57793

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2018年8月11日

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

本文内容

摘要

纳米材料为生命科学基础研究和转化应用中的可控治疗递送提供了多种机制，但其制备通常需要大多数生物医学实验室所不具备的专业技术。本文介绍了利用闪速纳米沉淀法规模化制备多种自组装纳米载体并实现治疗药物负载的实验方案。

摘要

纳米材料为治疗和成像应用中单个或联合分子载荷的可控递送提供了多种定制选择。这种增强的特异性可能具有重要的临床意义，包括减少副作用、降低剂量并提高药效。此外， 原位 靶向并精确调控特定细胞亚群可增强 体外 和 体内 对基本生物现象的研究以及对细胞功能的探究。然而，由于纳米科学、化学和工程学领域所需的专业知识较为复杂，缺乏相关经验的实验室往往难以自行制备和定制纳米材料，从而限制了其将纳米材料作为研究工具或治疗策略载体的应用。本文提供了合成一种多功能、无毒嵌段共聚物体系并实现其可扩展组装的实验方案，该体系易于形成并负载纳米级载体，适用于生物医学应用。闪速纳米沉淀法（Flash nanoprecipitation）被介绍为一种快速制备多种纳米载体的方法，所用材料为聚乙二醇-bl-聚（丙烯硫醚）共聚物。这些方案将使具备不同专业水平和资源条件的实验室能够简便、可重复地制备适用于其研究应用的先进纳米载体递送系统。本文描述了一种自动化仪器的设计与构建，该仪器采用高速注射泵以促进闪速纳米沉淀过程，并实现对聚合物囊泡纳米载体的均一性、尺寸、形貌及载药性能的更精确控制。

引言

纳米载体可实现对小分子和大分子货物的可控递送，包括一些活性物质——若不进行包封，这些物质会极易降解和/或疏水性过强而无法在体内给药。in vivo。在常规制备的纳米载体形态中，与脂质体类似的聚合物囊泡（也称为聚合物囊泡，polymersomes）能够同时负载亲水性和疏水性货物1,2。尽管具有诸多潜在优势，聚合物囊泡在临床应用中仍较为罕见，部分原因在于其制备过程中存在若干关键挑战。用于临床的聚合物囊泡制剂需要能够大规模、无菌且批次稳定地生产。

有多种技术可用于由两亲性嵌段共聚物（如聚乙二醇-嵌段-聚丙硫醚，PEG-bl-PPS）制备聚合物囊泡（polymersomes），包括溶剂分散法3、薄膜再水化法1,4、微流控技术5,6以及直接水化法7。溶剂分散法需要在有机溶剂中长时间孵育，可能导致某些生物活性载药分子（如蛋白质）变性。薄膜再水化法无法控制所形成聚合物囊泡的多分散性，通常需要昂贵且耗时的挤出工艺以获得理想的单一分散性。此外，微流控法和直接水化法在放大至大规模生产时均存在困难。在各类纳米载体制造方法中，快速纳米沉淀法（FNP）具备实现大规模、可重复制备配方的能力8,9,10。尽管FNP此前主要用于实心核纳米颗粒的制备，但本实验室近期已将其应用拓展至稳定生成多种PEG-bl-PPS纳米结构形貌11,12，包括聚合物囊泡11和双连续型纳米球12。我们发现，FNP能够在无需挤出步骤的情况下形成单一分散性的聚合物囊泡制剂，其多分散性指数显著优于通过薄膜再水化法和溶剂分散法制备的非挤出型聚合物囊泡11。而具有较大疏水区域的双连续型纳米球，尽管可在多种FNP溶剂条件下成功形成，却无法通过薄膜再水化法制备12。

此处，我们提供了PEG合成的详细描述bl-用于多泡囊形成的PPS嵌段共聚物，用于FNP的受限撞击射流（CIJ）混合器，FNP操作流程本身，以及实现自动化系统以减少操作者间差异的方法。内容还包括如何对系统进行充分灭菌以制备无内毒素制剂的信息 体内，以及关于FNP形成的聚合物囊泡表征的代表性数据。通过这些信息，对利用聚合物囊泡进行研究感兴趣的读者可 体外 和 在体内 具备相关经验的科研人员将能够利用该方法制备出无菌且单分散的制剂。熟悉纳米载体配方及聚合物合成的研究者可快速采用快速纳米沉淀法（FNP）测试其自研的聚合物体系，作为现有制剂技术的潜在替代方案。此外，本文所述实验方案亦可作为纳米技术实验课程中纳米载体配方教学的教育工具。

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方案

1. 聚乙二醇-嵌段-聚丙硫醚-硫醇的合成

  1. 合成甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯（Mn：750）（MeO-PEG17女士， 我).
    1. 溶解10 g MeO-PEG17在3颈圆底烧瓶（RBF）中，将-OH溶于200 mL 100%甲苯，在600 rpm条件下磁力搅拌。
    2. 将三颈圆底烧瓶连接至迪安-斯塔克装置，该装置再连接冷凝管，整个系统通入惰性气体（氮气或氩气）保护。
    3. 将三颈圆底烧瓶置于油浴中，在600 rpm搅拌条件下加热至165 °C。
    4. 使用共沸蒸馏除去微量水和100 mL甲苯。
    5. 将三颈圆底烧瓶从油浴中取出，在保持惰性气体条件的情况下拆下Dean-Stark装置，静置冷却至室温。
    6. 加入 5.6 mL 100% 三乙胺（3 摩尔当量）和 300 mL 无水 100% 甲苯至 MeO-PEG17在600 rpm搅拌条件下加入-OH溶液。
    7. 将三颈圆底烧瓶转移至冰浴中，保持600 rpm的搅拌速度，并维持惰性气体环境。
    8. 将3.1 mL纯甲基磺酰氯（3当量）溶于30 mL纯甲苯中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加至三颈圆底烧瓶中，同时以600 rpm速度搅拌。
    9. 在惰性条件下，室温下以600 rpm转速搅拌过夜。
    10. 通过装有硅藻土的布氏漏斗过滤溶液（参见 材料表) 以去除盐分。
    11. 使用旋转蒸发仪除去甲苯，水浴温度设为 40 °C，转速为 120 rpm，压力控制在 50–100 毫巴之间。
    12. 将产物重新溶解于200 mL 100%二氯甲烷（DCM）中，然后通过填充有硅藻土的布氏漏斗过滤（参见 材料表).
    13. 使用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，水浴温度设为 40 °C，转速为 120 rpm，压力控制在 450–600 毫巴之间。
    14. 将产物少量重新溶解于100%二氯甲烷（DCM）中，然后通过巴斯德移液管逐滴加入500 mL冰冻的100%乙醚中，缓慢析出产物。保持300 rpm搅拌。
    15. 倾析或抽滤以除去沉淀产物 MeO-PEG 中的乙醚17-甲磺酸盐，置于真空干燥器中过夜以彻底干燥。
    16. 立即使用产品，或在惰性气体环境中于 -20 °C 保存数月。
  2. 合成甲氧基聚乙二醇硫代乙酸酯（MeO-PEG17-TA, II).
    1. 溶解5 g MeO-PEG17-女士 （I） 在3口圆底烧瓶中，加入200 mL 100%无水二甲基甲酰胺（DMF），在惰性气体保护下，室温以600 rpm转速搅拌。
    2. 加入2.5 g无水碳酸钾（3摩尔当量）至搅拌溶液中。
      注意：碳酸钾在溶液中不会完全溶解。
    3. 将1.3 mL的100%硫代乙酸（3摩尔当量）溶于100 mL的100%无水DMF中，通过滴液漏斗逐滴加入溶液中。
      注意：硫代乙酸具有强烈且令人不悦的气味。所有被污染的物品在丢弃或清洗前，必须在化学通风橱内放置过夜。
    4. 在室温下剧烈搅拌（转速600 rpm或更高）过夜。
      注意：盐的形成可能容易干扰该溶液的搅拌，需小心维持整夜搅拌。
    5. 通过装有硅藻土的布氏漏斗过滤溶液（参见 材料表).
    6. 使用旋转蒸发仪去除DMF，水浴温度设为60 °C，转速为120 rpm，压力控制在5–15毫巴之间。
    7. 将产品溶解于100 mL 100%四氢呋喃（THF）中，加入装有中性氧化铝的层析柱，以去除红色/橙色杂质。
    8. 使用旋转蒸发仪去除四氢呋喃，水浴温度设为 40 °C，转速为 120 rpm，压力控制在 200–300 毫巴之间。
    9. 将产物少量重新溶于100%二氯甲烷（DCM）中。若形成盐沉淀，使用布氏漏斗通过6 μm孔径滤纸过滤溶液。
    10. 通过巴斯德移液管将产物逐滴加入500 mL冰冻的100%乙醚中，300 rpm搅拌，缓慢析出沉淀。若在4 °C下沉淀未能析出，可能需将乙醚在防爆冰箱中进一步冷却至-20 °C数小时。
    11. 倾析或抽滤以除去沉淀产物MeO-PEG17-Thioacetate中的乙醚。将产物于真空干燥器中储存过夜，随后在惰性气体保护下于-20 °C保存。
  3. 合成嵌段共聚物聚乙二醇-阻断­-聚（丙烯硫醚）-硫醇（PEG17-bl聚苯乙烯磺酸盐35-SH III).
    1. 溶解 MeO-PEG17-TA （II） 在氩气保护下，于Schlenk烧瓶中将样品溶于10 mL 100%无水DMF，室温水浴中以400 rpm转速搅拌。
    2. 加入1.1摩尔当量的甲醇钠（甲醇中0.5 M溶液），在400 rpm下搅拌5分钟。
    3. 迅速向溶液中加入35当量的100%环氧丙烷，于400 rpm转速下搅拌10分钟。
    4. 加入10摩尔当量的100%冰醋酸，于400 rpm转速下搅拌5分钟。
    5. 使用旋转蒸发仪去除DMF，水浴温度设为60 °C，转速为120 rpm，压力控制在5–15毫巴之间。
    6. 用少量100%二氯甲烷重新溶解产物，在80 mL无水甲醇中沉淀，并分装至两个50 mL锥形离心管中。
    7. 将锥形管在 4 °C 条件下以 7500 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。
    8. 储存产品，PEG17-bl-PPS35- SH，于真空干燥器中过夜，随后在惰性气体环境中置于 -20 °C 保存。

2. 通过手动驱动的快速纳米沉淀法组装PEG-bl­-PPS纳米载体

  1. （可选）对封闭式撞击射流（CIJ）混合器进行灭菌。
    1. 在生物安全柜（BSC）内，将混匀器拆解为所有部件后浸入0.1 M NaOH溶液中过夜。
    2. 重新组装CIJ混合器，并使用鲁尔锁紧注射器让无内毒素水流过。
    3. 检测水的pH值，并持续通水直至pH值显示为中性。
  2. 溶解 PEG17-bl聚苯乙烯磺酸盐35-SH 聚合物和疏水性货物在 THF 中（撞击溶液 1）。
    1. 称取 20 mg PEG17-bl聚苯乙烯磺酸盐35-SH 加入至 1.5 mL 离心管中。
    2. 加入疏水性染料（例如，DiI、ICG）、药物（例如，雷帕霉素）或其他货物。
      注意：货物可为干燥状态，或溶于与水互溶的溶剂中，优选四氢呋喃（THF）。若货物在THF或DMF中不溶，可使用其他与水互溶的溶剂，但应尽量少量，因为聚合物可能无法溶解。可装载货物的量取决于货物本身的性质（例如， 分子量、疏水性、空间位阻等因素，需根据具体情况逐一进行考察11,12.
    3. 向聚合物和货物中加入500 µL 100% THF，充分涡旋振荡以溶解。
  3. 将亲水性货物溶解于水相缓冲液（撞击溶液2）中。具体而言，将待包载于聚合物囊泡中的亲水性货物溶解于500 µL水相缓冲液中。例如， 磷酸盐缓冲液，纯水 等等。根据需要。
  4. 向储液槽中加入缓冲液。
    1. 加入2.5 mL 选定的水相缓冲液（例如， 1×磷酸盐缓冲液）加入至适当大小的储液槽中（例如， 一个20 mL玻璃闪烁瓶）。将储液器置于CIJ混合器下方，使混合器的流出液直接进入储液器。
  5. 将撞击溶液分别装入1 mL塑料一次性注射器中。
  6. 将溶液相互撞击，以同时形成纳米结构并将其装载有效载荷。
    1. 将注射器插入CIJ混合器顶部的鲁尔锁接头中。
    2. 以单一、流畅且迅速的动作，同时以相等的力度下压两个注射器。
      注意：若进行多次连续撞击，应首先将流出液收集至一个空的储液器中。
    3. （可选）进行多次冲击。将新生的纳米结构溶液分装至两个注射器中，并重复步骤 2.6.1-2.6.2 最多再进行 4 次。
    4. 在2.4.1中准备的含水缓冲液储液池中收集流出液，并轻轻搅拌以确保混合均匀。
  7. 去除未负载的货物和有机溶剂。
    1. （选项1）使用与撞击实验和储液器中相同的水相缓冲液，对纳米载体配方进行透析，透析管的截留分子量应适当，透析时间至少24小时，并至少更换缓冲液两次。该步骤可在室温下进行。
      注意：纳米载体将被截留分子量（MW）截止值的管路保留 <100,000 kDa，也可能被更高截留分子量的滤膜保留。在生物安全柜中使用无菌缓冲液操作可保持无菌状态。
    2. （选项2）通过尺寸排阻或脱盐/缓冲液置换柱过滤溶液例如， 使用1×PBS作为水相缓冲液的Sepharose 6B柱
      注意：在生物安全柜中操作时，若层析柱已彻底灭菌，则此步骤可保持无菌状态。
    3. （选项3）使用真空干燥法过夜去除挥发性有机溶剂。
    4. （选项4）使用切向流过滤系统，配备50–100 kDa滤膜，以20–60 mL/min的流速过滤15分钟至1小时，具体时间取决于需去除的未包封货物分子的分子量（分子量较大者所需时间更长）。
  8. （可选）浓缩纳米载体配方。
    1. （选项1）使用离心浓缩系统进行浓缩（例如， 具有分子量截断值的离心柱 > 100,000），按制造商说明使用。
      注意：纳米载体在离心过程中可能需要重新悬浮，并可能需要多次离心才能浓缩至目标体积。离心浓缩可能降低纳米载体制剂的无菌性。
    2. （选项2）使用真空干燥法减少体积。
      注意：在此条件下难以控制体积变化，浓缩前后需注意维持渗透压。
  9. 将纳米载体在 4 °C 下保存数周至数月。使用前，对储存后的纳米载体配方进行短暂涡旋振荡。

3. 表征纳米载体配方

  1. 测定载药效率
    1. 若载物具有荧光性，或在260–450 nm以外的特定波长处有强吸收，可使用荧光计或分光光度计测定其荧光或吸光度。
      注意：PEG-bl-PPS在260–310 nm范围内有强吸收，而多聚物囊泡（polymersome）制剂在310–450 nm范围内有吸收，这可能会干扰在相似波长处有吸收的载物的定量分析。
    2. 若载物在260–450 nm范围内有吸收且为亲水性物质，可通过将25 μL制剂加入等体积的1% H2O2或1% Triton X-100中，破坏PEG-bl-PPS纳米结构，随后使用适用于水相缓冲液的尺寸排阻色谱柱（例如 Sepharose 6B柱），通过高效液相色谱法（HPLC）分离并区分载物与聚合物的吸光度信号11。
    3. 若载物在260–450 nm范围内有吸收且可溶于THF或DMF，可将100 μL制剂于–80 °C冷冻过夜，置于1.5 mL塑料管中进行冻干。随后将管子放入玻璃真空容器中，并置于冻干机上。冻干过程持续24小时，完成后将样品重新溶解于50 μL DMF或THF中，再进行HPLC分离与检测。
  2. 测定纳米载体的粒径与形貌
    1. 采用动态光散射（DLS）11或纳米颗粒追踪分析技术13测定纳米载体的粒径。
      注意：由PEG17-bl-PPS35-SH形成的纳米载体预期平均直径为100–200 nm，多分散指数< 0.3。
    2. 采用冷冻透射电子显微镜（cryoTEM）14确定纳米载体的形貌。
      注意：由PEG17-bl-PPS35-SH形成的纳米载体预期为具有明显可辨的聚合物膜和大致球形结构的聚合物囊泡（polymersomes）。
  3. （可选）检测制剂中的内毒素
    1. （选项1）采用基于细胞的检测方法检测内毒素的存在，例如 RAW Blue细胞或HEK Blue TLR4细胞（参见材料表），按照制造商说明进行定量或定性检测脂多糖（LPS）13。
    2. （选项2）按照制造商说明使用鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）15检测试剂盒进行检测。

4. 用于 FNP 的高速注射泵的制备

  1. 制造定制化仪器部件。
    注：所有定制部件的加工用3D模型见补充材料。
    1. 使用 ¾ 英寸丙烯酸板加工多层仪器机箱并进行组装（参见 补充文件 1-5).
      注意：亚克力材料的耐化学性较差。若仪器需与强腐蚀性溶剂接触，请选用适合该应用的金属材料加工底座。
    2. 使用聚乳酸（PLA）塑料3D打印部件。
      1. 打印注射器排出（SE）两部分装置：SE 第1部分 - 后部FNP块固定滑座（图 5F，灰色部分； 补充文件 6）和SE第二部分 - 前部排出导引（图5F，黑色部分； 补充文件 7）。参见 补充文件 2 用于示意图。
      2. 打印红外传感器支架（图 5I，黑色方框； 补充文件 8 和 9).
      3. （可选）打印双注射器推杆支架。
  2. 使用M5六角螺栓将仪器底盘各层固定在一起，并在底部安装橡胶脚垫。
  3. 配置搭载 Raspbian GNU/Linux 8.0（Jessie）操作系统的单板计算机（基于 Linux Debian）。
    注意：仪器操作软件可应要求提供。仪器软件源代码可应要求提供。收到压缩文件后，请下载 README 文件中指定的所有依赖项。该软件包含一个简单的图形用户界面，可实现对仪器操作的控制，包括基本运行参数（电机速度、方向， 等等。）。鼓励用户在现有源代码基础上进行扩展，编写适用于自身实验的自定义模块。所有软件均使用 Python 2.7.12 编写，目前与 Python 3 不兼容。程序调用了 RPi、PicoBorgRev、kivy 和 multiprocessing 模块。README 文件中包含有关软件分发许可的详细信息。
  4. 安装一个24 V有刷直流电机（图5A）和精密滑台（4.5英寸（114.3毫米）行程；1.27毫米丝杠导程）（图 5C).
    注意：此处使用的24 V直流电机具有RPM最大值，我最大值，满载转矩分别为 4,252 RPM、4.83 A 和 ~0.2 N*m。
    1. （可选）在电机下方放置垫片，以减少运行过程中的振动。
      注意：建议将一块2-3 mm厚的橡胶垫裁剪至与仪器底座的电机滑块尺寸相匹配。
    2. 将精密载物台安装到仪器底座上。
      1. 暂时取下螺纹杆。
      2. 使用两个#8-32平头机械螺钉安装载物台。
    3. 使用带有6/16英寸和1/4英寸直径孔的螺钉梁联轴器（长度1-1/4英寸），将直流电机安装到精密滑轨上。
      注意：根据用于加工仪器底座层的亚克力材料厚度，可能需要使用垫片来调平电机和精密滑动轴。
  5. 使用金属板和L形角撑板组装排出平台（图5D)。使用 #6-32 螺丝将基底金属平台安装到滑动平台（连接至螺纹杆）上。有关安装约束的详细信息，请参见制造商提供的精密滑轨示意图。
  6. 组装注射器排液系统装置。
    1. 将直线运动导轨滑块（安装平台+直线运动轴承）安装到M8镀铬不锈钢导轨上（平行钢制导轨可明显观察到 图5).
    2. 将导轨穿过直线轴导轨/支撑件并锁定导轨。每根导轨使用三个导轨支撑。使用M4机械螺钉将SE部件1和2安装到轴承座上。
    3. 用M8六角螺栓松散连接SE部件1和2。在SE部件1与2之间安装螺旋压缩弹簧，每个螺栓均覆盖一个弹簧，并由两件相对安装的尼龙衬套固定（参见 图5F将这些衬套安装在SE部件1和SE部件2的外侧。
  7. 导线电路（参见 图6 用于核心接线图）
    1. 将电机控制器连接到单板计算机的 I2C/SDA、3.3 V 和 GND 引脚。
    2. 将直流电机的端子连接到电机控制器板的 M- 和 M+ 接线端。连接 24 V、2.5 A 电源图5B) 连接到电机控制器的 V+ 和 GND 接线端（在最终设计中，控制器封装于一个简单的电子设备盒内，参见 图 5H).
    3. 将电机控制板的3V3和5V引脚分别连接到单板计算机的对应引脚。将电机控制器的SDA和SCL引脚分别连接到单板计算机的第3和第5引脚。
      注意：单板计算机通过电机控制器向直流电机发送指令。电机转速通过脉宽调制调节电机端子间的电压进行控制。在此装置中，24 V 直流电机（满载电流：4.83 A）的最大运行电流由 24 V 电源限制为 2.5 A。建议将电机电路连接至一个常闭（NC）紧急停止开关。图5J这样做可中断电机电路，实现基本的紧急关断操作。
    4. 连接前部和后部红外接近传感器（数字距离传感器， 图 5I分别连接到 RPi 的 GPIO 引脚 24 和 23。
      1. 将传感器线路经由导管穿入仪器底座。
        注意：红外传感器为非接触式对射型运动传感器，检测范围为2-10 cm。
      2. 4.7.4.2 将有线红外传感器卡入3D打印的红外传感器支架中（图 5I，黑色盒子）并安装到仪器底座上。当正确安装至支架时，传感器表面应从支架的14 mm × 7 mm矩形开口向外突出。
        注意：可使用魔术贴或粘合剂临时安装这些传感器支架（临时安装有助于适当调整和优化红外传感器的位置）。或者，也可通过在仪器底座上钻小的导向孔，并使用M2螺丝固定支架，实现永久性安装。
    5. 将一块7英寸触摸屏LCD显示屏连接到单板计算机的5V、GND以及显示串行接口（DSI）引脚。7英寸RPi与LCD显示屏组件如图所示 图 5G.

5. 使用定制的高速注射泵通过FNP制备聚合物囊泡

  1. （选项1）使用自动运行模式。
    1. 选择 自动运行 从主菜单中选择。系统将提示用户允许电机自动将注射器推注平台移至精密滑轨的起始位置。在继续操作前，请确保金属板前后路径无障碍物。
    2. 按照第2.5节所述方法装载1 mL塑料注射器，并将注射器安装至CIJ混合器的雌性鲁尔接头。将CIJ混合器（已连接注射器）装入后部挤出滑车的矩形开口中（参见 图5E).
    3. 使用图形用户界面（GUI）中的滑块设置所需的电机转速（单位：rpm）（见下文注意事项）。最佳电机转速取决于具体的泵和实验装置，但必须确保达到至少 1 mL/s 的流速，以适用于此处提供的 CIJ 混合器通道尺寸。
      注意：设定流速时请考虑以下事项。在垂直手动操作的FNP装置中，反应物以约1 mL/s的流速从注射器中排出，但手动驱动时流速可能变化较大。此流速仅为通过注射器筒的流速，由操作者推动注射器活塞的速率所控制。需注意，1 mL/s的流速是 不 指较小直径喷嘴的出口流速。在上述指定的通道尺寸下，应保持约1 mL/s的流速，以确保雷诺数适宜，实现湍流混合。10不同的流速均可使用，只要相应调整通道直径，以维持支持湍流条件的雷诺数。注射器推杆由一块垂直金属板推动，该金属板沿与24 V有刷直流电机耦合的高精度铝制滑轨移动。在此配置下，筒体流速的最大值受多种因素影响，包括：（1）电机最大转速（4,252 rpm）以及与电机轴耦合的精密滑轨的丝杠导程（1.27 mm）；（2）电机扭矩（满载扭矩约0.2 N·m），用于克服流动阻力；（3）流体进入和离开CIJ混合器时产生的背压；（4）所用注射器的强度（使用者应考虑作用在注射器上的力，并选用强度合适的注射器）。关于第（2）点，当提高流速时，需有足够的扭矩以避免电机失速，同时在背压增加的情况下维持稳定的液体排出。为说明该系统可实现的筒体流速，以将反应物装载至两个1 mL注射器中进行FNP为例：若要实现1 mL/s的筒体流速，电机需在1秒内将金属板推进相当于推杆行程的距离（典型1 mL注射器约为68 mm）。鉴于精密滑轨的丝杠导程为1.27 mm，可推知运行于4,252 rpm的直流电机可使平台推进速度最高达约90 mm/s（71转/秒 × 1.27 mm/转），对应筒体流速约为1.3 mL/s，超过1 mL/s的目标流速。
    4. 在运行仪器之前，检查系统以确保平台运行路径上无障碍物，且前后红外线接近传感器上无任何遮挡（红外传感器是位于精密滑轨端部附近的小型黑色盒子；参见 图 5I）。同时确保CIJ混合器的毛细管出口通向合适的收集容器（例如：玻璃烧杯， 等等。).
    5. 将反应物从注射器中排出并注入CIJ混合器时，按压 运行 软件界面中的按钮
  2. （选项2）使用手动运行模式。参考 自动运行模式 上述步骤，并注意第5.1.5步的以下更改：持续按住前进按钮直至运行完成（即， 平台在按下事件触发时前进，电机在释放事件触发时停止。
  3. （选项3）使用手动平台定位模式；该模式允许用户通过软件界面上的前进和后退按钮，以低速（20%功率）运行电机来调节平台位置。

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结果

在此，我们介绍了一种简单的纳米载体配制方案，该载体可同时负载亲水性和疏水性货物，且具有良好的生物安全性 体内 小鼠与非人灵长类动物给药11,13我们还提供了用于代表性结果的聚合物合成的详细方案，以及用于CIJ混合器中机械控制溶液撞击的定制仪器的制作方法描述。 图1 概述了用于制备聚乙二醇（PEG）的合成步骤17-bl-PPS35-SH，用于自组装聚合物囊泡纳米载体的二嵌段共聚物。PEG-b-PPS 聚合物囊泡负载治疗剂和/或成像剂的 FNP 制备流程示意图如下所示 图2聚合物在CIJ混合器中发生撞击（示意图如所示） 图3a，最初描述于 10）以形成单一分...

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讨论

我们提供了利用PEG快速制备聚合物囊泡的详细操作步骤17-bl聚苯乙烯磺酸盐35-SH 作为二嵌段共聚物。在此亲水性 PEG 与疏水性 PPS 嵌段分子量比例下，主要形成的聚集体形态为囊泡状的聚合物囊泡（polymersomes）。经多次冲击后，其直径和多分散性与通过 200 nm 膜挤出后形成的聚合物囊泡相当。 通过 薄膜水化法。因此，该方案在制备单分散聚合物囊泡纳米载体时无需额外的挤出步骤。所形成的聚合物囊泡 通过 FNP 可同时负载亲水性和疏水性货物，并在制剂过程中保持这些分子的生物活性11. 必要时可采用额外的无菌操作方案，以确保无内毒素的多泡体（polymersome）制剂的制备，从而适用于生物化学与免疫学检测，并确保可安全用于给药 体内手动操作的CIJ混合器结构简单，易于用户使用，但由于操作者之间的差异性，可能引入质量控制问题。为了保持流体流动的一致性，我们致力于开发一种能够达到并可重复维持相近流速的仪器。重要的是，在上述指定的通道尺寸下，商用注射泵由于配备低速步...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢西北大学结构生物学设施的工作人员和仪器支持。感谢西北大学罗伯特·H·卢里综合癌症中心和西北大学结构生物学设施提供的支持。Gatan K2 直接电子探测器的购置资金来自芝加哥生物医学联盟，并得到芝加哥社区信托基金的Searle基金支持。我们还感谢西北大学以下设施：凯克跨学科表面科学设施、结构生物学设施、生物成像设施、先进分子成像中心以及分析生物纳米技术设备核心。本研究得到了美国国家科学基金会资助项目（编号1453576）、美国国立卫生研究院院长新创新者奖（1DP2HL132390-01）、再生纳米医学中心催化剂奖以及2014年麦考密克催化剂奖的支持。SDA 部分得到了美国国立卫生研究院博士前生物技术培训基金 T32GM008449 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CanaKit Raspberry Pi 3 终极入门套件 - 32 GB 版本CanaKitUPC 682710991511
线性轴承平台（小型）- 8 mm 直径Adafruit1179
线性运动轴，8 mm 直径，330 mm 长度，镀铬，表面硬化，公制VXBkit11868
线性导轨轴支撑/导引件 - 8 mm 直径Adafruit1182
手动定位精密滑台，4.5" 行程，15 lb 负载能力McMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse 直流电机Iron HorseMTPM-P10-1JK43
官方 Raspberry Pi 基金会 7" 触摸屏 LCD 显示器Raspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - 用于 Raspberry Pi 的高级电机控制器PiBorgBURN-0011
Pololu 载板，含 Sharp GP2Y0D810Z0F 数字距离传感器，10 cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A 内六角螺钉梁式联轴器，抛光铝材质，英制，A 孔径 5/16"，B 孔径 1/4"，外径 1"，长度 1-1/4"，额定扭矩 44 lb-inRulandPSR16-5-4-A
聚乙二醇单甲醚Sigma Aldrich202495
甲磺酰氯Sigma Aldrich471259
甲苯Sigma Aldrich179418
无水甲苯Sigma Aldrich244511
三乙胺Sigma AldrichT0886
Celite 545（硅藻土）Sigma Aldrich419931
二氯甲烷Sigma Aldrich320269
乙醚Sigma Aldrich296082
N,N-二甲基甲酰胺，无水Sigma Aldrich227056
碳酸钾Sigma Aldrich791776
硫代乙酸Sigma AldrichT30805
四氢呋喃Sigma Aldrich360589
氧化铝，中性，活化，Brockmann I 级Sigma Aldrich199974
甲醇钠溶液，0.5 M 甲醇溶液Sigma Aldrich403067
环氧丙硫烷Sigma AldrichP53209
乙酸Sigma AldrichA6283
甲醇Sigma Aldrich320390
氢氧化钠溶液，1.0 NSigma AldrichS2770
无内毒素水GE Healthcare Life SciencesSH30529.01
纸质 pH 试纸Fisher Scientific13-640-508
无内毒素 Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
硼硅酸盐玻璃闪烁小瓶Fisher Scientific03-337-4
1 mL 全塑料注射器Thermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
液相色谱柱Sigma AldrichC4169
CIJ 混合器，HDPE 材质Custom
Triton X-100Sigma AldrichX100
过氧化氢溶液Sigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue 细胞InvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT 凝胶法 LAL 检测试剂盒LonzaN183-125

参考文献

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通过闪速纳米沉淀法快速、可放大的生物活性蛋白和免疫刺激剂组装与装载至多种合成纳米载体
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