卵巢组织培养可作为卵泡发育、排卵和卵泡闭锁的模型，并揭示动态卵巢过程的调控机制。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物雌性在每个动情周期中会周期性地排出数量几乎恒定的卵母细胞。为了维持这种规律性和周期性，调节作用发生在下丘脑-垂体-性腺轴水平以及卵巢中发育中的卵泡上。尽管已有大量研究，但由于卵泡发育涉及从静息的原始卵泡激活到排卵的多个阶段，且每个卵泡发育阶段的调控机制各不相同，其发育机制仍不明确。为了研究卵泡发育的机制以及卵泡在整个动情周期中的动态变化，我们建立了一种可用于在显微镜下观察卵泡发育的小鼠卵巢组织培养模型。在该培养卵巢模型中，可重现系统的卵泡发育、周期性排卵以及卵泡闭锁过程，并且培养条件可进行实验性调控。本文展示了该方法在研究卵泡发育调控机制及其他卵巢现象中的应用价值。
引言
雌性小鼠的卵巢中含有数千个卵泡1，每个动情周期通过周期性排卵可使约十个卵母细胞成熟。根据包裹每个卵母细胞的颗粒细胞层的形态，卵泡可分为多个发育阶段：原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、腔前卵泡和格拉夫卵泡。大多数原始卵泡处于静息状态，而在每个动情周期中，其中一部分会被激活并发育为初级卵泡2。次级卵泡阶段之后，卵泡的发育主要受促性腺激素，即卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）的调控。然而，原始卵泡和初级卵泡的发育不依赖于促性腺激素，这些阶段的调控机制至今仍不清楚3,4,5。除了生长因子和激素外，原始卵泡和初级卵泡的发育还受到卵泡之间相互作用的调控6,7。因此，我们对小鼠卵巢组织中的卵泡动态进行了分析，并利用卵巢组织培养系统研究了相关的调控机制8,9,10。
本文介绍了两种卵巢组织培养模型方法。第一种用于通过测量卵泡面积来分析卵泡发育，第二种则利用转基因小鼠研究从原始卵泡到次级卵泡阶段早期卵泡发育过程中的调控机制。在卵泡发育分析中，我们主要采用4周龄雌性小鼠的卵巢，因其卵泡易于观察。为诱导周期性排卵并建立模型 体内 卵泡发育，我们模拟了黄体生成素（LH）激增，并在组织培养条件下观察到排卵、卵泡闭锁以及雌二醇的分泌。通过采集培养卵巢的图像，并追踪卵泡面积的变化来分析卵泡发育过程。然而，在明场显微镜分析中，原始卵泡与早期初级卵泡之间的区分并不清晰。因此，我们建立了一种方法，用于检测培养卵巢组织中的小型卵泡，并区分其中的原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡 Oogenesin1 (Oog1) pro39 和 R26-H2B-mCherry 出生后第0天和第4天的转基因小鼠卵巢11. Oog1 表达在卵母细胞进入减数分裂后即可检测到，并随着卵泡发育逐渐增强，因而可通过培养卵巢组织的延时成像观察原始卵泡向初级卵泡的转变过程11,12尽管形态学方法已被用于研究激活静止原始卵泡的因素13,14,15,16，卵巢中生理性卵泡发育难以观察，各种因素的作用尚不明确。现有的培养方法旨在弥补对目标因子进行实时分析的不足。
在本研究中，我们采用延时成像方法追踪卵泡发育，并对卵泡发育过程进行了表征。我们的新型方法为研究卵巢生理学提供了前所未有的工具。
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方案
小鼠饲养在环境受控的房间内，温度为 23 ±1 °C，光照/黑暗周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。动物护理方案和实验均依照爱知医科大学动物实验指南进行，并经现任动物护理与使用委员会批准。
1. 培养基与培养皿的准备
- 制备基础培养基时，向最低必需培养基α（MEM-alpha）中加入胎牛血清（FBS，5% v/v）、促卵泡激素（FSH，100 mIU/mL）、黄体生成素（LH，10 mU/mL）以及青霉素-链霉素溶液（青霉素，100 U/mL；链霉素，100 mg/mL），在50 mL离心管中混匀。
注意：不同实验所需的培养基总体积可能不同，但通常每3.5 cm玻底培养皿使用1 mL培养基即可。 - 将混合好的培养基按每份1 mL分装至3.5 cm玻底培养皿中，并将30 mm细胞培养插入式小室放入培养皿内。将培养基和培养皿置于培养箱中预热（5% CO2，37 °C）。
2. 卵巢组织的制备
- 在培养箱（5% CO2，37 °C）中预热磷酸盐缓冲液（PBS）（−）以及含5% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的MEM-alpha培养基。
注：每枚卵巢使用约3 mL PBS（−）足以满足卵巢解剖过程中的需求，每枚卵巢使用1 mL MEM-alpha培养基足以在3.5 cm培养皿中临时存放单个卵巢。 - 从4周龄雌性ICR（源自癌症研究所，Institute of Cancer Research）小鼠中切除卵巢，并在体视显微镜下使用剪刀和镊子去除卵巢周围组织。将取出的卵巢保存于培养基中（见步骤2.1），待用。
- 将单个卵巢置于用预热PBS（−）（见步骤2.1）润湿的滤纸上，在体视显微镜下用切片刀将其切成4片。
注：4周龄ICR小鼠的卵巢直径约为2 mm。切片数量取决于卵巢大小；但切为约500 µm厚的组织片可便于充分观察卵泡（厚于500 µm时组织透明度降低；薄于500 µm时许多有腔卵泡会破裂并丢失）。 - 解剖完成后，将切好的卵巢样本放入盛有预热培养基的3.5 cm培养皿中（见步骤2.1）。
- 将单个卵巢置于用预热PBS（−）（见步骤2.1）润湿的滤纸上，在体视显微镜下用切片刀将其切成4片。
3. 卵巢组织培养
- 使用移液器将约 0.5 µL 培养基滴加到细胞培养插件上的卵巢组织切片处，卵巢组织将被放置于此处。
- 用镊子将每一片卵巢组织切片放入细胞培养插件上的一滴培养基中。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下培养卵巢组织。
- 每隔 2 天更换一次新鲜的预温培养基。
注意：4 周龄 ICR 小鼠卵巢切片培养的培养基更换时间表见图 1。- 为模拟 LH 峰值，每隔 4 天用含有 100 mU/mL FSH 和 LH 的培养基处理培养的 4 周龄 ICR 小鼠卵巢 12 小时（图 1）。
4. 培养卵巢的显微镜图像
- 在组织贴附于细胞培养插件后的第1天开始对培养的卵巢进行成像，并以24小时为间隔进行共聚焦显微镜或倒置显微镜分析，以便在各时间点之间留出足够的卵泡生长时间。
注意：对于观察整体培养卵巢中的卵泡，共聚焦显微镜优于倒置显微镜。
5. 培养卵巢的延时成像
- 优化延时成像条件，包括成像系统的激光强度和曝光时间（表1）。
- 从单只小鼠中选取配对的卵巢样本，分别用于处理组和对照组。调整激光强度和曝光时间，以获得最佳图像（表1）。
- 通过在24小时时间间隔下测量对照样本图像中的卵泡面积以及延时成像样本中的卵泡面积（见步骤6），比较不同培养条件下卵泡的生长情况。同时，统计每组卵巢中排卵的卵母细胞数量，并确定最佳的延时成像条件。
- 在已确定的条件下，使用延时成像系统以每30分钟一次的频率采集图像（表1）。
6. 卵泡生长分析
- 使用 ImageJ 软件（http://resbweb.nih.gov/ij/）测量所获图像中的卵泡面积，以分析卵泡发育情况。
- 首先，通过点击设置图像的尺度 "设定比例尺" 下 "分析" 在工具栏中。在空白字段中输入所捕获图像的边长及其对应的像素数量 "已知距离" 和 "像素距离"分别。
- 点击 "徒手" 在工具栏中勾画出所捕获明场图像中的卵泡轮廓。
- 点击 "测量" 在……下方 "分析" 在工具栏中。
注意：如果需要其他测量数据，请单击 "设置测量" 在……下方 "分析" 在工具栏中，勾选列表中的相应选项。
7. 利用转基因小鼠分析卵泡发育
- 取出生后第0天和第4天（P0和P4）携带Oog1pro3.9和R26-H2B-mCherr转基因的雌性转基因小鼠的卵巢，按步骤1.1–3.2所述方法在插入式培养器中进行培养，但不要对P0和P4卵巢进行切片。
- 每2天在37 °C、含5% CO2的培养箱中，用新鲜预热的培养基更换3.5 cm培养皿中的原培养基。
注：P0和P4小鼠卵巢的培养基中促黄体生成素（LH）浓度可保持恒定，因为P0和P4小鼠不会出现LH激增。 - 设置显微镜，仅观察培养的P4卵巢中AcGFP1阳性的初级卵泡（表1）。
注：P4雌性小鼠卵巢中仅存在原始卵泡和初级卵泡。 - 使用与P4卵巢相同的成像参数（见步骤5.2），以每30分钟一次的频率采集培养的P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry转基因小鼠卵巢的图像。
- 利用AcGFP1和H2B-mCherry信号追踪并分析卵泡发育过程。
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结果
图1 展示卵巢组织培养过程中培养基更换的实验方案。按照该方案，将4周龄ICR小鼠的卵巢进行体外培养，并利用共聚焦显微镜以24小时为间隔进行成像观察图2）。在卵巢组织培养3周期间，大多数窦状卵泡和次级卵泡通过卵泡闭锁发生退化，部分卵泡发生排卵（图2D 和 表2）。使用 ImageJ 分析卵泡面积时（图3），在每次LH激增周期中，部分卵泡成簇发育（图3B 和 补充视频 1）。此外，单只小鼠左右两侧卵巢在分别培养的情况下，排卵几乎同时发生。然而，排卵的时间以及排出卵母细胞的数量（表 2）在小鼠卵巢之间存在差异（数据未...
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讨论
在本研究中，我们开发了两种用于研究小鼠卵巢卵泡发育的新方法。第一种方法包括培养切片的小鼠成年卵巢组织，随后分析卵泡发育情况；第二种方法则利用延时成像技术，对促性腺激素非依赖阶段的早期卵泡发育过程进行可视化观察。此前，我们曾采用现有的卵巢组织培养方法，评估了白血病抑制因子和孕酮对卵泡发育的影响8,9，并发现其作用效果随浓度和卵泡发育阶段的不同而变化。在本研究中，切片的卵巢组织表现出卵泡动态变化，表明该模型适用于进一步分析卵巢卵泡发育的机制。
5周龄以上小鼠的卵巢含有黄体，会阻碍显微观察。因此，观察卵泡发育和排卵过程时，优选4周龄小鼠的卵巢，此时晚期初级卵泡、次级卵泡和腔状卵泡在明场显微镜下更易于区分。我们的方法可用于比较培养基中生长因子和药物处理对卵泡发育的影响，经不同处理的卵巢之间卵泡发育的变化清晰可辨（图3）。
既往研究已报道了在卵母细胞中表达Cre...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢京都大学的 Naojiro Minami 博士提供了 Oog1pro3.9 小鼠。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS，KAKENHI # JP15H06275）和日东基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人垂体促卵泡激素 | SIGMA | F4021 | |
| 马垂体促黄体生成素 | SIGMA | L9773 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM α, 含GlutaMax, 不含核苷酸 | Thermo Fisher | 32561037 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-0-10-C | 35 mm 培养皿，No. 0 盖玻片，玻璃直径 10 mm |
| Millicell 细胞培养插入式培养板 | Merck Millipore | PICM0RG50 | 直径：315 mm，孔径：0.4 mm，材质：亲水性PTFE |
| 3.5 cm 细胞培养皿 | greiner bio-one | 627160 | |
| 50 ml 带三重密封盖的离心管 | IWAKI | 2345-050 | |
| 低剖面一次性刀片 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | 共聚焦显微镜 | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | 延时成像 | |
| BZ-X700 | KEYENCE | 延时成像 |
参考文献
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