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方法文章

无饲养层且无异源成分的培养条件用于生成人iPSC来源的视网膜细胞模型

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DOI：

10.3791/57795

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2018年9月6日

 ,  ,  ,  , 
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

利用多能干细胞生成特化的视网膜细胞是干细胞治疗视网膜疾病发展过程中的一个关键转折点。本文介绍了一种简单的方法，可高效地生成用于基础研究、转化研究和临床研究的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞。

摘要

由多能干细胞产生特化细胞为开发再生医学新方法提供了有力工具。在包括视网膜营养不良在内的神经退行性疾病研究中，使用人诱导性多能干细胞（iPSCs）尤其具有吸引力，其中由iPSCs衍生的视网膜细胞模型标志着理解和对抗失明的重要进展。本文描述了一种简单且可扩展的方案，用于生成、成熟及冷冻保存视网膜类器官。该方法基于培养基更换，其主要优势在于避免了iPSC定向分化过程中通常所需的多个耗时步骤。通过对贴壁培养的人iPSCs连续更换特定培养基，模拟视网膜发育的早期阶段，该方案可在4周内以可重复且高效的方式同时生成自组织的神经视网膜结构和视网膜色素上皮（RPE）细胞。这些包含视网膜前体细胞（RPCs）的结构可轻松分离，并在悬浮培养条件下进一步成熟，促使RPCs分化为成人人类视网膜中存在的七种视网膜细胞类型。此外，我们还描述了视网膜类器官和RPE细胞快速冷冻保存的方法，适用于长期储存。综上所述，本文所述方法将有助于生成和储存人iPSC来源的视网膜细胞或组织，服务于基础研究和临床研究。

引言

视网膜是中枢神经系统（CNS）的重要组成部分，其在遭受创伤性损伤或疾病后自发再生的能力极为有限。因此，由年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）、青光眼和糖尿病性视网膜病变等退行性疾病导致的视网膜细胞不可逆性丧失，通常会引起永久性失明。挽救退化的视网膜是一项重大挑战，其中以干细胞为基础、旨在替代受损或丢失细胞的治疗策略，是目前最具前景的方法之一1,2,3多能干细胞，如人胚胎干细胞（ESCs）或人诱导多能干细胞（iPSCs），可在体外培养中无限扩增，并具有分化为任何细胞类型的潜能。随着对视网膜发育机制的理解不断深入以及培养技术的改进 体外 人类iPSC分化方案已成功生成视网膜类器官7,8,9,10,11,12所有主要的视网膜细胞，包括视网膜神经节细胞（RGCs）、光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞，均已成功从人胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）分化获得。4,5,6基于Eiraku开发的SFEB法（拟胚体样聚集体的无血清培养法） 等13，视网膜类器官可通过源自胚胎干细胞或诱导多能干细胞的类胚体聚集体在特定的细胞外基质成分中实现自我形成7,10,14但这些方案较为复杂，涉及大量步骤，往往难以与用于治疗策略或药物筛选的大规模细胞生产相兼容。因此，选择生成人类视网膜细胞的方法至关重要，该方法必须具有稳健性、可扩展性和高效性。

此处基于我们之前发表的研究15我们描述了一种简单且高效的方法，通过贴壁培养的无饲养层、无异源成分条件下培养的人诱导多能干细胞（human iPSCs）自发形成视网膜类器官，从而生成视网膜细胞的每一步操作。该方案从常规贴壁培养的人iPSCs出发，仅需连续更换培养基，即可在4周内同时获得iPS细胞来源的视网膜色素上皮（hiRPE）细胞和神经视网膜结构。经过手动分离后，hiRPE可进一步扩增，而视网膜结构则可作为悬浮类器官继续培养，其中视网膜前体细胞能够按照与体内发育一致的时序逐步分化为所有类型的视网膜细胞。 体内 人类视网膜发生。最后，为了推动研究进展或实现临床转化，我们描述了一种冷冻保存方法，可在不影响全层视网膜类器官和人诱导视网膜色素上皮细胞表型特征和功能特性的前提下，实现其长期储存。

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方案

本文所述方案遵循视觉研究所研究伦理委员会的指导方针。根据现行法国法规，视觉研究所获准进行人体样本的操作。在获得伦理批准后，样本处理遵循《赫尔辛基宣言》原则以及国家关于患者数据保护的相关规定。 "法兰西岛第五地区保护人员委员会 (CPP)".

1. 培养基和培养皿的准备

  1. 培养基
    1. 使用iPSC培养基，即专为无饲养层条件下培养多能干细胞而设计的化学成分明确的培养基16。根据生产商说明书配制500 mL培养基。
    2. 使用基础iPSC（Bi）培养基，即不含成纤维细胞生长因子2（FGF2）或转化生长因子β（TGFß）的iPSC化学成分明确培养基。
    3. 配制500 mL Bi培养基，并添加1% N2补充剂（BiN2培养基）、10单位/mL青霉素和10 mg/mL链霉素。
    4. 配制500 mL以N2为基础的前神经培养基（ProN2培养基），其成分为DMEM:营养混合物F-12（DMEM/F12，1:1，含L-谷氨酰胺）、1% MEM非必需氨基酸、1% N2补充剂、10单位/mL青霉素和10 mg/mL链霉素。
    5. 配制以B27为基础的前神经培养基（ProB27培养基），其成分为DMEM:营养混合物F-12（DMEM/F12，1:1，含L-谷氨酰胺）、1% MEM非必需氨基酸、2% B27补充剂、10单位/mL青霉素和10 mg/mL链霉素。
  2. 培养容器的准备
    1. 用于人iPSC培养
      1. 配制10 mL含5 μg/mL玻连蛋白的1×PBS溶液。在10 mL 1×PBS中加入100 µL解冻后的玻连蛋白储备液（100×）。
      2. 每6 cm培养皿加入2 mL玻连蛋白溶液，相当于0.5 µg/cm2。室温（RT）孵育1小时。使用真空抽吸系统或5 mL移液器吸除玻连蛋白溶液。
      3. 每6 cm培养皿加入4 mL iPSC培养基。
      4. 将培养皿置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中，至少预孵育30分钟后再使用。
    2. 用于人iPSC来源的视网膜色素上皮（hiRPE）细胞培养
    3. 根据生产商说明书，使用符合多能干细胞培养标准的基质或包被材料对孔板进行包被。加入足量基质或包被材料以完全覆盖整个生长表面。例如，在24孔板中每孔加入300 µL基质，在T-25 cm2培养瓶中加入3 mL基质。
    4. 将包被后的培养容器在37 °C孵育至少1小时。使用真空抽吸系统或5 mL移液器去除基质。
    5. 在24孔板中每孔加入1 mL ProN2培养基，并将培养容器放回培养箱中至少预温30分钟，使培养基达到平衡温度。对于T-25 cm2培养瓶，参见步骤5.2。

2. 人类诱导多能干细胞的维持与扩增

  1. 人诱导多能干细胞（iPSC）的维持
    1. 在15 mL离心管中准备3 mL iPSC培养基，使用前于室温（RT）放置至少15分钟。按照步骤1.2.1所述准备包被的6 cm培养皿。
    2. 将保存于液氮罐或-150 °C冰箱中的人iPSC冷冻样本在37 °C水浴中孵育30秒以解冻。
    3. 使用消毒剂喷雾仔细消毒冷冻管。将解冻后的人iPSC从冻存管转移至含有3 mL室温预热iPSC培养基的15 mL离心管中。
    4. 以110 × g离心3分钟。使用真空抽吸系统或5 mL移液器吸除上清液。
    5. 用2 mL移液器将细胞沉淀重悬于来自纤连蛋白包被的6 cm培养皿中的1 mL iPSC培养基中，并将细胞转移回该培养皿。将培养皿放回37 °C、5% CO2的培养箱中，至少培养24小时后再更换培养基。
      注：可在6 cm培养皿的iPSC培养基中添加ROCK抑制剂（如10 µM Y-27632），以减少细胞凋亡。
    6. 每日更换培养基，并每周传代一次人iPSC。
  2. 人iPSC的传代
    1. 当人iPSC融合度达到70–80%时进行传代，通常在培养7天后进行。
    2. 按照步骤1.2.1所述准备6 cm培养皿。吸除长满iPSC的培养皿中的培养基，加入2 mL解离溶液，在室温下孵育6分钟。
      注：孵育时间取决于iPSC克隆类型，可先尝试6分钟。
    3. 使用真空抽吸系统或5 mL移液器去除解离溶液，加入2 mL室温预热的iPSC培养基。用1,000 µL移液器轻轻吹打5–10次，使iPSC集落重悬。
      注意：避免因过度吹打导致单细胞过度解离。
    4. 将30至200 µL重悬的细胞团块转移至新的6 cm培养皿中。将培养皿放回37 °C、5% CO2的细胞培养箱中，至少培养24小时后再更换培养基。
      注：传代所需重悬细胞团块的体积取决于iPSC克隆类型。
    5. 每日更换培养基，并每周传代一次人iPSC。

3. 视网膜类器官的生成

  1. 当细胞集落达到60 - 70%融合度时，按照图1A所示方案开始iPSC分化（图1B）。
  2. 每6 cm培养皿准备4 mL Bi培养基，将Bi培养基预热至37 °C，更换iPSC原有培养基为Bi培养基，并将此时间记为第0天（D0）。
  3. 在第2天（D2），将培养体系中的Bi培养基更换为预先加热至37 °C的BiN2培养基，此后每2 - 3天更换一次培养基。
  4. 通过神经外胚层芽体识别自发形成的视网膜类器官，如图1C - 1E所示。
    注意：这些早期视网膜类器官在发育阶段上对应于视杯结构，可手动分离用于后续实验。

4. 视网膜类器官的成熟

  1. 在第28天，准备6孔板，每孔加入4 mL最初添加了10 ng/mL FGF2的ProB27培养基（图1A）。
    注意：在将培养基加入孔板前立即添加FGF2。
    警告：切勿对FGF2进行过滤。
  2. 手动从6 cm培养皿中回收视网膜结构。操作时，用针头在神经上皮芽周围做垂直划痕，如图1E所示，分离出结构，并轻轻刮擦以脱离类器官。
  3. 使用1,000 µL移液器吸取10–15个类器官，转移至含有ProB27培养基的6孔板中的单个孔内。
  4. 将视网膜类器官置于含ProB27培养基的悬浮培养条件下，在37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中培养。每2–3天更换一半培养基。
    注意：持续用FGF2处理类器官至第35天。
  5. 在第35天，移除一半培养基，并加入预热至37 °C的新鲜ProB27培养基，不含FGF2。
  6. 根据视网膜细胞类型的出现情况（如图2所示），在获得所需视网膜细胞类型所需的时间内，每2–3天更换一半培养基。

5. 人iPSC来源的RPE（hiRPE）细胞的生成与扩增

  1. 人源 hiRPE 细胞的生成
    1. 当 iPSC 克隆达到 60 - 70% 汇合度时，按照 图 3A 所示方案启动其向 hiRPE 细胞的分化。
    2. 每 6 cm 培养皿准备 4 mL Bi 培养基，并将 Bi 培养基在 37 °C 预热。将 iPSC 培养基更换为 Bi 培养基。将此时间记为第 0 天（D0）。
    3. 在 D2 时，将 Bi 培养基中的培养物更换为已在 37 °C 预热的 BiN2 培养基。每 2 - 3 天更换一次培养基。
    4. 在 D28 时，更换为已在 37 °C 预热的新鲜 ProN2 培养基，如 图 3A 所示。
      注意：此步骤可在第 4 步所述类器官挑选操作之后进行。
    5. 每 2 - 3 天更换一次 ProN2 培养基。
    6. 在 D42 时，通过观察色素沉着区域来识别出现的 hiRPE 细胞，如 图 3B 所示。
      注意：hiRPE 细胞的色素沉着通常在 D35 至 D56 之间出现，具体时间取决于 iPSC 克隆。
  2. hiRPE 细胞的扩增
    1. 在 D42 时，准备已按步骤 1.2.2 所述用基质包被的 24 孔板，每孔加入 1 mL ProN2 培养基。使用前将该板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 15 分钟。
    2. 手动从 6 cm 培养皿中回收 hiRPE 色素区域。为分离这些区域，用针头在色素上皮周围做垂直划线，并轻轻刮擦以脱离细胞片。使用 1,000 µL 移液器吸取 10 个色素区域，转移至 24 孔板的一个孔中。
    3. 将 hiRPE 色素区域置于 ProN2 培养基中，在 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中培养 48 小时后再更换培养基。将此次 hiRPE 细胞传代记为第 0 代（hiRPEp0）。每 2 - 3 天使用 ProN2 培养基更换一次培养基。
    4. 当 hiRPEp0 细胞达到汇合状态时进行传代。
      1. 使用真空抽吸系统移除培养基，并用 5 mL 移液器每孔加入 1 mL PBS 洗涤一次。
      2. 使用真空抽吸系统弃去 PBS，每孔加入 200 µL 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 培养箱中孵育至少 15 分钟。加入 800 µL ProB27 培养基以终止胰蛋白酶活性。
        注意：不建议使用 ProN2 培养基终止胰蛋白酶活性。
      3. 通过移液吹打使 hiRPE 细胞片解离。将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 110 × g 条件下离心 5 分钟。
        注意：可额外使用 ProN2 培养基洗涤一次，以去除残留的 ProB27 培养基。
      4. 弃去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于 2 mL 已在 37 °C 预热的 ProN2 培养基中。使用细胞计数仪进行细胞计数。
      5. 取 125 万个细胞，接种至已包被基质的 T-25 cm2 培养瓶（见步骤 2.2.2），瓶中含 5 mL 已在 37 °C 预热的 ProN2 培养基。将此次 hiRPE 细胞传代记为第 1 代（hiRPEp1）。
    5. 将 hiRPE 细胞置于 ProN2 培养基中，在 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中培养 48 小时后再更换培养基。
    6. 每 2 - 3 天更换一次培养基。当 hiRPEp1 细胞达到汇合状态时，进行下一次传代或冻存。

6. 视网膜类器官和hiRPE细胞的冷冻保存

  1. 对于整个视网膜类器官
    1. 使用转移移液管选取5至20个视网膜类器官，并将其放入冻存管中。用1,000 µL移液器吸除多余培养基，注意不要触碰管底的类器官，然后加入250 µL冷的冻存液（参见材料表）。
    2. 将冻存管置于基于异丙醇的冷冻容器中，在-80 °C下冷冻至少4小时。随后将冻存管转移至-150 °C超低温冰箱或液氮罐中进行长期保存。
  2. 对于hiRPE细胞
    1. 在第1代传代时，当细胞达到完全融合状态后进行解离。
      注意：不建议对hiRPEp0细胞进行冻存。
    2. 使用真空抽吸系统吸除T-25 cm2培养瓶中的培养基，并用5 mL移液器加入3 mL PBS洗涤一次。
    3. 用真空抽吸系统移除PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 °C培养箱中孵育至少15分钟。加入5 mL ProB27培养基以终止胰蛋白酶活性。
      注意：不建议使用ProN2培养基来灭活胰蛋白酶。
    4. 使用10 mL移液器反复吹打，使hiRPE细胞单层解离成单细胞悬液。用细胞计数仪计数细胞。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在110 × g条件下离心5分钟。
      注意：可额外使用ProN2培养基洗涤一次，以去除残留的ProB27培养基。
    5. 使用真空抽吸法吸除上清液，轻柔重悬细胞，使每250 µL冻存液中含有200万细胞。
    6. 将250 µL细胞悬液分装至每个冻存管中。将冻存管置于基于异丙醇的冷冻容器中，在-80 °C下冷冻至少4小时。
    7. 将冻存管转移至-150 °C超低温冰箱或液氮罐中进行长期保存。

7. 视网膜类器官和hiRPE细胞的解冻

  1. 全视网膜类器官的解冻
    1. 将ProB27培养基在37 °C预热（每支冻存管需要2 mL）。
    2. 从液氮罐或-150 °C冰箱中取出含有视网膜类器官的冻存管，在37 °C水浴中解冻30秒。使用消毒喷雾仔细对冻存管进行表面消毒。
    3. 打开管盖，加入1 mL预热的ProB27培养基。用移液器将类器官转移至1.5 mL离心管中。 
    4. 轻轻吸去上清液，避免触碰管底的视网膜结构。再用1 mL预热的ProB27培养基洗涤类器官一次。
    5. 用移液器将类器官吸出，转移至6孔板的一个孔中，该孔内已预先加入在37 °C、5% CO2培养箱中预热并平衡的ProB27培养基。
      注：每个6孔板孔中放置10–15个视网膜类器官。
    6. 根据目标视网膜细胞类型的出现情况，在所需培养期间每2–3天更换一半培养基，具体参见图2。
  2. hiRPE细胞的解冻
    1. 将ProN2培养基在37 °C预热（每支冻存管需要8 mL）。
    2. 从液氮罐或-150 °C冰箱中取出hiRPEp1细胞的冻存样本，在37 °C水浴中解冻30秒。使用消毒喷雾仔细对冻存管进行表面消毒。
    3. 打开管盖，加入1 mL预热的ProN2培养基，将细胞悬液转移至含有2 mL预热ProN2培养基的15 mL离心管中。在110 × g条件下离心5分钟。
    4. 吸去上清液，用2 mL在37 °C预热的ProN2培养基轻柔重悬细胞沉淀。
    5. 使用细胞计数仪对细胞进行计数。
    6. 取125万个细胞，接种于基质包被的T-25 cm2培养瓶（见步骤2.2.2）中，瓶内已加入5 mL在37 °C预热的ProN2培养基。此时将传代次数记为2（hiRPEp2）。
    7. 将hiRPEp2细胞置于37 °C、5% CO2细胞培养箱中，使用ProN2培养基培养48小时后再更换培养基。
    8. 每2–3天更换一次培养基。当hiRPE细胞达到汇合状态时，进行后续传代或冻存。
      注：培养2周后，可收获800万至1000万个hiRPE细胞用于后续实验。

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结果

无饲养层条件下培养的人源iPSC分化第一步16 是利用Bi培养基关闭自我更新机制，以促进自发性分化（图1A）。随后在第2天（D2），在Bi培养基中添加N2补充剂，以引导分化中的iPSC向神经及视网膜谱系发育。该过程约在第28天（D28）诱导出神经视网膜芽。图1C - 1E）。可使用针头分离自形成的神经视网膜结构，如图所示 图1E 并转移至培养板中，使用ProB27培养基在悬浮培养条件下促进视网膜类器官的成熟图1F）。为了促进神经视网膜的生长与发育，在培养基中添加 FGF2 培养 1 周（图1A).

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讨论

本方案描述了如何在无异种成分且无饲养层的条件下，从人多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮（RPE）细胞以及包含视网膜神经节细胞（RGCs）和光感受器的视网膜类器官。该方法符合药品生产质量管理规范（GMP）流程，可大规模生产来源于诱导多能干细胞的视网膜细胞，包括RPE细胞、RGCs和光感受器，为基于干细胞的疗法及药物筛选提供重要资源，以期用于未来视网膜变性疾病的治疗。对完整视网膜类器官或人诱导RPE细胞进行冷冻保存，也有利于建立中间细胞库，这是未来干细胞治疗应用中的关键步骤。

未来临床转化需要在特定分化阶段大量制备特定类型的视网膜细胞。在这方面，三个月内生成被描述为可移植细胞群体的CD73阳性光感受器前体细胞18，以及从冻融视网膜类器官中产生这些未成熟光感受器的可能性15，进一步增强了将这些细胞用于治疗目的的希望。关于视网膜色素上皮细胞，hiRPE细胞在体外（in vitro）的增殖能力使其能够大规模生产并建库保存。重要的是，解冻后的人诱导多能干细胞来源的RPE细胞仍保持其R...

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披露

Sacha Reichman、Olivier Goureau 和 José-Alain Sahel 是有关从人类多能干细胞生成视网膜细胞的待批专利的发明人。

致谢

作者谨此感谢 Goureau 团队成员在建立本文所述方法过程中提供的建议，以及 G. Gagliardi 和 M. Garita 对本文的审阅意见。本研究得到了法国国家研究署（ANR）（项目 GPiPS：ANR-2010-RFCS005；SightREPAIR：ANR-16-CE17-008-02）、法国视网膜协会（Retina France Association）以及技术转化公司 SATT Lutech 的资助。本研究还在 LABEX LIFESENSES（ANR-10-LABX-65）项目框架下开展，并由法国国家研究署通过“未来投资计划”（Investissements d'Avenir，项目编号 ANR-11-IDEX-0004-02）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤连蛋白（VTN-N）重组人蛋白，截短型ThermoFisher ScientificA14700包被
CTS 纤连蛋白（VTN-N）重组人蛋白，截短型ThermoFisher ScientificA27940包被
Essential 8 培养基ThermoFisher ScientificA1517001培养基
Essential 6 培养基ThermoFisher ScientificA1516401培养基
CTS（细胞治疗系统）N-2 添加剂ThermoFisher ScientificA1370701添加剂 CTS
N-2 添加剂（100X）ThermoFisher Scientific17502048添加剂
B-27 添加剂（50X），无血清ThermoFisher Scientific17504044添加剂
CTS B-27 添加剂，无异源成分ThermoFisher ScientificA1486701添加剂 CTS
DMEM/F-12ThermoFisher Scientific11320074培养基
MEM 非必需氨基酸溶液（100X）ThermoFisher Scientific11140035添加剂
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）ThermoFisher Scientific15140122抗生素
CellStart CTSThermoFisher ScientificA1014201基质 CTS
Geltrex hESC 认证、即用型、低生长因子基底膜基质ThermoFisher ScientificA1569601基质
温和细胞解离试剂Stemcell Technologies7174解离溶液
Cryostem 冷冻保存培养基clinisciences05-710-1D冷冻保存培养基
成纤维细胞生长因子 2（FGF2）Preprotech100-18BFGF2
无动物源成纤维细胞生长因子 2（FGF2）PreprotechAF-100-18B无异源 FGF2
AGANI 23G 针头TerumoAN*2332R1针头
25 cm² 组织培养处理培养瓶Falcon353109T-25 cm²
24 孔板，组织培养处理Costar352624 孔板
6 孔板，组织培养处理Costar35166 孔板

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