利用多能干细胞生成特化的视网膜细胞是干细胞治疗视网膜疾病发展过程中的一个关键转折点。本文介绍了一种简单的方法，可高效地生成用于基础研究、转化研究和临床研究的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞。
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方法文章
无饲养层且无异源成分的培养条件用于生成人iPSC来源的视网膜细胞模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
由多能干细胞产生特化细胞为开发再生医学新方法提供了有力工具。在包括视网膜营养不良在内的神经退行性疾病研究中，使用人诱导性多能干细胞（iPSCs）尤其具有吸引力，其中由iPSCs衍生的视网膜细胞模型标志着理解和对抗失明的重要进展。本文描述了一种简单且可扩展的方案，用于生成、成熟及冷冻保存视网膜类器官。该方法基于培养基更换，其主要优势在于避免了iPSC定向分化过程中通常所需的多个耗时步骤。通过对贴壁培养的人iPSCs连续更换特定培养基，模拟视网膜发育的早期阶段，该方案可在4周内以可重复且高效的方式同时生成自组织的神经视网膜结构和视网膜色素上皮（RPE）细胞。这些包含视网膜前体细胞（RPCs）的结构可轻松分离，并在悬浮培养条件下进一步成熟，促使RPCs分化为成人人类视网膜中存在的七种视网膜细胞类型。此外，我们还描述了视网膜类器官和RPE细胞快速冷冻保存的方法，适用于长期储存。综上所述，本文所述方法将有助于生成和储存人iPSC来源的视网膜细胞或组织，服务于基础研究和临床研究。
引言
视网膜是中枢神经系统（CNS）的重要组成部分，其在遭受创伤性损伤或疾病后自发再生的能力极为有限。因此，由年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）、青光眼和糖尿病性视网膜病变等退行性疾病导致的视网膜细胞不可逆性丧失，通常会引起永久性失明。挽救退化的视网膜是一项重大挑战，其中以干细胞为基础、旨在替代受损或丢失细胞的治疗策略，是目前最具前景的方法之一1,2,3多能干细胞，如人胚胎干细胞（ESCs）或人诱导多能干细胞（iPSCs），可在体外培养中无限扩增，并具有分化为任何细胞类型的潜能。随着对视网膜发育机制的理解不断深入以及培养技术的改进 体外 人类iPSC分化方案已成功生成视网膜类器官7,8,9,10,11,12所有主要的视网膜细胞，包括视网膜神经节细胞（RGCs）、光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞，均已成功从人胚胎干细胞....
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方案
本文所述方案遵循视觉研究所研究伦理委员会的指导方针。根据现行法国法规，视觉研究所获准进行人体样本的操作。在获得伦理批准后，样本处理遵循《赫尔辛基宣言》原则以及国家关于患者数据保护的相关规定。 "法兰西岛第五地区保护人员委员会 (CPP)".
1. 培养基和培养皿的准备
- 培养基
- 使用iPSC培养基，即专为无饲养层条件下培养多能干细胞而设计的化学成分明确的培养基16。根据生产商说明书配制500 mL培养基。
- 使用基础iPSC（Bi）培养基，即不含成纤维细胞生长因子2（FGF2）或转化生长因子β（TGFß）的iPSC化学成分明确培养基。
- 配制500 mL Bi培养基，并添加1% N2补充剂（BiN2培养基）、10单位/mL青霉素和10 mg/mL链霉素。
- 配制500 mL以N2为基础的前神经培养基（ProN2培养基），其成分为DMEM:营养混合物F-12（DMEM/F12，1:1，含L-谷氨酰胺）、1% MEM非必需氨基酸、1% N2补充剂、10单位/mL青霉素和10 mg/mL链霉素。
- 配制以B27为基础的前神经培养基（ProB27培养基），其成分为DMEM:营养混合物F-12（DMEM/F12，1:1，含L-谷氨酰胺）、1% MEM非必需氨基酸、2....
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结果
无饲养层条件下培养的人源iPSC分化第一步16 是利用Bi培养基关闭自我更新机制，以促进自发性分化（图1A）。随后在第2天（D2），在Bi培养基中添加N2补充剂，以引导分化中的iPSC向神经及视网膜谱系发育。该过程约在第28天（D28）诱导出神经视网膜芽。图1C - 1E）。可使用针头分离自形成的神经视网膜结构，如图所示 图1E 并转移至培养板中，使用ProB27培养基在悬浮培养条件下促进视网膜类器官的成熟图1F）。为了促进神经视网膜的生长与发育，在培养基中添加 FGF2 培养 1 周（图1A).
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讨论
本方案描述了如何在无异种成分且无饲养层的条件下，从人多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮（RPE）细胞以及包含视网膜神经节细胞（RGCs）和光感受器的视网膜类器官。该方法符合药品生产质量管理规范（GMP）流程，可大规模生产来源于诱导多能干细胞的视网膜细胞，包括RPE细胞、RGCs和光感受器，为基于干细胞的疗法及药物筛选提供重要资源，以期用于未来视网膜变性疾病的治疗。对完整视网膜类器官或人诱导RPE细胞进行冷冻保存，也有利于建立中间细胞库，这是未来干细胞治疗应用中的关键步骤。
未来临床转化需要在特定分化阶段大量制备特定类型的视网膜细胞。在这方面，三个月内生成被描述为可移植细胞群体的CD73阳性光感受器前体细胞18，以及从冻融视网膜类器官中产生这些未成熟光感受器的可能性15，进一步增强了将这些细胞用于治疗目的的希望。关于视网膜色素上皮细胞，hiRPE细胞在体外（in vitro）的增殖能力使其能够大规模生产并建库保存。重要的是，解冻后的人诱导多能干细胞来源的RPE细胞仍保持其R.......
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披露
Sacha Reichman、Olivier Goureau 和 José-Alain Sahel 是有关从人类多能干细胞生成视网膜细胞的待批专利的发明人。
致谢
作者谨此感谢 Goureau 团队成员在建立本文所述方法过程中提供的建议，以及 G. Gagliardi 和 M. Garita 对本文的审阅意见。本研究得到了法国国家研究署（ANR）（项目 GPiPS：ANR-2010-RFCS005；SightREPAIR：ANR-16-CE17-008-02）、法国视网膜协会（Retina France Association）以及技术转化公司 SATT Lutech 的资助。本研究还在 LABEX LIFESENSES（ANR-10-LABX-65）项目框架下开展，并由法国国家研究署通过“未来投资计划”（Investissements d'Avenir，项目编号 ANR-11-IDEX-0004-02）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纤连蛋白（VTN-N）重组人蛋白，截短型 | ThermoFisher Scientific | A14700 | 包被 |
| CTS 纤连蛋白（VTN-N）重组人蛋白，截短型 | ThermoFisher Scientific | A27940 | 包被 |
| Essential 8 培养基 | ThermoFisher Scientific | A1517001 | 培养基 |
| Essential 6 培养基 | ThermoFisher Scientific | A1516401 | 培养基 |
| CTS（细胞治疗系统）N-2 添加剂 | ThermoFisher Scientific | A1370701 | 添加剂 CTS |
| N-2 添加剂（100X） | ThermoFisher Scientific | 17502048 | 添加剂 |
| B-27 添加剂（50X），无血清 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 添加剂 |
| CTS B-27 添加剂，无异源成分 | ThermoFisher Scientific | A1486701 | 添加剂 CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | 培养基 |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100X） | ThermoFisher Scientific | 11140035 | 添加剂 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 抗生素 |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | 基质 CTS |
| Geltrex hESC 认证、即用型、低生长因子基底膜基质 | ThermoFisher Scientific | A1569601 | 基质 |
| 温和细胞解离试剂 | Stemcell Technologies | 7174 | 解离溶液 |
| Cryostem 冷冻保存培养基 | clinisciences | 05-710-1D | 冷冻保存培养基 |
| 成纤维细胞生长因子 2（FGF2） | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| 无动物源成纤维细胞生长因子 2（FGF2） | Preprotech | AF-100-18B | 无异源 FGF2 |
| AGANI 23G 针头 | Terumo | AN*2332R1 | 针头 |
| 25 cm² 组织培养处理培养瓶 | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 孔板，组织培养处理 | Costar | 3526 | 24 孔板 |
| 6 孔板，组织培养处理 | Costar | 3516 | 6 孔板 |
参考文献
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Th....
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重印与许可
