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方法文章

高效纯化及基于液相色谱-串联质谱的十一种易位-2 5-甲基胞嘧啶双加氧酶检测方法开发

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DOI：

10.3791/57798

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2018年10月15日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Missouri-Kansas City

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用离子交换色谱法高效一步纯化无标签活性人源ten-eleven translocation-2（TET2）5-甲基胞嘧啶双加氧酶的实验方案，以及采用基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的检测方法对其进行活性测定。

摘要

由5-甲基胞嘧啶（5mC）介导的表观遗传转录调控在真核生物发育过程中发挥着关键作用。这些表观遗传标记的去甲基化通过十一种易位双加氧酶（TET1-3）的逐级氧化实现，随后由胸腺嘧啶-DNA糖基化酶依赖的碱基切除修复完成。TET2基因因遗传突变或其他表观遗传机制失活，与多种癌症患者（尤其是造血系统恶性肿瘤）的不良预后相关。本文介绍了一种利用阳离子交换色谱法高效一步纯化具有酶活性的无标签人源TET2双加氧酶的方法。此外，我们提供了一种液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可用于分离并定量四种正常的DNA碱基（A、T、G和C）以及四种修饰的胞嘧啶碱基（5-甲基、5-羟甲基、5-甲酰基和5-羧基）。该检测方法可用于评估野生型及突变型TET2双加氧酶的活性。

引言

在哺乳动物基因组中，胞嘧啶碱基在CpG二核苷酸中的C5位点是主要的甲基化位点（5mCpG）1。此外，近年来多项研究发现，在非CpG位点（5mCpH，其中H = A、T或C）也存在广泛的C5位胞嘧啶甲基化（5mC）2,3。5mC修饰在内源性逆转录转座子和基因启动子区域发挥转录沉默作用3,4,5。5mC处的DNA甲基化还在X染色体失活、基因组印记、核重编程以及组织特异性基因表达中发挥重要作用5,6,7。C5位胞嘧啶的甲基化由DNA甲基转移酶催化完成，这些酶的突变会导致显著的发育缺陷8。5mC修饰的去除由TET1-3 5mC氧化酶起始9,10。TET家族双加氧酶通过连续的氧化反应将5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）11,12,13。最终，胸腺嘧啶-DNA糖基化酶通过碱基切除修复途径将5fC或5caC替换为未修饰的胞嘧啶11。

人类TET2基因被发现是在多种造血系统恶性肿瘤中频繁发生突变的基因，包括骨髓增生异常综合征（MDS）14,15,16、MDS-骨髓增殖性肿瘤（MDS-MPN）以及起源于MDS和MDS-MPN的急性髓系白血病（AML）16。携带TET2突变的患者，其骨髓DNA中的5hmC修饰水平低于野生型（wt）-TET2患者14。多个研究团队已建立了TET2基因敲除小鼠模型，以阐明其在正常造血过程及髓系转化中的作用17,18,19,20。这些TET2基因突变的小鼠在出生初期表现正常且可存活，但随着年龄增长出现多种造血系统恶性肿瘤，导致其早亡。这些研究揭示了野生型TET2在正常造血分化中的重要作用。在这些小鼠模型中，杂合型造血干细胞（TET2+/- HSCs）和纯合型TET2-/- HSCs在重建造血谱系方面相较于纯合型野生型TET2 HSCs具有竞争优势，因为TET2+/-和TET2-/- HSCs均会发展出多种造血系统恶性肿瘤17,18。这些研究表明，TET2双加氧酶的单倍剂量不足会改变HSC的发育进程，并导致造血系统恶性肿瘤的发生。

与TET2基因突变的小鼠类似，大多数白血病患者表现出TET2双加氧酶活性的单倍剂量不足。这些多为杂合性的体细胞突变，包括遍布TET2基因全长的移码突变和无义突变，而错义突变则主要集中于双加氧酶结构域12。迄今为止，关于野生型和突变型TET2的特性研究报道较少，主要原因是TET2双加氧酶的制备及其活性检测存在困难21。本文中，我们报道了一种利用离子交换色谱法一步纯化天然TET2双加氧酶的简便方法。此外，我们优化并建立了一种定量LC-MS/MS检测方法，用于测定天然TET2双加氧酶的酶活性。

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方案

1. 无标签人源TET2双加氧酶的克隆与纯化

  1. 克隆人 TET2 双加氧酶（TET2 1129-1936， Δ1481-1843）通过位点特异性重组技术克隆至pDEST14目的载体，方法如前所述22.
    注意：先前的研究表明，C端TET2双加氧酶（TET2 1129-1936， Δ1481-1843）区域是最小的催化活性区域21,23为了利用pDONR221载体表达无标签的TET2双加氧酶结构域，在PCR过程中将Shine Dalgarno序列和Kozak序列引入正向引物中（表1).
  2. 对于细菌转化，加入1 µ含有无标签人源TET2双加氧酶（TET2 1129-1936）的重组pDEST14表达载体的L Δ1481-1843) 至 100 µ化学感受态的升 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞置于 1.7 mL 离心管中。将混合物置于冰上至少 15 分钟，随后在 42 ℃ 进行热激 °30秒水浴
    1. 热激后立即将细胞放回冰上，至少放置2分钟。随后，加入250 µL SOC培养基（含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤）加入细胞中。将细菌细胞在37℃孵育1小时 °在摇床中。
    2. 孵育后，将离心管在9,000 x g下离心1分钟，使细胞沉淀。用移液器弃去70%上清液，并将沉淀重悬于剩余培养基中。
    3. 将细胞悬液涂布于含有100的Luria肉汤（LB）琼脂平板上 µg/mL 氨苄青霉素。将平板于 37 ℃ 培养 16 小时 °C.
  3. 挑选一个单菌落，接种于含有氨苄青霉素的10 mL LB培养基中，置于50 mL离心管内。将离心管在37℃培养 °在摇床中过夜。随后，使用 100 µL  从50 mL离心管中取培养物接种至100 mL LB-氨苄青霉素培养基中。将培养瓶于37 ℃培养 °在180 rpm摇床中培养，并用作初级培养物。次日，取6 mL初级培养物分别接种至15个含有600 mL LB-氨苄青霉素培养基的锥形瓶中。将15个锥形瓶于37 °C培养 °在180 rpm的摇床中。
    注意：为验证转化后的克隆，需对分离的质粒DNA进行测序或限制性酶切消化。
  4. 为检测细菌培养物的密度，测量其OD值600 使用分光光度计。当培养物在 OD 处达到 0.8 的密度后600，用300诱导TET2蛋白的表达 µ1 M IPTG 溶液（在 600 mL 培养液中的终浓度为 0.5 mM）加入每个烧瓶中，随后在 17 °C 下继续培养 16 小时 °C.
  5. 16小时后，将细菌培养物转移至离心瓶中。在5,250 × g下离心表达TET2酶的细菌培养物45分钟。收集细菌沉淀用于TET2纯化。
    注意：所有后续蛋白质纯化步骤均需在冰上或4 °C条件下进行 °C.
  6. 将细菌沉淀重悬于 100 mL 的 50 mM MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）缓冲液（pH 6）中，超声处理 5 分钟 × 20 功率下处理 30 秒，间隔 60 秒冷却。
  7. 以 5,250 × g 离心裂解液 45 分钟。收集含有可溶性 TET2 酶的上清液，并通过 0.45-µm 滤膜过滤后上样至 FPLC 系统。
    注意：在这些实验中，TET2 酶非常稳定，但如有需要，可添加含有 1 mM 苯甲脒盐酸盐（benzamidine-HCl）、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 0.5 mM 1,10-o-邻菲咯啉可添加至细胞裂解液中以防止TET2酶降解。抑制剂混合物中应避免使用EDTA或EGTA，因为这些成分可能干扰后续的阳离子交换层析。
  8. 将30 mL强阳离子交换树脂装填至FPLC柱中。使用FPLC系统，以0.3 mL/min的恒定流速，用10倍柱体积的洗涤缓冲液（50 mM MES缓冲液，pH 6）平衡色谱柱。
  9. 将澄清的裂解液上样至预先平衡的层析柱，并用缓冲液洗涤 ∼用洗涤缓冲液洗涤10个柱床体积，直至流出液变澄清。
  10. 使用洗脱缓冲液（50 mM MES缓冲液，pH 6，1 M NaCl）对洗涤缓冲液进行0–100%梯度洗脱，共15个柱体积，随后在100%洗脱缓冲液中继续洗脱2个柱体积，以洗脱TET2。
    注意：收集样品（100 µ分别取柱层析上样前后的细胞裂解液各 L，以及所有洗脱组分，于10%分离胶SDS-PAGE上进行分析。
  11. 合并含有 TET2 蛋白的组分，冷冻干燥，将酶沉淀溶解于 10 mL 水中，并于 -80 ℃ 保存 °C.

2. TET2双加氧酶对5mC的氧化作用

  1. 使用3 µg底物（25-mer双链DNA，表2）进行三份平行去甲基化反应。
    1. 在50 µL总反应缓冲液中加入100 µg纯化的TET2酶，缓冲液包含50 mM HEPES（pH 8.0）、200 µM FeSO4、2 mM 2OG（2-氧代戊二酸/α-酮戊二酸）和2 mM抗坏血酸，在37 °C下孵育1 h21。
    2. 加入5 µL 500 mM EDTA终止TET2催化的氧化反应。
  2. TET2反应终止后，使用寡核苷酸纯化柱将DNA从TET2反应混合物中分离，以制备用于LC-MS/MS分析的样品。
    1. 向55 µL终止后的反应液中加入100 µL寡核苷酸结合缓冲液。
    2. 随后向混合物中加入400 µL 100%乙醇，并将该混合物通过寡核苷酸结合柱。
    3. 用750 µL洗涤缓冲液洗涤结合的DNA，并用20 µL水洗脱。
  3. 在37 °C下，使用2单位DNase I和60单位S1核酸酶对分离的DNA消化12 h，以生成单个脱氧核苷一磷酸。
  4. 消化完成后，在样品中加入2单位小牛肠碱性磷酸酶（CIAP），并在37 °C下继续孵育12 h，以去除脱氧核苷一磷酸的末端磷酸基团，获得脱氧核苷。
  5. 使用下文所述的LC-MS/MS方法定量所有脱氧核苷，特别是修饰的胞嘧啶。

3. 基于液相色谱-串联质谱法的定量检测方法开发

  1. 为建立LC-MS/MS方法，使用HPLC级水配制所有修饰胞嘧啶核苷[5-甲基-2′-脱氧胞苷（5mdC）、5-羟甲基-2′-脱氧胞苷（5hmdC）、5-甲酰基-2′-脱氧胞苷（5fdC）和5-羧基-2′-脱氧胞苷（5cadC）]以及四种正常DNA碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤）的100 µM储备液。
  2. 依次将各储备液以10 µL/min流速注入质谱仪，在EMS扫描模式下优化每种DNA核苷的依赖于核苷的MS/MS参数。使用软件的自动定量优化功能，对每种DNA核苷优化以下参数：去簇电位（DP）、入口电位（EP）、碰撞池入口电位（CEP）、碰撞能量（CE）和碰撞池出口电位（CXP）。
  3. 使用梯度条件进样10 µL储备液，优化依赖于离子源的MS/MS参数，流动相A为10 mM乙酸铵（pH 4.0），流动相B为含10 mM乙酸铵（pH 4.0）的20%乙腈，流速为0.3 mL/min，初始条件为25%流动相B。在FIA（流动注射分析）模式下，使用软件的手动定量优化功能，对每种DNA核苷优化以下参数：帘气（CUR）：10–50，温度：0–600 °C，气流1（GS1）：0–50，气流2（GS2）：0–50，碰撞诱导解离（CAD）：低–中–高，离子喷雾电压（IS）：4000–5500。
  4. 为分离全部八种DNA核苷，采用以下梯度进行液相色谱分析：0%流动相B（0–2 min），0–20%流动相B（2–5 min），20–60%流动相B（5–9 min），60–0%流动相B（9–10 min），随后在C18色谱柱（粒径：5 µm，孔径：120 Å）上以0.3 mL/min流速用流动相A平衡5 min。
  5. 结合最优MS/MS参数（步骤3.2和3.3）与上述液相色谱梯度（步骤3.4），使用含有全部八种核苷的100 µM标准混合液进行两倍系列稀释，测定响应线性、检测限（LOD）和定量下限（LLOQ），并绘制八种DNA核苷的标准曲线。
  6. 利用LC-MS/MS方法及标准曲线，检测并定量步骤2.4中产生的所有核苷，特别是修饰的胞嘧啶衍生物。

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结果

TET家族双加氧酶对DNA中5mC的动态修饰在表观遗传转录调控中发挥重要作用。TET2双加氧酶在多种造血系统恶性肿瘤中 frequently 发生突变。12为了研究TET2酶在正常发育和疾病中的作用，我们将未携带任何亲和标签的TET2最小催化活性结构域克隆至pDEST14载体中22通过SDS-PAGE分析，在细菌中未标记的TET2双加氧酶的表达量约为总可溶性蛋白的5% E. coli BL21 (DE3) 细胞。由于TET2的催化结构域等电点相对较高（∼7.49），与大多数内源性蛋白相比 E. coli 蛋白质24,25,26，开发了一种利用阳离子交换色谱的高效纯化工艺。该纯化方法获得了 >一步纯化获得纯度达90%的TET2酶（

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讨论

TET2 基因的突变是在多种血液系统恶性肿瘤患者中检测到的最常见遗传改变之一。迄今为止，已在患者中鉴定出数百种不同的 TET2 突变，包括无义突变、移码突变和错义突变12。携带 TET2 突变的患者，其骨髓中基因组 5hmC 水平较野生型 TET2（wt-TET2）患者更低14。通过构建突变型 TET2 基因敲入实验，已在转染细胞中重现了这些突变对 5hmC 水平的影响14。TET2 基因敲除小鼠模型的研究结果表明，TET2 酶的表达水平与血液系统恶性肿瘤的进展呈负相关17,18,19,20。与此一致，Zhang et al. 最近证明，在细胞遗传学正常的急性髓系白血病中，TET2 表达水...

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披露

作者声明无经济利益冲突。

致谢

本研究由美国国防部以创意奖（W81XWH-13-1-0174）、再生障碍性贫血与骨髓增生异常综合征基金会资助以及UMRB资助的形式资助，资助对象为M.M.。作者感谢Mohit Jaiswal和Subhradeep Bhar在pDEST14载体中进行TET2基因的初步克隆工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPESCarbosynthFH31182
七水合硫酸亚铁Sigma-AldrichF8633
α-酮戊二酸（2-氧代戊二酸）Sigma-AldrichK1750
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA4544
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Sigma-AldrichE5134
乙酸铵Sigma-AldrichA1542
乙腈Fisher Scientific75-05-8
高效液相色谱级水Fisher Scientific7732-18-5
寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒Zymo ResearchD4061
DNase INew England BiolabsM0303S
S1 核酸酶Thermo ScientificENO321
CIAP（小牛肠碱性磷酸酶）New England BiolabsM0290S
LB 培养基AffymetrixJ75852
IPTGCarbosynthEI05931
MES [2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物]CarbosynthFM37015
氯化钠Fisher Scientific7647-14-5
甘油Sigma-AldrichG7893
SP SepharoseFisher Scientific45-002-934
2'-脱氧-5-甲基胞苷TCID3610
2'-脱氧-5-羟甲基胞苷TCID4220
2'-脱氧胞苷-5-羧酸钠盐Berry & AssociatesPY 7593
5-甲酰基-2'-脱氧胞苷Berry & AssociatesPY 7589
2'-脱氧胞苷Berry & AssociatesPY 7216
2'-脱氧腺苷CarbosynthND04011
2'-脱氧鸟苷CarbosynthND06306
2'-脱氧胸苷VWR Life Science97061-764
Gateway 技术Thermo Fisher11801016
Beckman Allegra X-15R 离心机 Beckman Coulter392932
Sonic Dismembrator 550Fisher ScientificXL2020
ÄKTA FPLC 系统Pharmacia (GE Healthcare)18116468
FreeZone 4.5 冷冻干燥系统Labconco7750020
Zymo 寡核苷酸纯化柱 Zymo ResearchD4061
BDS Hypersil C18 色谱柱Keystone Scientific, INC105-46-3
3200 Q-Trap 质谱仪AB Sciex
HPLC Shimadzu HPLC 
XK16/20 FPLC 色谱柱Pharmacia (GE Healthcare)28988937

参考文献

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