Method Article

酵母 2-混合筛在批次中比较蛋白质相互作用

DOI:

10.3791/57801

⸱

June 6th, 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

In This Article

Summary

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酵母 2-混合筛的分批处理可以直接比较多饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白的相互作用。在这里, 我们描述了精制方法, 新试剂, 以及如何实现这些屏幕的使用。

Abstract

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用酵母 2-杂交法筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一个有效的工具, 但它的使用在很大程度上仅限于发现高亲和性的 interactors 在互动的候选库中高度丰富。以传统的形式, 酵母 2-杂交试验可以产生太多的菌落分析时进行低严格的, 在那里可能发现低亲和 interactors。此外, 如果没有对同一图书馆进行全面和彻底的讯问, 对不同的诱饵质粒, 就无法进行比较分析。虽然这些问题中的一些可以使用阵列的牺牲品库来解决, 但操作此类屏幕所需的成本和基础设施却是令人望而却步的。作为替代, 我们已经适应了酵母 2-杂交检测, 同时发现在一个单一的屏幕上的许多瞬态和静态蛋白质相互作用的一个战略称为 DEEPN (动态富集评估蛋白质网络), 这采用高通量 DNA 测序和计算来跟踪编码相互作用伙伴的质粒种群的进化。在这里, 我们描述了定制的试剂和协议, 使 DEEPN 屏幕易于执行和经济高效。

Introduction

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对细胞生物学过程的完全理解依赖于寻找其分子机制基础的蛋白质相互作用网络。一种识别蛋白质相互作用的方法是酵母 2-杂交 (Y2H) 法, 它通过组装一个功能的嵌合体转录因子, 一旦两个感兴趣的蛋白质领域绑定到另一个1。一个典型的 Y2H 屏幕是通过创建一个酵母种群, 它既可以将相互作用的蛋白质的质粒库编码成转录激活剂 (e. g, "猎物" 融合蛋白) 和由蛋白质组成的给定的 "诱饵" 质粒。的兴趣融合到 dna 绑定域 (例如, 绑定到 Gal4-upstream 激活序列的 Gal4 DNA 绑定域)。Y2H 方法的一个主要优点是, 在为常规分子生物学工作配备的典型实验室中, 进行2是相对容易和廉价的。但是, 当传统上执行时, 用户会对在选择时出现的单个菌落进行正面 Y2H 交互的采样。这严重限制了可以调查的图书馆 "猎物" 克隆的数量。当一个特定的相互作用的猎物的丰度相对于其他捕食者非常高时, 这一问题就会复杂化, 从而减少了从低丰度猎物质粒中检测相互作用的几率。

在蛋白质组的综合覆盖范围内使用 Y2H 原理的一个解决方案是使用矩阵格式化的方法, 其中包含已知单个猎物质粒的阵列可以进行数字审问。但是, 这种方法需要的基础结构对于那些有意定义少量蛋白质或域3的 interactome 的个体调查人....

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Protocol

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1. 介质和板材的制备

注: 在开始该协议之前, 所有的盘子需要做最少2天。媒体可以在任何时候进行。然而, 缓冲酵母萃取蛋白胨葡萄糖腺嘌呤 (bYPDA) 需要做的日子, 将使用它。一些媒体是使用一个补充组合, 其中含有腺嘌呤水平大于通常使用。大多数最小的培养基补充剂指定10毫克/升腺嘌呤。标签为 ' + 40 艾德 ' 的补充剂指定总共40毫克/升腺嘌呤。

  1. 准备葡萄糖溶液 (50% 瓦特/v)。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解800毫升蒸馏水中的 d-(+) 葡萄糖500克。调整体积到1000毫升使用一个毕业的圆筒和过滤通过一个0.2 µm 无菌过滤器成一个无菌1000毫升介质储存瓶。
  2. 制备酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解20克的蛋白胨和10克的酵母萃取物在800毫升蒸馏水中。倒入一个毕业的圆筒, 用蒸馏水填满960毫升。倒入2000毫升锥形瓶, 加入15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加40毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
    1. 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
  3. 准备完整的合成最小介质 (CSM)-多金属板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解6.7 克的酵母氮基, 而....

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Results

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Y2H 检测被广泛用于寻找蛋白质: 蛋白质相互作用和几个适应和系统已经开发。在大多数情况下, 同样的考虑, 帮助确保成功的这些以前的方法是重要的 DEEPN。一些重要的基准包括: 确保 DNA 结合领域融合蛋白的表达, 确保在 diploids 的低背景下, 他 + 生长在含有与空捕食质粒感兴趣的诱饵, 诱饵的交配效率高含有马来酵母与库含 MATalpha 酵母, 最后, 低严格的条件, 使人口增长的条件下, 选择许多积极的 Y2H 反应, 甚至那些产生低 His3 活动和弱Y2H 转录应答。

DEEPN 的一个关键方面是重现性将 Y2H 库引入含有不同诱饵质粒的菌株, 并可靠地为那些产生积极 Y2H 相互作用的库质粒选择这些种群。当 Y2H 库的复杂性增加时, 这就变得更加困难, 因为要确保整个图书馆在不同的初始人口之间进行充分的迁移是困难的。此外, 选择条件下选择生长的种群大小和测序深度必须足够大, 以观察 Y2H 质粒组成的可重复变化, 以可靠地.......

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Discussion

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在这里, 我们提供了如何使用优化方法在批处理中执行 Y2H 化验的指南。在这个过程中有几个关键步骤, 以帮助确保将被放置在选择下的酵母的人口是起始库的代表, 并且足够的开始酵母人口用于接受选择限制变异.重要的是, 这些基准相对容易实现, 同时适应传统的 Y2H 检测方法和材料, 从而使大多数实验室都能使用标准分子生物学的方法。在使用不同的诱饵质粒时, DEEPN 允许从相同的猎物库种群中进行选择。因此, 一组互动的候选人, 产生一个 Y2H 的互动与一个诱饵对另一个可以直接比较。由于使用深度测序, 可以验证每个诱饵特定酵母种群的起始库组成, 并在库中独立地跟踪每个候选猎物基因的富集。批处理允许以半定量方式查询同一个库, 从而允许一个计算统计排名4。

此协议中有几个步骤对成功至关重要。一是必须获得大量的 diploids, 以确保 Y2H 猎物库的充分代表性与每种诱饵质粒的利益混合在一起。这里描述的交配过程是通过改变几个参数来优化的。我们发现, 房子商业 Y2H 库的一些菌株一般都很差, 但是, 这里描述的交配过程可以生成 2 x 10.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的

Acknowledgements

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我们感谢人类遗传学研究所内的工作人员对图书馆的准备和测序。我们感谢 Einat Snir 在为这里制作的 Y2H 质粒库编写基因组文库片段方面的专长。这项工作得到国家卫生研究院的支持: NIH R21 EB021870-01A1 和 NSF 研究项目赠款: 1517110。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Illumina HiSeq 4000Illumina测序平台
克隆抗HA抗体Biolegend901514检测pGal4AD构建体中HA表达的一抗
QED Biosciences Inc18826检测pTEF-GBD构建体中MYC表达的一抗
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HF新英格兰生物实验室R3101S
BamHI-HF新英格兰生物实验室R3236S
XhoI新英格兰生物实验室R0146S
聚乙二醇 3350，粉末J.T. BakerU2211-08
鲑鱼精子 DNATrevigen， Inc 由 Fisher Scientific 出售50-948-286酵母转化的载体 DNA 第 3.2.1 节。
卡那霉素一硫酸盐研究产品国际K22000
LE 琼脂糖GeneMateE-3120-500用于制备 DNA 琼脂糖凝胶
氯化钠研究产品国际S23025
胰蛋白胨研究产品国际T60060
D-山梨糖醇研究产品国际S23080
醋酸锂二水合MP 生物医学 155256
氯化钙ThermoFisherC79
EDTA 钠盐研究产品 国际E57020
酵母提取物粉末研究产品 国际Y20020
酵母氮碱（硫酸铵）不含氨基酸研究产品国际Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE为中DCS0789
CSM-Trp-Leu-His +40ADE为中DCS1169
CSM-Leu-Met为中DCS0549
CSM-Trp-MetBio 101， Inc4520-922
L-蛋氨酸为中DOC0168
腺嘌呤研究产品国际A11500
D-（+）-葡萄糖研究产品国际G32045
细菌琼脂BD214010用于制作第 1 部分的培养基板
胨研究产品国际P20240
3-氨基-1,2,4 三唑SigmaA8056
2-硫醇 （BME）Sigma-AldrichM6250
酶解酶 100TUSBiologicalZ1004
磷酸氢二钾SigmaP8281
苯酚：氯仿：IAAAmbionAM9732
乙酸铵Sigma-Aldrich238074
乙醇Decon Laboratories， INC2716
RNAse AThermoFisherEN0531
尿素研究产品国际U20200
SDS研究产品国际L22010
甘油Sigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
溴酚蓝Amresco449
Gibson 组装克隆试剂盒New England BiolabsE5510S第 2 节中质粒克隆的快速组装方法
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液New England BiolabsM0541S用于第 2.3 节中 Gibson 组装产物的扩增以及第 6.2.1 节中 DEEPN 深度测序的样品制备
化乙锭Amresco0492-5G
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104纯化 6.2.3 节中的 pcr 产物
Qiaquick DNA 凝胶提取试剂盒Qiagen28704用于纯化消化的 pTEF-GBD，第 2.1 节
KAPA Hyper Prep 试剂盒KAPA BiosystemsKK8500制备试剂盒，用于深度测序
密码子优化http://www.jcat.de
https://www.idtdna.com/CodonOpt密码子优化
集成 DNA 技术DNA 片段用于克隆 第 2.2
节 字符串ThermofisherDNA 片段
GenCatch 质粒 DNA 小量制备试剂盒EPOCH 生命科学制备第 2.3 节 DNA 的数量
Covaris E220Covaris高性能超声仪在第 7 节
核苷酸 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		DNA 技术或 Thermofisher粒构建过程中的 5' 插入片段 pTEF-GBD
寡核苷酸 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		DNA 技术或 Thermofisher粒构建过程中的 5' 插入片段 pTEF-GBD
寡核苷酸 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		DNA 技术或 Thermofisher粒构建过程中的 3' 插入片段 pTEF-GBD
核苷酸 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		集成 DNA 技术或 Thermofisher用于 PCR 扩增和测序 质粒构建过程中的 3' 插入片段 pTEF-GBD
寡核苷酸 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		集成 DNA 技术或 Thermofisher5' Pimer 用于 pGAL4AD
寡核苷酸 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		集成 DNA 技术或 Thermofisher3' Pimer 用于 pGAL4AD
寡核苷酸 5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		集成 DNA 技术或 Thermofisher5' Pimer 用于 pGADT7
寡核苷酸 5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		集成 DNA 技术或 Thermofisher3' Pimer 用于 pGADT7
PJ69-4A MatA 酵母菌株http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P、Halladay J、Craig EA：基因组文库和设计用于酵母中高效双杂交选择的宿主菌株。遗传学 1996 144：1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D， gal80D， GAL-ADE2 lys2：：GAL1-HIS3 met2：：GAL7
pTEF-GBDRobert Piper 博士实验室Gal4-DNA 结合多曼表达质粒
pGal4AD （pPL6343）Robert Piper 博士实验室Gal4 激活结构域表达质粒
100 mm 培养皿Kord-Vallmark 由 VWR2900
125 mL PYREX 锥形瓶Fisher ScientificS63270
250 mL PYREX 锥形瓶Fisher ScientificS63271
1,000 mL PYREX 锥形瓶Fisher ScientificS63274
2,000 mL PYREX 锥形瓶Fisher ScientificS63275
20 X 150 mm 一次性培养管Thermofisher14-961-33
pipet-aidDrummond4-000-100
5 mL 血清移液管DenvilleP7127
10 mL 血清移液DenvilleP7128
25 mL 血清移液管DenvilleP7129
1,000 mL PYREX Griffin 烧杯Fisher Scientific02-540P
1,000 mL PYREX可更换培养基储存瓶Fisher Scientific06-414-1D
1,000 mL 量筒Fisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190分子装置用于测量细胞光密度
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000分光光度计，用于定量 DNA
量 电子紫外线透射仪Ultra LumMEB 20用于可视化溴化乙锭琼脂糖凝胶中的 DNA
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 和微;L 低吸附移液器吸头GeneMateP-1236-1250
200 & micro;低吸附移液器吸头VWR10017-044
10 µL XL 低吸附移液器吸头VWR10017-042
50 mL 锥形管VWR490001-627
15 mL 锥形管VWR490001-621
细胞刮刀Denville ScientificTC9310
1.5 mL 微量离心管USA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
木制涂抹器Solon Care55900
Eppendorf 微量离心机 5424Fisher Scientific05-400-005微量离心机
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381台式离心机
Amersham ECL 兔 IgG，HRP 连接全抗体（来自驴）GE医疗保健NA934-1ML二抗
Amersham ECL 小鼠 IgG，HRP 连接的全抗体（来自绵羊）GE HealthcareNA931-1ML二抗
SuperSignal West Pico 化学发光底物Thermo Fisher Scientific34080ECL 检测溶液
Isotemp 培养箱Thermo Fisher Scientific培养箱
Mutitron 2INFORS HT振荡培养箱
Isotemp 数控水浴 Model 205Fisher Scientific水浴
Y187（泛组织）中的 Y2H 小鼠 cDNA 文库Clontech630482市售 cDNA 文库
Y187（小鼠脑）中的小鼠 cDNA 文库Clontech630488市售 cDNA 文库
pGADT7 AD 载体Clontech630442售的 AD 载体，包含许多 cDNA 文库
、pGBKT7 DNA-BD 载体Clontech630443市售的 DNA-BD 载体
生物酶 DNA 聚合酶BiolineBIO-21042用于第 2.4 节的 DNA 聚合酶
GeneMate GCL-60 热循环仪BioExpressP-6050-60PCR 机
TempAssure 0.5 mL PCR 管美国科学1405-8100
深度 单物 蛋白溴 用于gBlocks 的 用于克隆的 用于寡用于 PCR 扩增和测序的集成 质用于 PCR 扩增和测序的集成 质用于 PCR 扩增和测序的集成 质 寡 的插入片段扩增 插入片段扩增 的插入扩增的插入扩增 出售管 ，市

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Mo....

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