对经酵母双杂交阳性相互作用筛选的酵母群体进行深度测序，可能获得大量关于相互作用配体蛋白的信息。本文介绍了特定生物信息学工具及定制更新软件的操作方法，用于分析此类筛选所产生的序列数据。
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本文内容
摘要
摘要
我们已将酵母双杂交实验改造为利用高通量短读长DNA测序，在单次筛选中同时发现数十种瞬时和稳定的蛋白质相互作用。所获得的序列数据不仅能够追踪在阳性酵母双杂交相互作用筛选过程中富集的基因群体，还能提供足以介导相互作用的蛋白质相关亚结构域的详细信息。本文介绍了一整套独立的软件程序，使非生物信息学专业人员也能完成批处理酵母双杂交实验中DNA序列fastq文件的所有生物信息学和统计分析步骤。这些软件涵盖的处理步骤包括：1）比对并计数对应于酵母双杂交猎物文库中每个候选蛋白质的序列读段；2）评估富集谱型的统计分析程序；以及3）用于分析编码目标相互作用蛋白的富集质粒在编码区内的翻译阅读框及其位置的工具。
引言
发现蛋白质相互作用的一种方法是酵母双杂交（Y2H）实验，该方法利用经过基因工程改造的酵母细胞，这些细胞仅在目标蛋白质与相互作用伴侣蛋白的片段发生结合时才能生长。1现在可以通过大规模并行高通量测序技术来检测多个酵母双杂交相互作用。已有多种实验体系被报道。2,3,4,5 包括我们开发的一种方法，其中在选择性条件下进行分批培养，以筛选含有能够产生阳性酵母双杂交相互作用质粒的酵母群体6我们开发的工作流程称为DEEPN（用于蛋白质网络评估的动态富集），该方法利用相同的猎物文库来鉴定差异相互作用组，从而识别与某一特定蛋白质（或结构域）相互作用的蛋白质 与另一种蛋白质或构象不同的突变结构域。该工作流程中的关键步骤之一是对DNA测序数据进行恰当的处理与分析。通过在酵母双杂交（Y2H）相互作用筛选前后分别统计每个基因的测序读段数，可以获取部分信息，其方式类似于RNA-seq实验。然而，从这些数据集中还可提取更为深入的信息，包括特定蛋白质中能够产生Y2H相互作用的功能亚结构域信息。此外，尽管DEEPN方法具有重要价值，但分析大量样本重复既繁琐又昂贵。通过采用专为DEEPN数据集开发的统....
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方案
1. 映射 Fastq 文件
注意：DEEPN 软件以及许多生物信息学程序使用 DNA 序列数据，其中每条序列读段均已映射至参考 DNA 中的位置。可用于此目的的映射程序有多种，包括此处使用的基于 HISTAT2 程序的 MAPster 界面，该界面可生成后续步骤中使用的 .sam 文件。
- 将测序数据比对至正确版本的基因组。对于来源于小鼠的酵母双杂交文库，使用 UCSC mm10 基因组；对于使用人类基因的文库，使用 UCSC hg38 参考基因组；对于 Saccharomyces cerevisiae 基因，使用 UCSC SacCer3 参考基因组。
- 安装 MAPster。
- 下载并安装 MAPster 软件。可通过网页浏览器在以下地址获取该软件：https://github.com/emptyewer/MAPster/releases。HISAT2 在基于 Unix 的系统（如 Apple Macintosh）上运行。因此，MAPster 程序仅能在 Apple Macintosh 和 Linux 等兼容系统上运行。
注意：Apple Mac 系统要求为：OSX 10.10+，>4 Gb 内存，>500 Gb 磁盘空间，以及用于下载参考基因组的网络连接。如果所在机构的企业安全协议限制管理员权限，用户可能需要咨询机构的 IT....
- 下载并安装 MAPster 软件。可通过网页浏览器在以下地址获取该软件：https://github.com/emptyewer/MAPster/releases。HISAT2 在基于 Unix 的系统（如 Apple Macintosh）上运行。因此，MAPster 程序仅能在 Apple Macintosh 和 Linux 等兼容系统上运行。
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结果
fastq 数据比对：第一步
在包括 DEEPN 在内的几乎所有高通量测序（NGS）应用中，初始输出均为一组短序列读段文件，必须通过比对将其定位到基因组、转录组或其他参考 DNA8。近年来开发的 HISAT2 比对程序采用了先进的索引算法，显著提高了比对速度7,9。HISAT2 可在台式计算机上高效运行，通常可在数分钟内完成一个典型规模读段文件的比对。这使得我们能够将 HISAT2 集成到一个名为 MAPster 的图形用户界面中，实现 fastq 文件的本地比对，使用户无需依赖通常需通过命令行操作的远程高性能计算集群（图 1）。MAPster 的重要功能包括为 RNA-seq 和全基因组比对实验预设参数、支持多个任务排队，以及为高级用户和定制化应用提供对全套可调 HISAT2 参数的访问。为展示 MAPst.......
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讨论
本文介绍的软件套件可用于对 DEEPN 实验产生的高通量 DNA 测序数据进行完整的处理与分析。首先使用的程序是 MAPster，该程序读取标准 fastq 文件中的 DNA 序列读段，并将其定位映射到参考 DNA 上，以便后续由多种生物信息学程序（包括 DEEPN 软件）进行分析。MAPster 界面具有实用的功能，例如可批量排队多个任务、合并输入文件、便捷命名输出文件，再结合其底层控制的 HISAT2 程序7的高速性能，使其成为适用于 DEEPN 以外多种应用场景的易用型映射工具。MAPster 可访问 HISAT2 程序中的多个参数，适用于除 DEEPN 之外的其他类型数据分析。其中部分功能包括为 RNA-seq 和全基因组映射实验预设的参数，以及为高级用户和定制化应用提供的全套易于调节的 HISAT2 参数选项。例如，RNA-seq 按钮会添加有助于转录本组装的格式设置；CRISPR 按钮则会阻止与参考 DNA 的反向互补链比对，这适用于由向导 RNA 序列构建的参考 DNA 文件。可选参数分布在四个标签页下，分别为"输入、比对、打分和输出"。“输入”选项包括更改输.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH R21 EB021870-01A1）和美国国家科学基金会研究项目基金（1517110）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Mapster | https://github.com/emptyewer/MAPster/releases | ||
| DEEPN 软件 | https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases | ||
| Statmaker | https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases | ||
| 最低计算机系统要求 | Apple | Mac Intel Core i5 或更高配置 | |
| - | 4 Gb RAM 或更高 | ||
| - | 500 Gb 磁盘空间或更大 | ||
| - | OS 10.10 或更高版本 | ||
| Dell | Intel i5-7400 或更高配置 | ||
| - | 4 Gb RAM 或更高 | ||
| - | 500 Gb 磁盘空间或更大 | ||
| - | Windows 7 或更高版本 |
参考文献
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimenta....
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重印与许可
