探讨间充质干细胞片对肝细胞癌发展的影响潜力 体内

摘要

在此，我们介绍一种建立 体内 利用细胞膜片技术构建的癌症模型。该模型可用于评估抗癌治疗药物。

摘要

一种模拟人类癌症的体内动物模型可能具有多种应用，能够提供重要的临床信息。目前用于构建体内癌症模型的技术存在诸多局限性。因此，本研究旨在应用细胞片技术来建立一种体内癌症模型。利用源自肝细胞癌（HCC）细胞系的细胞片，成功在裸鼠体内诱导出肝细胞癌。癌细胞片通过细胞间黏附及由细胞外基质调控的分层结构形成而产生。这使得HCC细胞片可被移植至肝脏，并在一个月内建立荷瘤动物模型。此外，本研究还探讨了间充质干细胞（MSC）在该癌症模型构建中的作用。除HCC细胞系细胞片外，还制备了另外两种细胞片：HCC细胞与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的复合细胞片，以及HCC细胞与脐带间充质干细胞（UCMSCs）的复合细胞片。含有HCC细胞与MSC的复合细胞片同样能够形成荷瘤动物模型。然而，加入MSC会减小所形成肿瘤的体积，且这种对肿瘤发育的抑制效应因MSC来源不同而有所差异。这表明，由特定MSC亚型构成的细胞片可能在肿瘤的管理和控制中具有应用潜力。

引言

肝细胞癌（HCC）是一种原发性肝癌，与预后不良显著相关。每年全球约有50万新诊断的HCC患者，占全球肝癌患者总数的85%¹. 肝癌的发生并非单一疾病形式，而是一组具有不同组织病理学特征、遗传和基因组异质性以及不同预后结局的疾病集合。¹因此，肝细胞癌（HCC）有效治疗策略开发面临的主要挑战在于对HCC生物学特性的了解仍然有限，以及 缺乏合适的实验动物模型来帮助理解这种复杂的疾病。 体内 用于模拟人类癌症的动物模型对于筛选候选基因、鉴定与癌症发生相关的预后/预测标志物，以及研究可能影响癌症对治疗药物反应的各种因素至关重要。

体外 癌症研究仍存在诸多主要局限性，这主要是因为癌细胞会失去其许多原有特性 体内 在培养过程中维持的特征。细胞发生的变化 体外 由于缺乏完整组织的生理环境而产生的结果 离体 微环境中的癌细胞间相互作用（基质细胞、免疫细胞、血管、上皮细胞） 等等。肿瘤微环境中的特征在很大程度上反映了癌细胞的特性²肿瘤微环境可能改变癌细胞的基因/蛋白表达和表型特征，以及血管生成能力和转移潜能。二维（2-D） 体外 培养系统还缺乏一种合适的组织基质，而这种基质对于调控肿瘤进展是必需的。因此，由于这....

方案

本方案遵循沙特国王大学伦理委员会的动物护理指南。在动物身上实施的手术操作、麻醉剂及其他药物使用均经沙特国王大学伦理委员会批准。所有实验工作均由经过适当培训的人员完成。

1. 细胞膜片构建

1. 用未稀释的胎牛血清（FBS）包被培养皿（3.5 cm 温度响应性培养皿），确保完全覆盖培养皿表面。
   注意：此步骤对细胞片的脱落至关重要，因为它有助于细胞以单层形式生长，并防止细胞聚集。
2. 将培养皿置于含5% CO₂和95%空气的湿润环境中，37 °C孵育24小时。
3. 从包被后的培养皿中去除多余的FBS，并在室温（RT）下干燥至少1小时。
4. 制备三种细胞悬液：1 × 10⁶个HepG2细胞、1 × 10⁶个HepG2细胞与BMMSCs的混合细胞、以及1 × 10⁶个HepG2细胞与UCMSCs的混合细胞（BMMSCs和UCMSCs均按4:1的比例混合）。
5. 将相应的细胞悬液接种至已标记的各个培养皿中。
6. 将所有细胞悬浮于添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。
7. 将细胞置于含5% CO₂和95%空气的湿润环境中，37 °C孵育。

2. 细胞膜片脱离

....

结果

细胞膜片移植在大鼠中的致瘤性：

移植后一个月，大鼠肝脏中所有移植的细胞片均形成了肿瘤（图3）。HepG2、HepG2/BMMSC 和 HepG2/UCMSC 细胞片所形成肿瘤的平均大小分别为 4.5 cm、4 cm 和 2.5 cm¹⁰。

肝脏组织的组织学分析：

未移植大鼠的苏木精-伊红（H&E）染色显示，肝细胞呈板状排列，相互吻合，细胞核呈圆形，含一个或两个明显的核仁。相比之下，所采集的肿瘤组织切片显示，存活的皮下肝细胞边缘伴有炎.......

讨论

大量研究致力于开发一种能够模拟人类癌症的充分的体内临床前动物模型。目前，构建癌症动物模型的主要方法包括基因工程和细胞移植¹¹。转基因动物模型是鉴定和验证靶基因以及理解药物诱导毒性的分子机制的良好工具。然而，该模型也存在一些局限性；例如，对特定基因的修饰并不总是产生预期的表型¹²。细胞移植方法更常用于在动物体内诱导癌症，该方法涉及注射癌细胞悬液。然而，这种简单便捷的方法也有其自身的缺点。为了制备细胞悬液，需通过酶消化步骤收获癌细胞，这会导致部分黏附蛋白的丢失，从而降低移植细胞的植入效率。因此，无法保证移植的癌细胞能够形成癌组织，更不用说控制所诱导肿瘤的大小。此外，该方法还存在另一个严重缺陷，即移植的癌细胞可能迅速进入血液循环，或在非靶器官中发生细胞植入¹³。

新型细胞膜片技术的开发旨在克服这些缺点。Suzuki 等¹⁴ 已成功利用癌细胞片移植方法构建了结肠、肝.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM高糖	Sigma	D5671-500ML
青霉素/链霉素	Life Technology	15070063
无菌生理盐水	Sigma	S0817-1GA
人HepG2细胞系	ATCC，美国	HB-8065
人类骨髓间充质干细胞系	美国 PromoCell	C-12974
人脐带组织间充质干细胞	PromoCell，美国	C-12971
氯胺酮 50%	Rompun，拜耳
2% 赛拉嗪	Rompun	23076-35-9
Alphadine® 溶液	利雅得制药	LBL0816
<强>一次性用品：
15 mL 聚丙烯高透明度离心管	Falcon	352097
3.5 cm 无菌 UpCell 培养皿（含滤纸膜）	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  移液器吸头	Sigma	CLS4868-1000EA
基本操作铺巾	赛默飞世尔科技	PMD5293.0
<强>仪器设备
加样枪，可调体积	Eppendorf® 研究®	Z683779-1EA
组织培养箱 37 °C，5% CO2	任何品牌
生物安全柜	任何品牌
组织培养箱 20 °C，5% CO2	任何品牌
无菌外科手术器械与裸鼠：
镊子
剪刀
手术刀
尼龙缝合线  5-0	Accutome	AB-3854S	单丝纤维，采血针
1 ml 结核菌素注射器	Fisher Scientific	14-826-88
裸鼠	查尔斯河