我们描述了一种改良的小规模提取方法及对线虫C. elegans中乳酸和丙酮酸进行比色测定的实验方案。使用商业试剂盒时，提高其检测灵敏度和准确性的技术开发至关重要。提取过程中的蛋白质沉淀是准确定量细胞内代谢物最关键的步骤。
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本文内容
摘要
摘要
乳酸和丙酮酸是细胞内能量代谢途径中的关键中间产物。监测细胞内的乳酸/丙酮酸比值有助于判断线粒体氧化磷酸化与有氧糖酵解之间的能量代谢是否存在与年龄相关的失衡。本文展示了在模式生物C. elegans中使用商业化的比色法检测试剂盒测定乳酸和丙酮酸的方法。近年来，试剂生产商通过研发显著提高了比色法/荧光法检测试剂盒的灵敏度和准确性。改进后的试剂使得在C. elegans中采用96孔板进行小规模检测成为可能。通常情况下，荧光法检测在灵敏度上优于比色法检测；然而，比色法更适用于普通实验室的常规使用。在这些定量检测中另一个重要问题是匀浆后的C. elegans样品中蛋白质的沉淀。在我们的蛋白质沉淀方法中，采用常见的沉淀剂（例如，三氯乙酸、高氯酸和偏磷酸）进行样品制备。通过在匀浆过程中直接加入冷沉淀剂（终浓度为5%），可制备出无蛋白的检测样品。
引言
乳酸和丙酮酸浓度被广泛视为能量代谢的中间产物，与需氧生物细胞中糖酵解、三羧酸（TCA）循环以及电子传递链的状态密切相关。糖酵解过程中的一系列反应将葡萄糖氧化为丙酮酸，而丙酮酸处于代谢通路的交叉点，可通过糖异生转化为碳水化合物，通过乙酰辅酶A转化为脂肪酸并参与能量代谢，也可转化为氨基酸丙氨酸。TCA循环在溶解氧充足条件下发生，是葡萄糖转化为能量的基础过程。尤其值得注意的是，次级代谢的改变是一种引人关注的现象，即在哺乳动物癌细胞中，糖酵解主要被用于能量生成，而涉及TCA循环和电子传递链的有氧线粒体呼吸则受到抑制1,2。我们近期研究表明，在模式生物Caenorhabditis elegans（C. elegans）中，乳酸水平及其相应的乳酸/丙酮酸（L/P）比值在衰老过程中下降。同样，我们发现C. elegans中哺乳动物肿瘤抑制因子p53的同源蛋白CEP-1通过激活其转录靶基因，在能量代谢的年龄相关性改变中发挥重要作用3。
在生物学检测中，例如细胞内乳酸和丙酮酸浓度的测定，比色法/荧光法检测试剂盒的灵敏度、准确性、样本用量和孵育时间已得到显著改进。得益于技术进步，我们现在无需大规模培养细胞即可分析多种代谢物及中间代谢产物 秀丽隐杆线虫，由于其体积微小，操作难度较大。通常情况下，比色法的灵敏度比荧光法低一个数量级；然而，比色法更适用于常规实验室条件。此外，包含匀浆和蛋白质沉淀的提取技术对于乳酸和丙酮酸浓度的准确定量测定至关重要 秀丽隐杆线虫 细胞，因为这种线虫被一种称为角质层的外骨骼包裹，而不像哺乳动物培养细胞系那样4,5. 本文介绍了一种使用市售比色法检测试剂盒分析乳酸和丙酮酸浓度的实验方案，包括从样品中提取待测物的操作建议 秀丽隐杆线虫.
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方案
1. C. elegans 的同步培养
- 接种前，进行培养 大肠杆菌 (E. coli在300 mL LB液体培养基中于37 °C过夜培养大肠杆菌OP50菌株。将培养好的OP50菌液于-4 °C保存。
- 制备LB肉汤液体培养基时，称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和1.5 mL 1 N NaOH，加入去离子水至1 L，混匀后高压灭菌。
注意：OP50 和 秀丽隐杆线虫 菌株可从秀丽隐杆线虫遗传学中心（美国明尼苏达州圣保罗市，明尼苏达大学）获取。
- 制备LB肉汤液体培养基时，称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和1.5 mL 1 N NaOH，加入去离子水至1 L，混匀后高压灭菌。
- 制备线虫生长培养基（NGM）琼脂，使用 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨、17 g 琼脂和 975 mL 去离子水。高压灭菌。冷却至 55 °C 后，按顺序无菌加入 1 mL 1 M MgSO₄4，1 mL 1 M CaCl₂2，1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，以及 25 mL 1 M pH 6.0 磷酸钾缓冲液，置于 90 mm 培养皿中。
- 对于1 M、pH 6.0的磷酸钾溶液，使用108.3 g KH₂PO₄2PO4 和 46.6 g 的 K2HPO4，加去离子水至 1 L，高压灭菌6.
- 在NGM琼脂平板上涂布1-2 mL培养的OP50。为形成一层薄薄的OP50菌膜，需将平板在室温下孵育过夜，之后再接种线虫。
注意：接种了OP50的NGM琼脂平板可在室温下保存2-3周。 - 在含有 OP50 的 NGM 琼脂平板上接种至少 100 条线虫，于 20 °C 培养至成虫阶段。至少需要三个平板。
- 收集卵子 在子宫内，将三条NGM琼脂平板上的怀卵雌雄同体线虫转移至含有5 mL S缓冲液的15 mL锥形管中，用15 mL S缓冲液通过300 × g离心洗涤线虫3次 g 室温下持续30秒。
- 配制S缓冲液：称取5.9 g NaCl和50 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0），用去离子水定容至1 L，高压灭菌。6.
- 将线虫溶解于碱性次氯酸盐中 用于无菌化和大量卵分离的溶液（0.5 mL 新鲜漂白剂或等效物：5–6% 次氯酸钠，0.1 mL 10 M NaOH，约 4.5 mL S 缓冲液）6，室温下颠倒混匀，静置10–15分钟。
注意：15 分钟内，成虫应完全溶解，留下由虫体中释放出的卵形成的浑浊溶液（应使用体视显微镜确认卵已释放）。除使用 0.1 mL 10 N NaOH 外，也可使用 0.2 mL 5 N NaOH。 - 次氯酸钠处理后，用15 mL S缓冲液将卵沉淀洗涤3次，并重悬于5–6 mL S缓冲液中。在20 °C下于S缓冲液中过夜孵育，以孵化释放的卵 E. coli 用于获得年龄同步的L1期幼虫培养物。
- 为确定L1期幼虫的大致数量，将幼虫重悬液至少吹打混匀3次后，取10 µL S缓冲液在体视显微镜下计数线虫，并计算平均值。随后将L1期幼虫转移至五块含OP50的NGM琼脂平板上（使用直径90 mm的培养皿，每板接种1,500–3,000条线虫），于20 °C培养至年轻成虫阶段，即自体受精开始并产下少量卵时（通常在3天后）。
2. 从 C. elegans 提取细胞组分
- 用 S 缓冲液从五个 NGM 琼脂平板上收集年轻成虫阶段（5 日龄）的线虫（图 1A）。
- 使用蔗糖漂浮法选择仅存活的线虫6：将悬浮于 3–4 mL S 缓冲液中的线虫与等体积的冰冻 60% (w/v) 蔗糖溶液加入 15 mL 圆锥形离心管中，使终浓度为 30% (w/v) 蔗糖。在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 15 秒，用巴斯德吸管将漂浮在上层的线虫转移至新离心管中，避免管壁残留。
- 用 S 缓冲液洗涤线虫 3 次，每次在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 30 秒。离心后使用 1,000 µL 微量移液器吸头检查洗涤后线虫的湿体积（图 1B）。
- 向洗涤后的线虫中加入等体积的冰冻 10% (w/v) 三氯乙酸（TCA；终浓度为 5%），用于蛋白质沉淀（图 1C）。除 TCA 外，也可使用高氯酸（PCA）或偏磷酸。
- 在冰上使用聚四氟乙烯匀浆器（Potter-Elvehjem 组织研磨器），以最高 1,300 rpm 转速旋转，用研杵进行 40 次上下研磨，使线虫与沉淀剂充分匀浆。
- 用巴斯德吸管将匀浆液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，在冰上使用超声波匀浆器进行超声处理，共 3 分钟（每次 1 分钟，重复 3 次），占空比为 20%。
- 在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟，澄清匀浆液。将上清液在冰上用 4 M KOH（每 10% TCA 体积加入 0.25 倍体积）中和 20 分钟，然后在 4 °C 条件下再次以 8,000 × g 离心 10 分钟。所得上清液（作为待测样品）可保存于 -80 °C，直至后续检测使用。
3. 使用比色法检测试剂盒检测乳酸
- 使用比色法检测试剂盒（材料表）测定待测样品中乳酸的浓度。对待测样品进行双孔检测。取5或10 µL待测样品加入96孔板中，并用试剂盒提供的乳酸检测缓冲液将每孔体积调整至50 µL。
- 对于乳酸标准曲线，用乳酸检测缓冲液将100 mM L(+)-乳酸标准品稀释至1 mM。分别取0、2、4、6、8和10 µL的1 mM L(+)-乳酸标准品（试剂盒提供）加入一系列孔中。
- 向每个孔中加入50 µL反应混合液（包含46:2:2的乳酸检测缓冲液、乳酸酶混合液和溶于无水DMSO中的乳酸探针；所有试剂均由试剂盒提供）或背景对照混合液（包含48:2的乳酸检测缓冲液和乳酸探针），在避光条件下于室温孵育30–60分钟。
- 使用酶标仪在570 nm处测定各孔的吸光度，并从反应混合液的吸光度中减去背景对照混合液的吸光度。
- 绘制乳酸标准曲线。根据乳酸标准曲线计算待测样品的乳酸浓度。
4. 使用比色法检测试剂盒检测丙酮酸
- 使用比色法检测试剂盒（材料表）测定上清液（待测样品）中丙酮酸的浓度。对待测样品进行双孔重复检测。取10 µL待测样品和90 µL工作试剂（按94:1比例混合试剂盒提供的酶混合液和染料试剂）加入96孔板中，避光条件下室温孵育30分钟。
- 使用酶标仪在570 nm波长下测定各孔的吸光度。
- 绘制丙酮酸标准曲线。根据丙酮酸标准曲线计算待测样品中丙酮酸的浓度。
5. 使用蛋白质含量进行归一化的蛋白质测定
- 使用比色法检测试剂盒（材料表）测定上清液（测试样品）中的蛋白质浓度。但此步骤不仅限于使用检测试剂盒，也可采用其他方法测定蛋白质浓度。
- 根据各样品的总蛋白浓度，对乳酸和丙酮酸浓度值进行归一化处理。
注意：即使在蛋白质沉淀后，测试样品中的蛋白质浓度仍可被充分检测，因此可用于样品间的归一化步骤。
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结果
使用比色法测定乳酸和丙酮酸浓度的定量分析，我们证明了这些测定方法相较于以往报道的准确性 秀丽隐杆线虫7,8在此过程中，样品提取时的蛋白质沉淀步骤是获得准确数值最关键的环节。对于蛋白质沉淀，常用的沉淀剂（例如.，三氯乙酸（TCA）、高氯酸（PCA）或偏磷酸）可用于制备测试样品（图1）。在 秀丽隐杆线虫，然而，在匀浆蠕虫时必须进行蛋白质沉淀（表1）。除了准确性之外，这些检测方法还具有足够的灵敏度，可测定小规模样品中的乳酸和丙酮酸浓度，并能在较短时间内检测到目标物（两种检测方法的反应孵育时间至少为30分钟）（图 2-3）。实际上，我们已在近期的一份报告中展示了这些数据3因此，我...
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讨论
在使用这些比色法检测试剂盒时，为了准确检测C. elegans中的细胞乳酸和丙酮酸，样品提取过程中最关键的步骤是在匀浆阶段进行蛋白质沉淀（图1）。使用聚四氟乙烯（Teflon）匀浆器并非绝对必要，其他类型的匀浆器（例如，Dounce 匀浆器、锥形组织研磨器或珠磨机）也适用于小规模的线虫提取。我们发现，若在蛋白质沉淀之前使用匀浆器提取样品，则无法在测试样品中检测到细胞内的乳酸和丙酮酸。此外，与采用蛋白质沉淀法相比，使用超速离心分离胞质组分时，乳酸和丙酮酸的含量均显著下降（表1）。这些结果表明，在利用线虫C. elegans开展生化方法研究时，样品提取过程对于细胞代谢物的检测至关重要。在蛋白质沉淀过程中，不仅三氯乙酸（TCA）可用，其他多种沉淀剂（如高氯酸 PCA 或偏磷酸）也可用于生化分析7,9。根据先前的一项报道，在酶法测定血液中乳酸和丙酮酸时，使用 TCA 会导致约 12%...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了大东文化大学向Sumino Yanase提供的特别研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乳酸比色/荧光检测试剂盒 | BioVision | #K607-100 | 比色/荧光法 100次检测；-20°C保存 |
| EnzyChrom 丙酮酸 检测试剂盒 | BioAssay Systems | #EPYR-100 | 比色/荧光法 100次检测；-20°C保存 |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | #23225 | 比色法检测； 室温保存 |
| 三氯乙酸 | Wako Pure Chemical | #207-04955 | 室温保存 |
| 聚四氟乙烯（Teflon）匀浆器 | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | 除Iwaki/Pyrex外， Wheaton亦可提供 |
参考文献
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重印与许可
