小规模比色法检测线虫 Caenorhabditis elegans 细胞内乳酸和丙酮酸

摘要

我们描述了一种改良的小规模提取方法及对线虫C. elegans中乳酸和丙酮酸进行比色测定的实验方案。使用商业试剂盒时，提高其检测灵敏度和准确性的技术开发至关重要。提取过程中的蛋白质沉淀是准确定量细胞内代谢物最关键的步骤。

摘要

乳酸和丙酮酸是细胞内能量代谢途径中的关键中间产物。监测细胞内的乳酸/丙酮酸比值有助于判断线粒体氧化磷酸化与有氧糖酵解之间的能量代谢是否存在与年龄相关的失衡。本文展示了在模式生物C. elegans中使用商业化的比色法检测试剂盒测定乳酸和丙酮酸的方法。近年来，试剂生产商通过研发显著提高了比色法/荧光法检测试剂盒的灵敏度和准确性。改进后的试剂使得在C. elegans中采用96孔板进行小规模检测成为可能。通常情况下，荧光法检测在灵敏度上优于比色法检测；然而，比色法更适用于普通实验室的常规使用。在这些定量检测中另一个重要问题是匀浆后的C. elegans样品中蛋白质的沉淀。在我们的蛋白质沉淀方法中，采用常见的沉淀剂（例如，三氯乙酸、高氯酸和偏磷酸）进行样品制备。通过在匀浆过程中直接加入冷沉淀剂（终浓度为5%），可制备出无蛋白的检测样品。

引言

乳酸和丙酮酸浓度被广泛视为能量代谢的中间产物，与需氧生物细胞中糖酵解、三羧酸（TCA）循环以及电子传递链的状态密切相关。糖酵解过程中的一系列反应将葡萄糖氧化为丙酮酸，而丙酮酸处于代谢通路的交叉点，可通过糖异生转化为碳水化合物，通过乙酰辅酶A转化为脂肪酸并参与能量代谢，也可转化为氨基酸丙氨酸。TCA循环在溶解氧充足条件下发生，是葡萄糖转化为能量的基础过程。尤其值得注意的是，次级代谢的改变是一种引人关注的现象，即在哺乳动物癌细胞中，糖酵解主要被用于能量生成，而涉及TCA循环和电子传递链的有氧线粒体呼吸则受到抑制^1,2。我们近期研究表明，在模式生物Caenorhabditis elegans（C. elegans）中，乳酸水平及其相应的乳酸/丙酮酸（L/P）比值在衰老过程中下降。同样，我们发现C. elegans中哺乳动物肿瘤抑制因子p53的同源蛋白CEP-1通过激活其转录靶基因，在能量代谢的年龄相关性改变中发挥重要作用³。

在生物学检测中，例如细胞内乳酸和丙酮酸浓度的测定，比色法/荧光法检测试剂盒的灵敏度、准确性、样本用量和孵育时间已得到显著改进。得益于技术进步，我们现在无需大规模培养细胞即可分析多种代谢物及中间代谢产物 秀丽隐杆线虫，由于其体积....

方案

1. C. elegans 的同步培养

1. 接种前，进行培养 大肠杆菌 (E. coli在300 mL LB液体培养基中于37 °C过夜培养大肠杆菌OP50菌株。将培养好的OP50菌液于-4 °C保存。
   1. 制备LB肉汤液体培养基时，称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和1.5 mL 1 N NaOH，加入去离子水至1 L，混匀后高压灭菌。
      注意：OP50 和 秀丽隐杆线虫 菌株可从秀丽隐杆线虫遗传学中心（美国明尼苏达州圣保罗市，明尼苏达大学）获取。
2. 制备线虫生长培养基（NGM）琼脂，使用 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨、17 g 琼脂和 975 mL 去离子水。高压灭菌。冷却至 55 °C 后，按顺序无菌加入 1 mL 1 M MgSO₄₄，1 mL 1 M CaCl₂₂，1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，以及 25 mL 1 M pH 6.0 磷酸钾缓冲液，置于 90 mm 培养皿中。
   1. 对于1 M、pH 6.0的磷酸钾溶液，使用108.3 g KH₂PO₄₂PO₄ 和 46.6 g 的 K₂HPO₄，加去离子水至 1 L，高压灭菌^....

结果

使用比色法测定乳酸和丙酮酸浓度的定量分析，我们证明了这些测定方法相较于以往报道的准确性 秀丽隐杆线虫^7,8在此过程中，样品提取时的蛋白质沉淀步骤是获得准确数值最关键的环节。对于蛋白质沉淀，常用的沉淀剂（例如.，三氯乙酸（TCA）、高氯酸（PCA）或偏磷酸）可用于制备测试样品（图1）。在 秀丽隐杆线虫，然而，在匀浆蠕虫时必须进行蛋白质沉淀（表1）。除了准确性之外，这些检测方法还具有足够的灵敏度，可测定小规模样品中的乳酸和丙酮酸浓度，并能在较短时间内检测到目标物（两种检测方法的反应孵育时间至少为30分钟）（图 2-3）。实际上，我们已在近期的一份报告中展示了这些数据³因此，我.......

讨论

在使用这些比色法检测试剂盒时，为了准确检测C. elegans中的细胞乳酸和丙酮酸，样品提取过程中最关键的步骤是在匀浆阶段进行蛋白质沉淀（图1）。使用聚四氟乙烯（Teflon）匀浆器并非绝对必要，其他类型的匀浆器（例如，Dounce 匀浆器、锥形组织研磨器或珠磨机）也适用于小规模的线虫提取。我们发现，若在蛋白质沉淀之前使用匀浆器提取样品，则无法在测试样品中检测到细胞内的乳酸和丙酮酸。此外，与采用蛋白质沉淀法相比，使用超速离心分离胞质组分时，乳酸和丙酮酸的含量均显著下降（表1）。这些结果表明，在利用线虫C. elegans开展生化方法研究时，样品提取过程对于细胞代谢物的检测至关重要。在蛋白质沉淀过程中，不仅三氯乙酸（TCA）可用，其他多种沉淀剂（如高氯酸 PCA 或偏磷酸）也可用于生化分析^7,9。根据先前的一项报道，在酶法测定血液中乳酸和丙酮酸时，使用 TCA 会导致约 12%.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乳酸比色/荧光检测试剂盒	BioVision	#K607-100	比色/荧光法 100次检测；-20°C保存
EnzyChrom 丙酮酸 检测试剂盒	BioAssay Systems	#EPYR-100	比色/荧光法 100次检测；-20°C保存
BCA蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	#23225	比色法检测；  室温保存
三氯乙酸	Wako Pure Chemical	#207-04955	室温保存
聚四氟乙烯（Teflon）匀浆器	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	除Iwaki/Pyrex外， Wheaton亦可提供