高通量、微量化分析玉米（Zea mays L.）加工参数与营养品质的实验方案

摘要

本文介绍了一种用于处理谷物样品的微量化实验方案，并将该微量化方法整合到高通量分析流程中。该方案是对目前已有实验方法的高通量改进版本。

摘要

玉米是美国及全球重要的粮食作物。然而，玉米籽粒在供人类食用前必须经过加工处理。此外，不同玉米杂交种的全谷物成分和加工特性存在差异，这些差异会影响最终加工产品的品质。因此，为了从玉米中生产出更健康的加工食品，有必要了解如何针对特定种质资源优化加工参数，以应对籽粒成分和加工特性上的差异。这包括更深入地理解现有加工技术对最终加工食品营养品质的影响。本文介绍了一种微型化实验方案，可模拟由大颗粒膨化玉米糁制备玉米片的加工流程，并允许同时处理多个谷物样品。该方案中的膨化玉米糁、中间加工产物或最终加工产品，以及玉米籽粒本身，均可作为高通量分析流程的一部分进行营养成分分析。该方法专为整合到玉米育种研究项目中而设计，也可根据需要修改用于其他谷类作物。我们以玉米中不溶性结合型阿魏酸和对香豆酸含量的分析为例，分别在五个不同的加工阶段取样。结果表明，在微型化加工过程中可在多个阶段进行取样，该加工技术可用于特定的玉米育种研究项目，并且在本示例中，大部分营养成分在食品加工过程中流失。

引言

玉米（Zea mays L.）是美国种植最广泛的谷类作物¹。2016年，有711.2亿公斤（28亿蒲式耳）玉米被用于人类消费²，表明玉米在美国饮食中具有重要地位。玉米籽粒的一大优势在于其价格相对低廉，同时含有酚类物质、不饱和脂肪酸和蛋白质等有益的植物化学成分³。因此，以玉米为基础的食品可能是人类获取有益植物化学成分的相对廉价来源。

然而，玉米在供人类食用前必须经过加工。因此，加工过程通常会影响最终加工食品的营养价值⁴。例如，在零食和即食早餐谷物（即冷食谷物）的生产过程中，玉米籽粒会经过干法研磨，制成较大的片状粗粒。在干法研磨过程中，麸皮和胚芽被物理去除，仅保留胚乳部分。由于许多植物化学物质主要存在于麸皮或胚芽中（例如，分别为酚类化合物和不饱和脂肪酸），这可能导致加工食品的营养价值显著降低⁴。相反，后续的加工步骤可能提升其营养价值。例如，许多食品加工技术包括烹煮、烘焙或烘烤。在这些阶段中所经历的热应力可能提高有益植物化学物质的生物可利用度⁵。

从食品科学和人类营养学的角度来看，了解加工不仅如何影响加工食品的营养价值，而且还可以预见加工参数的调整如何影响其他感官品质（包括颜色、质地和味道），将具有重要意义。若有一种能够在整个加工过程中监测这些品质的实验方案，则可用于筛选玉米品种，以改善最终加工的玉米食品。过去分析此类特性的主要障碍之一是现有实验方法的规模和通量。例如，在为实验室分析制备早餐谷物时，Fast 和 Caldwell⁶建议使用45.4 kg的大片玉米粗粉。这一数量远远超过植物育种项目中典型小面积田间试验所能获得的大片玉米粗粉或大片玉米粗粉材料⁷的产量。因此，开发一种用于生产加工食品的微型实验室实验方案，将能够（1）帮助育种人员改良玉米品种，以提升对食品加工商具有重要意义的营养和感官性状；（2）使加工商能够高效地设计和测试替代性加工策略。

在本文中，我们描述了一种高通量改良的微尺度加工方案，该方案基于Kandohla⁸所述的方法，用于从大颗粒玉米糁制备烘烤型玉米片。我们展示了一个示例实验的结果，该实验采用此加工方案研究了玉米中不溶性结合态阿魏酸和对香豆酸的变化。在该特定研究中，我们的目标是确定：（1）玉米中酚酸含量在即食早餐谷物生产过程中的变化情况；（2）这些变化发生在哪些加工阶段；（3）我们的实验杂交种中是否存在对加工胁迫响应不同的类型。该方案可与高通量分析化学方法联用，以高效分析营养性状。此外，该方案也可调整用于模拟其他加工玉米食品或其他谷物加工食品的生产过程。

方案

1. 制作煮熟的粗玉米粉

1. 将一个15 L的罐头压力锅放在电热炉上。
2. 向罐头压力锅中加入1 L自来水，并加热至100 °C。
3. 在加热水的同时，将100 g工业压片粗粒或压片粗粒材料（水分含量12%，湿基）⁷放入一个1夸脱的罐头瓶中。
   注意：本研究的代表性结果基于Macke et al.⁹采用Rausch et al.⁷所述实验室规模干法研磨方案制备的压片粗粒材料。
4. 加入糖盐溶液，该溶液由200 mL蒸馏水、2 g盐、6 g白砂糖和2 g液体麦芽提取物组成。
   注意：可同时分析多个样品，但具体样品数量取决于罐头压力锅的尺寸。
5. 使用玻璃搅拌棒将溶液与压片粗粒材料混合均匀。
6. 当罐头压力锅中的水开始沸腾后，加入1 L自来水以降低压力锅内水温。
7. 将罐头瓶放入罐头压力锅中，确保各瓶之间以及瓶与压力锅壁之间的距离相等。

图1：罐头瓶在高压罐头锅中的摆放方式。 为确保受热均匀并防止罐头瓶损坏，罐头瓶应彼此之间以及与高压罐头锅壁保持等距。 请点击此处查看此图的放大版本。

8. 让水达到剧烈沸腾状态。盖上罐式高压锅的盖子。
9. 在15 psi压力下蒸煮大颗粒膨化粗玉米粉或膨化粗玉米粉材料1小时。待罐式高压锅完全冷却并卸压后，方可打开。
10. 使用耐热手套打开罐压锅的盖子。
11. 使用镊子将罐头瓶从高压灭菌锅中取出，放置在耐热表面上。
    注意：此时得到的中间产物为煮熟的粗玉米粉。
12. 若使用根据 Rausch 所述方案制备的破碎磨料材料 等⁷, 用刮刀在烹饪后去除非胚乳部分。若使用工业压片粗粒，则跳过此步骤。

图2：去除非胚乳物质。（a）煮制后尚未去除上浮的非胚乳物质的粗粒样品。（b）去除上浮的非胚乳物质后的粗粒样品。请点击此处查看该图的放大版本。

13. 将每份处理样品的30 g熟玉米粉放入称量舟中，于65 °C烘箱中干燥12 h。干燥后，使用咖啡研磨机将熟玉米粉样品研磨成细粉，并储存在阴凉干燥处，用于酚类物质分析。

2. 制作烘烤粗玉米粉

1. 将剩余的煮熟的玉米糊放在铺有铝箔的烤盘上。
   1. 为提高通量，可同时烘烤两个样品。为此，在烤盘上制作两个铝箔船。这样可避免样品之间发生交叉污染。

图3：煮熟的粗玉米粉在烤盘上的放置方式。 两种不同的煮熟粗玉米粉样品被分别置于烤盘上的独立铝箔船形托盘中，准备进行烘烤。图中托盘使用绿色胶带标记。该方法在提高实验通量的同时，也确保了不会发生交叉污染。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 将盛有两份样品的烤盘放入已预热至 107.2 °C (225°F) 的对流烘箱中，加热 50 分钟。
   1. 烘烤 25 分钟后搅拌样品，以确保受热均匀。
3. 烘烤 50 分钟结束后，取出盛有前两份样品的烤盘，于室温下冷却 30 分钟。
4. 冷却结束后，从烘烤后的谷粒中间产物中取 30 g 样品，放入称量舟中，置于 65 °C 的烘箱内干燥 12 小时。干燥后，使用咖啡研磨机将烘烤谷粒样品研磨成细粉，用于植物化学成分分析。

3. 制备最终的烘烤玉米片产品

1. 将烤制好的粗粒玉米粉通过压饼机压平。
   1. 将铺有锡箔纸的烤盘中剩余的烤制粗粒玉米粉取出，放置在一张长约1米的烘焙纸上。
      注意：为了提高处理通量，可将烘焙纸沿长度方向对折成一个袋状 pouch。这样可最大限度减少后续压平过程中样品的损失。
   2. 将装在袋状烘焙纸中的烤制粗粒玉米粉样品缓慢送入压饼机中。操作时需小心，避免手指被压饼机夹伤。

图 4：烘焙纸小袋。 （a）将烘焙纸沿长度方向对折。（b）将小袋的长边开口侧折叠覆盖。（c）以 10° 角度再次将长边折叠覆盖。（d）将小袋的短边开口侧折叠覆盖。此侧将作为穿过玉米饼压模时的进料侧。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 将卷好的烤粗粒玉米粉切成 2.5 cm × 2.5 cm（1 in²）的方块。可使用披萨轮刀等工具，透过烘焙纸对卷好的面团进行切割或划痕。

图5. 将擀好的面团切割成片状。 通过羊皮纸在擀好的面团上划痕进行切割。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 打开烘焙纸，将卷好、切好并烘烤过的粗粮片在室温下干燥12小时。
   1. 为提高通量，可将干燥后的样品置于铝箔覆盖的称量舟中，在室温下保存，直至多个样品（通常为24个或更多）准备进行烘烤。
4. 将对流烤箱预热至204.4 °C（400 °F）。将未烘烤的干燥薄片样品平铺于烤盘上，尽量使样品不重叠，以确保烘烤均匀。
5. 将样品放入烤箱烘烤60–90秒，直至达到适当颜色（见图6）。

图6：玉米片烘烤完成后的正确颜色。 图片左侧的玉米片烘烤时间适当，右侧的玉米片烘烤时间过长。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 将样品在室温下冷却约 5 分钟。即可得到最终的烤制玉米片。
7. 使用咖啡研磨机将烤制后的玉米片样品研磨成细粉。

4. 植物化学与统计学分析

注意：根据研究者所关注的特定植物化学成分及实验室可用设备，这些分析方案可能会有所调整。

1. 采用 Butts-Wilmsmeyer et al.³ 中所述的类似方案测定植物化学成分含量。遵循方案中提供的所有安全操作规程。
2. 使用适当的统计模型分析数据。
   注意：本示例数据采用随机区组设计中的裂区试验模型进行分析，其中主区单位为收获谷物的田间小区，副区单位为加工阶段。分析在 SAS（版本 9.3）的 PROC MIXED 中进行，图表在 R 中生成。

结果

本方案实现了对一种加工玉米食品——玉米片的取样与营养分析，分析过程从大片的压片粗粒开始，贯穿加工的各个中间阶段，直至最终产品。本方案与 Rausch et al.⁷ 所述方案结合，用于从杂交谷物样品制备压片粗粒组分。因此，本文提供了在整粒谷物、大片压片粗粒、蒸煮粗粒、烘烤粗粒及烘烤玉米片等不同加工阶段分析杂交样品营养成分的信息。无论评估的杂交品种如何，在干法研磨过程中，大部分不溶性结合态阿魏酸和对香豆酸均被去除（图7）。在蒸煮过程中，不溶性结合态阿魏酸和对香豆酸含量进一步下降。蒸煮过程中观察到的不溶性结合态阿魏酸和对香豆酸含量的减少，可能是由于去除了残留在大片压片粗粒中少量的非胚乳成分所致。多自由度对比分析表明，无论杂交品种如何，在后续加工过程中，阿魏酸和对香豆酸的含量均保持稳定（Table 1）。

此外，杂交品种在不溶性结合阿魏酸含量和对香豆酸含量方面的初始排序，并不能反映其在最终加工阶段的排序情况（表2 和 图8）。换句话说，整个籽粒的初始含量并不能指示哪个杂交种在加工结束时会具有最多的不溶性结合阿魏酸或对香豆酸。因此，为了研究加工食品营养特性背后的遗传特征，必须采用微尺度加工方法来研究玉米籽粒。

图7：加工过程中不溶性结合态酚酸含量的变化。（a）加工过程中不溶性结合态阿魏酸含量的变化。（b）加工过程中不溶性结合态对香豆酸含量的变化。WK：完整籽粒，FG：压片粗粒，CG：熟化粗粒，BG：烘焙粗粒，TO：烘烤玉米片。不同颜色的点代表不同的杂交种。该图最初发表于 Butts-Wilmsmeyer et al.⁴ 的补充信息中。请点击此处查看此图的放大版本。

图 8：杂交品种与加工阶段交互作用图。 （a）不溶性结合态阿魏酸含量的交互作用图。（b）不溶性结合态对香豆酸含量的交互作用图。交叉的线条表明存在排序变化的交互作用，意味着无法根据全籽粒中任一这些植物化学物质的初始含量，预测最终烘烤玉米片中不溶性结合态阿魏酸或不溶性结合态对香豆酸的含量。WK：全籽粒，FG：压片粗粉，TO：烘烤玉米片。该图最初发表于 Butts-Wilmsmeyer et al.⁴ 的补充信息中请点击此处查看此图的放大版本。

	阿魏酸		对香豆酸
杂交组合	F-值	p-值	F-值	p-值
B73xMO17	0.07	0.93	0.34	0.72
B73xPHG47	0.02	0.98	0.61	0.55
LH1xMO17	0.08	0.93	0.14	0.87
PHJ40xLH123HT	0.32	0.73	0.74	0.48
PH207xPHG47	0.15	0.86	0.24	0.79
PHJ40xMO17	0.01	0.99	0.31	0.74
PHG39xPHZ51	0.06	0.94	0.07	0.93

表1：检验煮制粗粉、烘焙粗粉和烤制玉米片中不溶性结合酚酸含量差异的多自由度对比。

	阿魏酸		对香豆酸
	F 值	p 值	F 值	p 值
杂交种	7.15	0.001	8.7	<0.001
自交系	4.07	0.007	6.57	<0.001
注：所有年份×基因型×加工阶段的交互作用在 α = 0.05 水平上均无显著性。

表2：基因型与加工阶段交互作用的显著性。

实验步骤	关键信息	故障排除	高通量建议
1.2 和 1.6	将这两个步骤结合，可在不破坏罐头瓶的情况下加热水。	NA	在加入罐头瓶之前先加热一半的水，可提高通量。
1.4	NA	NA	预先称量好所需试剂。给定的量为一个罐头瓶的用量，因此将步骤 1.4.2 中所用罐头瓶数量乘以每份所需试剂的体积或质量。将最终混合物均等地分装至各个罐头瓶中。
1.4 注释	切勿让罐头瓶接触罐头高压锅的边缘或其他罐头瓶。否则罐头瓶会破裂，导致样品丢失。	NA	NA
1.9 和 1.10	在开始烹饪前，水应达到持续沸腾状态。	若一小时后玉米粉仍未完全煮熟，则需检查压力阀是否已设置为 15 psi，并确认在盖上罐头高压锅盖子并启动计时器前，水已达到完全沸腾状态。	NA
1.13	去除在烹饪过程中浮至表面的非胚乳物质。若不将其去除，会影响样品的植物化学成分分析结果。	若在烹饪过程中非胚乳物质未上浮，则说明玉米粉未充分煮熟。请参考步骤 1.9 和 1.10 的相关信息。	NA
1.15、2.4 和 3.7	将样品研磨成细粉。	若植物化学分析结果不理想，请确保样品已被研磨成细粉，以增大溶剂可接触的表面积。	NA
2.1	切勿让样品相互接触，否则会导致交叉污染。	NA	可通过在烤盘上为每个样品分别制作铝箔小船，实现同时烘烤两个样品。
2.2.1	在烘烤 25 分钟后搅拌样品，以确保受热均匀。	若样品烘烤不均匀，应缩短搅拌间隔时间（例如每 15 分钟一次）。	NA
3.1	将烘烤后的玉米粉面团放入羊皮纸袋中。这可防止在压片过程中样品丢失。	若样品开始从羊皮纸袋末端溢出，请使用更长的袋子。我们发现 1 米长度通常足够。	NA
3.2	保持羊皮纸袋封闭状态。	若切割工具割穿了羊皮纸，请改用较钝的工具。	我们发现披萨轮刀是将烘烤后的玉米粉切割成方块的最佳工具。使用该工具不会割穿羊皮纸，同时仍能快速将烘烤后的玉米粉切割成方块。
3.5	熟练掌握烘烤颜色，避免烘烤时间过长。	若样品颜色过深，应减少烘烤时间。	将多个干燥的烘烤玉米粉样品分别存放在铝箔覆盖的称量舟中，待多个样品均准备好后再统一进行烘烤。

表3： 关键步骤、故障排除步骤及建议汇总表。

讨论

玉米基食品在加工过程中营养成分的变化可能与籽粒组分的去除以及热应力有关^5,10。然而，在本实验方案建立之前，加工过程对各类营养素的具体影响尚未得到较为深入的研究^4,8。此外，由于大多数实验室加工流程的规模较大，通常难以研究玉米籽粒感官特性与营养特性的遗传基础⁸。本文中，我们介绍一种微量化实验室方法，可用于研究玉米在食品加工全过程中的营养与感官性状。

本方案允许在碾磨成粗粉阶段、煮制后、烘烤后以及碾压过程中经受剪切力后进行取样。因此，结合对收获玉米籽粒的分析，该方案有助于分析初始底物、最终食品以及加工过程中的中间阶段，以阐明与营养相关的成分变化。该方案的这一关键特性使得营养和感官特性能够在整个加工过程中得到分析，同时也使研究者能够选择适用于特定分析的分析化学方案。本方案的另一个关键特性是其微量化操作的高效性。首先，该方案使用少量样品，适用于植物育种环境（表3）。1 kg籽粒通常可产生约0.3 kg的大颗粒碾磨组分，而加工仅需其中约三分之一的粗粉组分。其次，该方案每天可在实验室中处理约16个样品，相较于此前需要大量样品的方案⁶，效率显著提高。

该方案可轻松修改以模拟其他加工玉米食品的生产过程。例如，大片玉米粗粉除用于即食早餐谷物外，还用于多种零食食品的生产⁹。这些零食食品的实验室制备方案可能需要调整烹煮时间或烹煮液，或调整烘焙时间。此外，本方案经适当调整后，也可能用于研究其他谷物及其相应的加工产品。加工谷物制品通常包含烹煮、烘焙或烘烤等加工步骤，这些步骤均可通过本方案的改进版本进行模拟。

本方案的一个重要局限性在于其可暂停的步骤极少，i.e. 一旦开始某一处理步骤，该步骤及其后续所有步骤必须连续完成（Table 3）。唯一的暂停点出现在由片状粗粒小麦粉制得熟化粗粒小麦粉之后。如有必要，可将熟化粗粒小麦粉置于密封容器（e.g. 密封的罐头瓶）中，冷藏保存最多两天。然而，若将熟化粗粒小麦粉储存更长时间，则样品性质似乎会发生改变。此外，一旦开始烘烤，直至烘烤后的粗粒小麦粉面团完成压片、切割和干燥之前，均无任何可暂停的步骤。

结论

通过这些示例结果（更多信息参见 Butts-Wilmsmeyer 等⁴），我们证明了可在加工过程中监测营养成分的变化。此外，还确定了发生关键营养变化的加工阶段。同时，该加工方案所需样品量较小，使得在植物育种项目的背景下能够对多个杂交品系进行研究。利用这些杂交品系，我们确定了在加工全过程里能够保持最高浓度的不溶性结合阿魏酸和对香豆酸的杂交组合。这些性状是最终烘烤玉米片益生元潜力的重要指标^11,12,13。这些结果可直接用于协助植物育种者建立育种群体，以提升加工玉米产品的益生元潜力。

该加工方案的主要优势之一在于，它不会限制可进行的营养分析。如果存在用于分析谷物的植物化学成分检测方案，则同样可用于研究加工后的产品。此外，由于该加工方案能够独立开展实验室规模的食品加工与营养分析，因此可同时研究多种植物化学成分。然而，由于实验室规模加工方案所产生的中间产物和最终产物量较少，用于植物化学成分含量分析的检测方案应采用较小的样品量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
罐头压力锅	Wisconsin Aluminum Foundry Co.	Model 921	可使用任意型号，但应足够大以容纳多个罐头瓶
单头炉或大型电热板	Waring Professional	Model SB30	可使用任意型号，但应足够大，以便将罐头压力锅稳固地放置在炉头或电热板上
1夸脱宽口罐头瓶	Ball	1440096258	可使用任意品牌，但应为宽口的1夸脱规格罐头瓶
1 L 烧杯	Fisher Scientific	09-841-104
磁力搅拌器	Corning	6796420D
磁力搅拌子	Fisher Scientific	14-513-67
1 L 量筒	Kimble	20027500
刮刀	Wal-Mart	552145280
防烫手套	Wal-Mart	556501140
天平	Any	NA	Mettler Toledo Model MS105DU 或类似型号
称量舟	Fisher Scientific	08-732-113
糖	Wal-Mart	9259244
食盐	Morton（购于 Wal-Mart）	9244849
液体麦芽提取物	By the Cup（购于 Amazon）	NA	https://www.amazon.com/Barley-Malt-Extract-Syrup-Bottle/dp/B01N4SK72C
标签胶带	Fisher Scientific	15966
永久性记号笔	Wal-Mart	55529894
对流烘箱	Wal-Mart	1598495
烤盘（通常随烘箱附带）	Wal-Mart	1598495
烹饪用铝箔	Wal-Mart	564264789
玉米饼压模机	E&A Hotel & Restaurant Equipment and Supplies	CTM-2000
烘焙纸	Reynolds（购于 Wal-Mart）	551219672
披萨切割器	Farberware（购于 Wal-Mart）	553012200
冷却架	Flytt（购于 Amazon）	NA	https://www.amazon.com/dp/B075HQY627/ref=sspa_dk_detail_7?psc=1&pd_rd_i=B075HQY627&pd_rd_wg=WaJol&pd_rd_r=SF07KCHMP753WAPG6ED4&pd_rd_w=2BOwf
SAS Version 9.4	SAS Institute	Version 9.4
R	R Foundation for Statistical Computing	Version 3.4.0